微波輻射對大鼠能量代謝及心肌細胞凋亡的影響*

朱文赫， 沈 楠， 徐俊杰， 鐘秀宏， 呂士杰

(吉林醫(yī)藥學院生物化學教研室，吉林 吉林 132013)

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微波輻射對大鼠能量代謝及心肌細胞凋亡的影響*

朱文赫， 沈 楠， 徐俊杰， 鐘秀宏， 呂士杰△

(吉林醫(yī)藥學院生物化學教研室，吉林 吉林 132013)

目的： 探討不同強度微波輻射對大鼠心臟的損傷作用，并初步探討其作用機制。方法: 分別以強度為500、1 000、1 500和2 000 W/m2，頻率為2 450 MHz微波照射大鼠6 min，照射后6 h取大鼠心臟，檢測心肌細胞中ATP含量、線粒體呼吸鏈復合體Ⅳ和Ⅴ活性，透射電鏡觀察心臟組織超微結(jié)構(gòu)的改變，Muse細胞分析儀檢測心肌細胞凋亡，Western blotting檢測心肌細胞內(nèi)cleaved caspase-3蛋白的表達。結(jié)果: 隨著微波輻射強度的增加，大鼠心肌細胞中ATP含量、線粒體呼吸鏈復合體Ⅳ和Ⅴ活性呈現(xiàn)降低趨勢，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。透射電鏡結(jié)果顯示，微波輻射致細胞線粒體數(shù)量減少且形態(tài)異常，大部分線粒體溶解空化，基質(zhì)明顯腫脹。心肌細胞凋亡檢測結(jié)果顯示，微波輻射能夠誘導大鼠心肌細胞發(fā)生凋亡，且隨著微波輻射強度的增加，細胞凋亡率呈上升趨勢(P<0.05)。Western blotting結(jié)果顯示，微波輻射后心肌細胞內(nèi)cleaved caspase-3蛋白表達水平隨著輻射強度的增加呈上升趨勢(P<0.05)。結(jié)論: 微波輻射對大鼠心臟具有明顯的損傷作用，能夠引起心臟能量代謝出現(xiàn)異常，誘發(fā)心肌細胞發(fā)生凋亡。

微波輻射； 能量代謝； 細胞凋亡； 線粒體

隨著微波(頻率300 MHz～300 GHz)技術(shù)的發(fā)展，其在醫(yī)學科研、軍事國防及日常生活等領(lǐng)域得到了廣泛的應用。人類受微波輻射的機會越來越多，潛在的危害不容忽視[1-2]。研究表明，一定強度的微波輻射對人體健康的影響是客觀存在的[3]。長期微波輻射會使人容易產(chǎn)生疲倦，機體的免疫能力下降，出現(xiàn)代謝功能障礙及自由基水平失衡。

心血管系統(tǒng)是微波輻射較為敏感的靶器官之一，微波輻射能引起心肌細胞能量代謝紊亂，誘發(fā)細胞凋亡，引起心臟結(jié)構(gòu)和功能的異常[4]。心臟是循環(huán)系統(tǒng)的動力器官，其結(jié)構(gòu)和功能的異常，將影響機體全身各系統(tǒng)器官的血液供應。雖然報道顯示微波輻射對心肌細胞的損傷，具有一定的劑量效應關(guān)系，但其規(guī)律仍未闡明[5]。為此，我們研究微波輻射對大鼠心臟能量代謝及誘導心肌細胞凋亡作用，為今后研究開發(fā)心臟微波損傷檢測敏感的指標和開發(fā)具有防護作用的藥物提供理論基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

1 儀器及主要試劑

MY8C-1型微波功率源(南京匯研微波系統(tǒng)工程有限公司，頻率為2 450 MHz)；550酶標儀購于Bio-Rad；Muse細胞分析儀購于Millipore；線粒體呼吸鏈復合體Ⅳ和Ⅴ、三磷酸腺苷(ATP)試劑盒購于上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司；cleaved caspase-3和β-actin抗體購于Sigma；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1 動物及實驗分組 SPF級成年Wistar大鼠60只，雌雄各半，體重(200±20)g，由吉林大學白求恩醫(yī)學部動物實驗中心提供，動物合格證號為SCXK(吉)2008-0005。實驗分為正常對照組，500、1 000、1 500和2 000 W/m2輻射損傷組，每組12只。

2.2 實驗方法 大鼠置于自制有機玻璃盒內(nèi)，加蓋、有孔。大鼠在盒內(nèi)為固定體位，俯臥位。將實驗動物垂直放在微波輻射源下進行照射。輻射強度為500、1 000、1 500和2 000 W/m2，輻射時間為6 min。微波輻射時，環(huán)境溫度為20 ℃±0.5 ℃，相對濕度為40%。

2.3 指標檢測 微波輻射后6 h，用20%烏拉坦麻醉大鼠，迅速取大鼠心臟，冰浴條件下，洗去血液后用濾紙吸干并稱重，放入小燒杯中。用移液管量取體積總量相當于組織重量9倍的勻漿介質(zhì)置于小燒杯中，用眼科剪盡快剪碎組織，研磨制成10%組織勻漿，離心，棄沉淀，取上清液再離心，沉淀即為線粒體。按照各試劑盒操作方法，測定ATP及線粒體呼吸鏈復合體Ⅳ和Ⅴ活性。

2.4 心肌細胞凋亡檢測 取心肌組織剪碎，0.25%胰蛋白酶消化，400目尼龍網(wǎng)過濾收集，細胞孵育后收集各組心肌細胞懸液取心肌細胞約1×105個，1 000 r/min離心5 min，收集細胞，棄培養(yǎng)液，100 μL PBS重懸細胞，加入100 μL Muse細胞分析儀凋亡染料，Muse細胞分析儀檢測心肌細胞凋亡。

2.5 心肌組織超微結(jié)構(gòu)的改變 微波輻射后，取大鼠心臟心肌組織，經(jīng)2.5%的戊二醛和質(zhì)量分數(shù)為1%的鋨酸固定后，制作超薄切片，醋酸鈾和檸檬酸鉛雙重染色，T20型透射電鏡下觀察組織超微結(jié)構(gòu)。

2.6 Western blotting檢測蛋白的表達 微波輻射后，取大鼠心臟組織0.1 g，加入組織蛋白提取液，12 000 r/min離心10 min，收集上清。經(jīng)BCA法進行蛋白定量后，取等量樣品以12% SDS-PAGE分離蛋白。電泳后將蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h后，cleaved casepase-3抗體(1∶1 000)孵育過夜，再以辣根過氧化酶標記的II抗封閉液孵育1 h，ECL顯影，掃描記錄。

3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)進行顯著性檢驗，組間比較采用DUNNET-t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 微波輻射對大鼠ATP含量和線粒體呼吸鏈復合體Ⅳ和Ⅴ活性的影響

表1可見，微波輻射后，心肌細胞中ATP含量、線粒體呼吸鏈復合體Ⅳ和Ⅴ活性呈現(xiàn)降低趨勢，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。上述結(jié)果表明，微波輻射對大鼠心臟能量代謝具有明顯的影響。

2 微波輻射大鼠心肌細胞凋亡率的影響

對照組大鼠心肌細胞凋亡極少，心肌細胞早期凋亡率為(1.95±0.89)%，而微波輻射組大鼠心肌細胞早期凋亡率同對照組相比明顯上升，1 000 W/m2、1 500 W/m2和2 000 W/m2微波輻射組心肌細胞早期凋亡率分別為(9.67±1.02)%、(13.05±0.82)%、(15.95±0.56)%，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與此同時，隨著微波輻射強度的增加，晚期凋亡比率和死亡的心肌細胞也呈現(xiàn)明顯升高趨勢，見圖1。

3 微波輻射對大鼠心臟組織學結(jié)構(gòu)改變的影響

電鏡結(jié)果顯示，對照組大鼠心肌細胞內(nèi)肌絲排列整齊且緊密，橫紋清晰可見，線粒體和糖原顆粒豐富，線粒體排列較為規(guī)則。而微波輻射組大鼠線粒體和肌絲排列不緊密,橫紋模糊，肌絲明暗帶不清晰，部分肌絲溶解、斷裂。線粒體數(shù)量減少且形態(tài)異常，大部分線粒體溶解空化，基質(zhì)明顯腫脹，且隨著微波輻射強度的增加，心肌細胞損傷有所加重，見圖2。

Figure 1.The apoptosis of rat myocardial cells treated with microwave determined using a cell Analyzer. Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group.

圖1 細胞分析儀檢測微波輻射大鼠心肌細胞凋亡的變化

4 心肌細胞內(nèi)cleaved caspase-3蛋白表達水平的改變

Western blotting實驗結(jié)果顯示(圖3)，微波輻射損傷組，大鼠心肌細胞內(nèi)cleaved caspase-3蛋白的表達量同對照組相比逐漸升高，且隨著微波輻射強度的增加，呈現(xiàn)一定的強度依賴性。

討 論

心臟是個高耗氧、高耗能的器官，心肌組織唯一能夠直接利用的能量形式是ATP，心肌細胞必須不斷合成ATP以維持正常的功能和細胞活力。越來越多的證據(jù)表明，心臟能量代謝障礙是心肌細胞損傷的始動環(huán)節(jié)，是引起和促進心功能障礙發(fā)生、發(fā)展的重要因素[6]。心血管系統(tǒng)是微波輻射較為敏感的靶器官之一，國內(nèi)學者潘敏鴻等[7-8]的研究表明，一定量的高功率微波輻射可造成心臟組織結(jié)構(gòu)損傷，心肌纖維變性，肌漿凝聚，橫紋消失，而且隨著輻射劑量的增加，心臟內(nèi)分泌功能同時也受損。目前雖然微波輻射對心臟的損傷作用得到了證實，但是相關(guān)結(jié)論還有待更多的實驗驗證。因此，研究其發(fā)生機制、尋求有效的拮抗措施，一直是該領(lǐng)域研究熱點。本研究以大鼠為研究對象，探討2 450 MHz微波輻射對心臟損傷作用及機制，具有重要的理論和實踐意義。

表1 微波輻射對大鼠心臟ATP含量及線粒體復合體Ⅳ和Ⅴ活性的影響

Table 1.The effect of microwave radiation on ATP content and mitochondrial complex Ⅳ and Ⅴ activity in rat heart (Mean±SD.n=12)

GroupATP(μmol/g)ComplexⅣ(mmol·min-1·g-1)ComplexⅤ(mmol·min-1·g-1)Control0.479±0.0160.527±0.0180.241±0.037500W/m20.465±0.024*0.496±0.038*0.224±0.022*1000W/m20.411±0.034*0.367±0.023*0.208±0.033*1500W/m20.326±0.014*0.249±0.016*0.167±0.016*2000W/m20.296±0.059*0.212±0.024*0.118±0.039*

*P<0.05vscontrol group.

Figure 2.The ultrastructure changes of the heart tissues observed under transmission electron microscope (×1 000).

圖2 透射電鏡觀察心肌組織超微結(jié)構(gòu)的變化

心臟是一個高活動、高能量消耗的器官，無論心肌舒張或收縮都需要充足的能量供應，當心臟能量代謝異常時，心臟功能受到損傷。實驗結(jié)果顯示，微波輻射后，大鼠心肌細胞中ATP含量、線粒體呼吸鏈復合體Ⅳ和Ⅴ活性呈現(xiàn)降低趨勢，且隨著微波輻射強度的增加，呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。電鏡結(jié)果顯示，微波輻射組大鼠線粒體和肌絲排列不緊密,橫紋模糊，肌絲明暗帶不清晰，部分肌絲溶解、斷裂。線粒體數(shù)量減少且形態(tài)異常，大部分線粒體溶解空化，基質(zhì)明顯腫脹，且隨著微波輻射強度的增加，心肌細胞損傷有所加重。表明微波輻射后大鼠心臟能量代謝出現(xiàn)異常，心肌細胞受損。

Figure 3.The effect of microwave on the protein expression of cleaved caspase-3 in the rat myocardial cells. Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group.

圖3 不同強度微波輻射對大鼠心肌細胞內(nèi)cleaved caspase-3蛋白表達的影響

近年來，越來越多的研究表明，心肌細胞凋亡參與多種心臟的病理生理過程,但是關(guān)于微波輻射誘導心肌細胞凋亡的報道較少[9-11]。本研究采用Muse細胞分析儀器檢測微波輻射后大鼠心肌細胞凋亡情況，結(jié)果顯示，微波輻射能夠誘導大鼠心肌細胞發(fā)生凋亡，且隨著微波輻射強度的增加，細胞凋亡率呈上升趨勢。細胞凋亡是機體為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細胞自主性有序死亡。細胞凋亡有嚴格的調(diào)控機制，caspase-3是caspase家族中重要的成員，大多數(shù)觸發(fā)細胞凋亡的因素最終均需要通過caspase-3介導的信號轉(zhuǎn)導途徑[12]。Western blotting結(jié)果顯示，微波輻射后大鼠心肌細胞內(nèi)cleaved caspase-3蛋白的表達量同對照組相比逐漸升高，表明細胞發(fā)生凋亡增多。

線粒體是細胞內(nèi)重要的細胞器，生物體內(nèi)90%以上的ATP是由線粒體產(chǎn)生。它具有復雜的亞微結(jié)構(gòu)和功能轉(zhuǎn)換系統(tǒng)，通過氧化磷酸化為細胞生命活動供能，也是氧自由基產(chǎn)生的主要場所，在凋亡過程中發(fā)揮著非常重要的調(diào)控作用。本研究結(jié)果顯示，微波輻射可以引起大鼠心肌細胞ATP酶活性降低，細胞代謝紊亂，出現(xiàn)線粒體結(jié)構(gòu)與功能的改變，從而引起大鼠心肌細胞發(fā)生凋亡。研究結(jié)果為今后開發(fā)微波輻射所致的心臟損傷標志物研究奠定理論基礎(chǔ)。但是，具體的作用機制及相關(guān)診斷試劑的研發(fā)還有待今后深入研究。

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Energy metabolism and apoptotic effect of microwave radiation on rat myocardial cells

ZHU Wen-he, SHEN Nan, XU Jun-jie, ZHONG Xiu-hong, Lü Shi-jie

(DepartmentofBiochemistry,JilinMedicalCollege,Jilin132013,China.E-mail:jlmpczwh@163.com)

AIM: To investigate the effect of microwave radiation at different intensities on the rat myocardium and its possible mechanism. METHODS: The rats were radiated by the intensity of 500, 1 000, 1 500 and 2 000 W/m2with 2 450 MHz microwave for 6 min. The heart tissue was collected 6 h after microwave radiation. ATP and mitochondria complex Ⅳ and Ⅴ were measured. The changes of the tissue structures were observed under transmission electron microscope. The apoptosis of the myocardial cells was detected by a cell analyzer. The protein level of cleaved caspase-3 was determined by Western blotting. RESULTS: The concentration of ATP and activity of mitochondria complex Ⅳand Ⅴ signi-ficantly decreased compared with control group in the cardiac tissues. The decreased number, morphological abnormalities such as dissolved cavitation, matrix and obvious tumefaction of mitochondria were observed under transmission electron microscope. The microwave radiation induced the apoptosis of myocardial cells in the rats. The cell apoptotic rate and the protein level of cleaved caspase-3 increased with increasing intensity of microwave radiation(P<0.05). CONCLUSION: Microwave radiation has obvious injury effect on the rat heart, which can cause cardiac energy metabolism dysregulation and cardiac myocyte apoptosis.

Microwave radiation; Energy metabolism; Apoptosis; Mitochondria

1000- 4718(2015)04- 0647- 05

2014- 11- 10

2014- 12- 04

吉林省衛(wèi)生廳科技發(fā)展項目(No. 2012Z066)； 吉林省教育廳資助課題(No. 2013348)

R363.1+2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.04.013

△通訊作者 Tel: 0432-64560460； E-mail: jlmpczwh@163.com