miR-375對人結腸癌細胞株HCT116活性、細胞周期及凋亡的影響*

劉寶龍， 吳斌文， 黃素軍， 李東風

(1南方醫(yī)科大學，廣東 廣州 510515； 2廣東省人民醫(yī)院，廣東省老年醫(yī)學研究所，廣東省醫(yī)學科學院，廣東 廣州 510080； 3廣州市紅十字會醫(yī)院，廣東 廣州 510220)

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miR-375對人結腸癌細胞株HCT116活性、細胞周期及凋亡的影響*

劉寶龍1,2， 吳斌文2△， 黃素軍3， 李東風2

(1南方醫(yī)科大學，廣東 廣州 510515；2廣東省人民醫(yī)院，廣東省老年醫(yī)學研究所，廣東省醫(yī)學科學院，廣東 廣州 510080；3廣州市紅十字會醫(yī)院，廣東 廣州 510220)

目的： 探討微小RNA-375(microRNA-375，miR-375)對人結腸癌細胞HCT116活性、細胞周期及凋亡的影響。方法: Real-time PCR檢測不同結直腸癌細胞中miR-375的表達情況。脂質體轉染法將miR-375模擬物(mimics)轉入HCT116細胞，用real-time PCR法檢測miR-375及AEG-1 mRNA的表達情況；MTT法檢測細胞活性的改變情況；流式細胞技術檢測miR-375對細胞凋亡及細胞周期的影響。結果: Real-time PCR結果顯示HCT116在4個結直腸癌細胞株中miR-375的表達量最低；miR-375 mimics組中miR-375表達量較對照組明顯上調；miR-375高表達可以顯著抑制AEG-1 mRNA的表達水平。miR-375 mimics組細胞活性明顯受到抑制，同時細胞凋亡率明顯增加，G1期所占細胞數(shù)增加，而S期所占細胞數(shù)減少。結論: miR-375可以抑制結腸癌HCT116細胞的活性，介導細胞周期阻滯并促進其凋亡。miR-375作為一種抑癌因子，在結腸癌中可能通過抑制AEG-1發(fā)揮抑癌作用。

結直腸癌； 微小RNA-375； 細胞活性； 細胞周期; 細胞凋亡

結直腸癌(colorectal cancer，CRC)是最常見的消化道惡性腫瘤之一，在世界多數(shù)國家的發(fā)病率呈上升趨勢，據(jù)統(tǒng)計，美國每年有近14萬新診斷CRC病例[1]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類長20～25個核苷酸的內源性單鏈非編碼小RNA。miR-375是miRNA家族中的一員，目前已證實與多種惡性腫瘤相關，可通過調節(jié)多種靶基因的表達，發(fā)揮抑癌或促癌作用。研究發(fā)現(xiàn)，miR-375可通過靶向調節(jié)星形膠質細胞升高基因1(astrocyte elevated gene-1，AEG-1)/異黏蛋白(metadherin，MTDH)基因的表達，從而參與肝癌和頭頸部鱗狀細胞癌發(fā)生發(fā)展過程[2-3]，但miR-375與AEG-1的關系尚未在結直腸癌中得到證實。本實驗通過研究miR-375對結腸癌HCT116細胞生物學行為的影響，旨在為結腸癌的發(fā)病機制提供新的理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 主要材料

人結腸癌細胞株Caco-2、HCT-116、SW-480和SW-620均購自CTCC；DMEM培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清均購自Gibco；0.25%胰蛋白酶購自杭州吉諾生物有限公司；miR-375 mimics和negative control轉染試劑盒購自廣州銳博生物科技有限公司；LipofectamineTM2000及TRIzol試劑均購自Invitrogen；噻唑藍(MTT)購自廣州威佳公司；二甲基亞砜購自Sigma；細胞周期及凋亡檢測試劑盒購于杭州聯(lián)科生物技術股份有限公司；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit購自Fermentas；SYBR Premix Ex TaqⅡ(Tli RNaseH Plus)為TaKaRa產(chǎn)品。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng) Caco-2和HCT-116細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，SW-480和SW-620細胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)細胞生長情況每1～2 d換液1次，當細胞覆蓋瓶底壁大部分表面時，進行細胞傳代或收集細胞。

2.2 Real-time PCR檢測不同結腸癌細胞中miR-375的表達情況 收集細胞，按照TRIzol試劑說明書抽提結直腸癌細胞株Caco-2、HCT-116、SW-620和SW-480中的總RNA，-80 ℃凍存?zhèn)溆?。采用real-time PCR檢測結腸癌細胞中miR-375的表達，以U6作為內參照，引物均購自廣州銳博公司。結果采用2-ΔCt法計算目的基因的相對表達量，ΔCt=目的基因平均Ct值-內參照基因平均Ct值。

2.3 細胞轉染 轉染前1 d，將適量(約4×104～5×104)生長狀態(tài)穩(wěn)定的HCT-116細胞接種在24孔細胞培養(yǎng)板上，每孔加入不含抗生素的細胞培養(yǎng)液400 μL。密切觀察細胞生長情況，當細胞密度達到 30%～50%時，開始進行實驗組(miR-375 mimics)和對照組(negative control，NC)的轉染。用50 μL不含血清的培養(yǎng)基Opti-MEM對5 μL濃度為20 μmol/L的miR-375 mimics和negative control進行稀釋，輕輕振蕩混勻，室溫下溫育5 min。用50 μL的不含血清培養(yǎng)基Opti-MEM對1.5 μL LipofectamineTM2000進行稀釋，輕輕振蕩混勻，室溫下溫育5 min。將稀釋好的miR-375 mimics和negative control與LipofectamineTM2000混合，輕柔混勻，室溫下溫育20 min，以形成混合物。100 μL混合物加到培養(yǎng)板的孔中，輕輕搖晃細胞培養(yǎng)板使其與培養(yǎng)液混勻。將細胞培養(yǎng)板置于5% CO2的培養(yǎng)箱中，在37 ℃下培養(yǎng)6 h后，移除每孔中含有混合物的培養(yǎng)液，更換新的培養(yǎng)液。繼續(xù)在37 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)24 h后，進行轉染后的其它實驗檢測。

2.4 Real-time PCR檢測各轉染組細胞中miR-375和AEG-1 mRNA的表達情況 轉染48 h后收集細胞，按照TRIzol說明書抽提細胞中的總RNA，-80 ℃凍存?zhèn)溆谩２捎胷eal-time PCR檢測結腸癌細胞中miR-375的表達，以U6作為內參照，引物購自廣州銳博公司。real-time PCR檢測細胞中AEG-1 mRNA的表達情況，以GAPDH作為內參照，引物購自TaKaRa。AEG-1的上游引物序列為5’-TCGATGATGAATGGTCTGGGTTA-3’，下游引物為5’-AGGAATTGGTTCCTGGGACTTTAG-3’； GAPDH的上游引物序列為 5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’，下游引物為5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’。結果采用2-ΔCt法計算目的基因的相對表達量，ΔCt=目的基因平均Ct值-內參照基因平均Ct值。

2.5 MTT法檢測細胞的生長情況 將轉染后的實驗組和陰性對照組細胞分別接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔接種細胞3 000個(每孔加培養(yǎng)液100 μL)，置于37 ℃、5% CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)4 h、24 h、48 h和72 h后加入MTT工作液，每孔加入0.5% MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，輕輕吸出孔內液體，然后在每孔中加入二甲基亞砜150 μL，應用全自動酶標儀，檢測波長490 nm下的吸光度(A)值。以時間作為橫坐標，計算所得A值的均數(shù)為縱坐標，繪制細胞生長曲線。

2.6 流式細胞術檢測細胞周期 轉染48 h后消化收集細胞，制成單細胞懸液，然后1 200 r/min離心5 min，棄上清。預冷PBS洗滌細胞2次，PI細胞染色，即加入1 000 μL staining buffer(A)及10 μL reagent B染色，混勻后室溫避光孵育30 min，立即上流式細胞儀進行檢測。

2.7 流式細胞術檢測細胞凋亡 轉染48 h后消化收集細胞，制成單細胞懸液，然后1 200 r/min離心5 min，棄上清。預冷PBS洗滌細胞2次，用500 μL 1×binding buffer重懸細胞，加入5 μL FITC標記的Annexin V，加入10 μL的PI?；靹蚝笫覝乇芄夥跤? min，立即上流式細胞儀檢測。

3 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。所有的細胞學實驗均重復3次，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，符合正態(tài)分布且方差齊者采用t檢驗或者單因素方差分析檢驗，方差不齊采用Dunnett T3校正，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 miR-375在結腸癌細胞株中的表達情況

4種人結直腸癌細胞系Caco-2、HCT-116、SW-620和SW-480中miR-375相對表達量分別為0.002 024±0.000 104、0.000 687±0.000 111、0.007 543±0.002 696和0.004 935±0.000 619。其中以HCT116細胞中miR-375的表達水平最低，因此選取HCT116細胞系作為我們進一步研究的對象。

2 miR-375 mimics對HCT 116細胞中miR-375和AEG-1 mRNA表達的影響

miR-375 mimics瞬時轉染HCT116細胞48 h后，采用real-time PCR檢測轉染后實驗組及陰性對照組HCT116細胞中miR-375和AEG-1 mRNA的表達水平。結果顯示，轉染miR-375 mimic后miR-375的表達水平明顯上調，其表達水平約是陰性對照組2 000倍(P<0.01)，同時miR-375的高表達導致AEG-1 mRNA表達下調(P<0.05)。以上結果提示，miR-375 mimics可上調miR-375的表達，同時過表達miR-375可抑制AEG-1 mRNA的表達，見圖1。

Figure 1.The expression levels of miR-375 and AEG-1 mRNA in human colon cancer HCT116 cells after transfection detected by real-time PCR. U6 or GAPDH served as an internal standard. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsnegative control.

圖1 miR-375 mimics對HCT 116細胞中miR-375和AEG-1 mRNA表達的影響

3 miR-375過表達對HCT116細胞生長的影響

MTT法檢測結果顯示，miR-375 mimics組細胞轉染24 h、48 h和72 h時的A值均低于陰性對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。miR-375過表達對HCT116細胞的活力具有明顯抑制作用，見圖2。

4 miR-375過表達對HCT116細胞周期的影響

流式細胞儀檢測轉染48 h后各組細胞的周期分布，結果顯示，陰性對照組與miR-375 mimics組比較，miR-375 mimics組G1期細胞所占比例明顯增多(P<0.01)，S期細胞所占比例明顯減少(P<0.05)，見圖3、表1。

5 miR-375過表達對HCT116細胞凋亡率的影響

流式細胞術檢測轉染48 h后各組細胞的凋亡率，結果顯示，miR-375 mimics組和陰性對照組的細胞凋亡率分別為(8.47±1.55)%和(6.25±1.20)%，陰性對照組的細胞凋亡率明顯低于miR-375 mimics組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖4。

Figure 2.The effect of miR-375 over-expression on the viability of HCT116 cells detected by MTT assay. Mean±SD.n=4.**P<0.01vsnegative control.

圖2 MTT法檢測miR-375過表達對HCT116細胞活力的影響

Figure 3.The cell cycle distribution of HCT116 cells 48 h after transfection detected by flow cytometry.

圖3 miR-375過表達對HCT116細胞周期分布的影響

表1 miR-375過表達對HCT116細胞細胞周期分布的影響

*P<0.05,**P<0.01vsnegative control.

Figure 4.The effect of miR-375 over-expression on the apoptosis of HCT116 cells detected by flow cytometry. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnegative control.

圖4 miR-375過表達對HCT116細胞凋亡率的影響

討 論

miRNA是重要基因調節(jié)因子，它在細胞內具有多種重要的調節(jié)作用，包括細胞生長、增殖、分化、凋亡和代謝等，并參與腫瘤的形成和發(fā)展等眾多病理過程。miRNA主要是通過與靶mRNA上的3’非翻譯區(qū)域(untranslated region，UTR)的特異序列結合，于轉錄后水平促進靶mRNA的降解和(或)抑制翻譯過程而參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展的，每個miRNA可以有多個靶基因，調節(jié)多種蛋白水平，同樣，幾個miRNAs也可以調節(jié)同一個基因，在調控過程中，多條信號通路交叉形成復雜的網(wǎng)絡[4]。miRNA在腫瘤中的作用是多樣性的，同一種miRNA也可能同時扮演致癌因子和抑癌因子的角色，但從整體效應來看，在腫瘤中高表達的miRNA多表現(xiàn)為致癌作用，而低表達的miRNA多表現(xiàn)為抑癌作用。

近來研究發(fā)現(xiàn)，miR-375在多種惡性腫瘤中均有異常表達，但其在不同腫瘤中的表達情況卻不盡相同，具有一定的腫瘤特異性。Simonini等[5]研究發(fā)現(xiàn)在雌激素受體α(estrogen receptor α，ERα)陽性的乳腺癌細胞株中miR-375高表達，并可通過負調控靶基因地塞米松誘導的Ras相關蛋白1(dexamethasone-induced Ras-related protein 1，RASD1)，參與了ERα陽性乳腺癌的形成過程。Szczyrba等[6]研究發(fā)現(xiàn)miR-375在前列腺癌細胞中高表達，通過檢測腫瘤組織miR-375的表達水平，有利于判斷前列腺癌的進程和預后。然而，另外一些學者報道，miR-375在腫瘤中呈低表達，如在胃癌[7-8]、肝癌[2]、頭頸部鱗狀細胞癌[3]、黑素細胞痣[9]、宮頸癌[10]、結直腸癌[11]等中。有多項研究表明miR-375作為抑癌因子可抑制腫瘤細胞的增殖、遷移及侵襲，并誘導腫瘤細胞凋亡。有學者研究表明胃癌細胞中，miR-375低表達，并通過靶向調節(jié)3-磷酸肌醇依懶性蛋白激酶1(3-phosphoinositide-dependent protein kinase-1，PDK1)、抗凋亡基因14-3-3zeta以及Janus激酶2(Janus kinase 2，JAK2)的表達，抑制胃癌細胞的增殖，發(fā)揮抑癌基因的作用[7-8]。Mazar等[9]研究發(fā)現(xiàn)上調miR-375的表達水平，能明顯抑制黑色素瘤細胞的增殖、遷移及侵襲。Wang等[10]在對宮頸鱗癌的研究中發(fā)現(xiàn)，miR-375以轉錄因子特異蛋白1(specificity protein-1，SP1)為靶基因起抑癌基因的作用，參與了宮頸癌的發(fā)生過程。Dai等[11]利用實時定量PCR檢測miR-375在95對結直腸癌和癌旁正常組織中及3株人結直腸癌細胞株(HT29、HCT116和SW620)和人正常結腸黏膜組織中的表達，結果均提示miR-375表達量顯著降低。為了深入了解miR-375在結腸癌發(fā)病過程中的作用及其對結腸癌細胞生物學行為的影響，本研究使用化學合成的miR-375模擬物轉染結腸癌HCT116細胞，上調結腸癌HCT116細胞中miR-375的表達，通過MTT檢測細胞的生長情況，流式細胞技術檢測細胞周期分布和細胞凋亡情況來初步探討miR-375在結直腸癌發(fā)生中的作用。結果顯示結腸癌HCT116細胞miR-375 mimics組與negative control組相比，各個時點細胞生長活力均顯著降低，表明上調miR-375的表達能夠抑制結腸癌細胞HCT116的細胞活性。我們發(fā)現(xiàn)與negative control組相比，miR-375 mimics組中G1期細胞所占比例明顯增多，S期細胞所占比例明顯減少，提示miR-375 過表達能夠使更多的細胞阻滯在G0/G1期。同時，上調miR-375的表達能增加細胞的凋亡率，說明miR-375在促進結腸癌細胞凋亡的過程中起了重要作用。由此筆者推測，miR-375可能是通過抑制了某些癌基因的表達，從而抑制細胞生長活性，介導細胞周期阻滯并促進細胞凋亡，表現(xiàn)為抑癌基因的功能。

AEG-1位于人染色體8q22，是重要的促癌基因，目前已被證實在包括宮頸癌[12]、結直腸癌[13]、神經(jīng)母細胞瘤[14]等在內的多種惡性腫瘤中高表達，通過影響細胞的增殖、凋亡、遷移、侵襲及血管生成等過程，參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展。秦瑞英等[12]研究發(fā)現(xiàn)AEG-1在宮頸癌中高表達可能與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關，其表達下調介導的細胞周期靜止和侵襲能力降低可能與細胞周期相關蛋白細胞周期素D1(cyclin D1)、細胞周期素依賴性激酶2(cyclin-dependent kinase 2，CDK2)及基質金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)蛋白表達下調密切相關。Huang等[15]研究發(fā)現(xiàn)AEG-1在結直腸癌的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，抑制AEG-1的表達可以抑制結直腸癌細胞的增殖、克隆形成和侵襲能力，誘導凋亡，并可增加腫瘤細胞對5-Fu的敏感性。我們在進一步的研究中發(fā)現(xiàn)，轉染miR-375 mimics后，miR-375的表達明顯增加，同時發(fā)現(xiàn)miR-375的高表達顯著抑制了AEG-1的轉錄。我們推測miR-375可能通過調控癌基因AEG-1的表達而發(fā)揮抑制腫瘤細胞生長活性、介導腫瘤細胞周期阻滯及促進腫瘤細胞凋亡的作用，這與其在肝癌、頭頸部腫瘤等的研究結論一致。

總之，miR-375可以抑制結腸癌細胞HCT116的細胞活性，介導細胞周期阻滯并誘導其凋亡，提示miR-375在結直腸癌的發(fā)生中發(fā)揮重要作用，同時證實了miR-375與AEG-1的關系，進一步探討二者的相互關系，可為闡明miR-375的抑癌機制提供一條新的思路。

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源于人誘導多能干細胞并表達腦啡肽酶2的巨噬細胞可降解β淀粉樣蛋白

近日，日本科學家發(fā)現(xiàn)人誘導多能干細胞(iPS細胞)衍生的巨噬細胞在阿爾茨海默病(AD)的治療中具有應用前景。在前期研究中，他們建立了從人iPS細胞生成具有增殖活性的巨噬細胞樣髓系細胞(iPS-ML)的技術，并發(fā)現(xiàn)iPS-ML能降低加入到培養(yǎng)基中的Aβ水平，且iPS-ML的培養(yǎng)上清液能減輕Aβ的神經(jīng)毒性。在該研究中，他們又構建了表達Aβ特異性單鏈抗體Fc受體融合形式(anti-Aβ scFv)的iPS-ML；此外，還讓iPS-ML表達腦啡肽酶2(NEP2；一種能夠降解Aβ的蛋白酶)。在體外，NEP2而非anti-Aβ scFv的表達可以增強iPS-ML降解培養(yǎng)基中可溶性Aβ寡聚體并減輕Aβ神經(jīng)毒性的能力。將表達NEP2的iPS-ML(iPS-ML/NEP2)注入5XFAD小鼠(AD小鼠模型)腦內，可見有iPS-ML/NEP2注入的腦組織液中Aβ的水平顯著降低。這些結果表明，iPS-ML/NEP2可能成為治療AD的一種有效藥物。

Stem Cell Res, 2014, 13(3 Pt A): 442-453(黃翠芹)

Effect of miR-375 on viability, cell cycle and apoptosis of colon cancer HCT116 cells

LIU Bao-long1, 2, WU Bin-wen2, HUANG Su-jun3, LI Dong-feng2

(1SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China;2GuangdongGeneralHospital,GuangdongProvincialInstituteofGeriatrics,GuangdongAcademyofMedicalSciences,Guangzhou510080,China;3GuangzhouRedCrossHospital,Guangzhou510220,China.E-mail:wubinwengd@aliyun.com)

AIM: To investigate the effect of microRNA-375 (miR-375) on the viability, cell cycle and apoptosis of HCT116 cells. METHODS: The expression of miR-375 in different colorectal cancer cell lines was detected by real-time PCR. The miR-375 mimics was transfected into HCT116 cells by LipofectamineTM2000. The mRNA expression of miR-375 and AEG-1 was detected by real-time PCR. The HCT116 cell viability was detected by MTT assay. The changes of apoptosis and cell cycle distribution were analyzed by flow cytometry. RESULTS: Real-time PCR showed that miR-375 expression was the lowest in HCT116 among 4 colorectal cancer cell lines. The expression level of miR-375 significantly increased in miR-375 mimics group compared with that in the negative control group. The high expression level of miR-375 significantly inhibited the mRNA expression of AEG-1. After transfection with miR-375 mimics, the cell viability was inhibited, the apoptotic rate was increased, the proportion of G1-stage cells was increased, and the proportion of S-stage cells was decreased. CONCLUSION: miR-375 inhibits the viability, mediates the cell cycle arrest and promotes the apoptosis of colon cancer HCT116 cells. miR-375 may act as a tumor suppressor in colorectal cancer by inhibiting AEG-1.

Colorectal cancer; MicroRNA-375; Cell viability; Cell cycle; Apoptosis

1000- 4718(2015)04- 0609- 06

2014- 11- 30

2015- 02- 10

廣東省科技計劃(No. 2011B031800001)

R735.3; R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.04.006

△通訊作者 Tel: 020-83827812; E-mail: wubinwengd@aliyun.com