論華法林相關(guān)基因突變檢測(cè)技術(shù)

孫雪1，2 況赟1，2 陽(yáng)喜定1，2 郭成賢2 陽(yáng)國(guó)平2★

論華法林相關(guān)基因突變檢測(cè)技術(shù)

孫雪1，2 況赟1，2 陽(yáng)喜定1，2 郭成賢2 陽(yáng)國(guó)平2★

華法林為一種常用的口服抗凝藥，主要用于治療血栓栓塞性疾病。但其治療窗窄、個(gè)體差異大，容易引起血栓或出血的風(fēng)險(xiǎn)。代謝酶CYP2C9和作用靶點(diǎn)VKORC1基因多態(tài)性對(duì)華法林個(gè)體劑量差異有顯著影響，因此CYP2C9和VKORC1基因突變的檢測(cè)對(duì)于華法林的個(gè)體化治療具有重要的參考價(jià)值。目前用于CYP2C9和VKORC1突變檢測(cè)的方法有PCR-RFLP、TaqMan、pyrosequencing、HRM、POCT、熔解曲線(xiàn)分析技術(shù)、MS、DHPLC等。本文將對(duì)這些檢測(cè)方法的特點(diǎn)進(jìn)行比較分析，以發(fā)現(xiàn)適合臨床應(yīng)用推廣的技術(shù)檢測(cè)方法。

華法林；CYP2C9；VKORC1；基因突變檢測(cè)

自2009年國(guó)際華法林藥物基因組協(xié)會(huì)（International Warfarin Pharmacogenetics Consortium，IWPC）推出華法林劑量計(jì)算公式以來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)華法林的隨機(jī)對(duì)照臨床研究成為遺傳藥理學(xué)研究的一項(xiàng)熱點(diǎn)。近年來(lái)大多數(shù)臨床試驗(yàn)旨在探索代謝酶Cytochrome P450 2C9（CYP2C9）*2（rs1799853）、*3（rs1057910）和作用靶點(diǎn)維生素K環(huán)氧化物還原酶1（vitamin K epoxide reductase complex subunit 1，VKORC1）（rs9923231）對(duì)華法林劑量的影響，并對(duì)IWPC公式進(jìn)行修正及驗(yàn)證等。有研究表明，CYP2C9*2及*3可解釋華法林個(gè)體劑量差異的12％，而VKORC1可解釋華法林個(gè)體劑量差異的30％［1］。因此，在華法林的臨床應(yīng)用中對(duì)CYP2C9及VKORC1進(jìn)行基因突變檢測(cè)顯得十分重要。高效靈敏的CYP2C9、VKORC1基因突變檢測(cè)技術(shù)能為華法林個(gè)體治療提供快捷的指導(dǎo)。本文將對(duì)CYP2C9、VKORC1基因突變檢測(cè)方法的研究近況進(jìn)行綜述，以期發(fā)現(xiàn)適合臨床應(yīng)用推廣的檢測(cè)方法。

1　常用的檢測(cè)方法

1.1聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)連接的限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）

PCR-RFLP是用特異設(shè)計(jì)的PCR引物擴(kuò)增目的DNA，擴(kuò)增產(chǎn)物再用特異性?xún)?nèi)切酶消化切割成不同大小片段，并直接在凝膠電泳上分辨的方法。不同等位基因的限制性酶切位點(diǎn)分布不同，會(huì)產(chǎn)生不同長(zhǎng)度的DNA片段條帶。該法與限制性?xún)?nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）相比，區(qū)別是以擴(kuò)增替代了酶切，避免了RFLP繁瑣的DNA酶切、轉(zhuǎn)移、雜交等步驟，具有方法簡(jiǎn)便、分型時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)。PCR-RFLP大大提高了目的DNA的含量和相對(duì)特異性，是目前國(guó)內(nèi)外華法林研究最為常用的基因突變檢測(cè)方法［2-9］。

Gu等［10］在進(jìn)行華法林影響因素的研究時(shí)，使用了PCR-RFLP對(duì)127名關(guān)節(jié)置換患者及133名健康對(duì)照者DNA樣本進(jìn)行CYP2C9及VKORC1三個(gè)位點(diǎn)的基因分型，結(jié)果表明該法分型快速而準(zhǔn)確。

1.2TaqMan等位基因辨別分析

TaqMan等位基因辨別分析采用不同的熒光基團(tuán)分別標(biāo)記兩種特異探針，探針的兩端分別標(biāo)記了熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)。在PCR延伸過(guò)程中，具有5＇→3＇外切活性的DNA聚合酶只外切并降解與模板完全互補(bǔ)的探針，當(dāng)被外切后，熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分離，從而激發(fā)出熒光。如果一種熒光信號(hào)明顯強(qiáng)于另一種，則表明該基因型為野生型。如果2種熒光信號(hào)都增強(qiáng)，則表明其為突變型。

TaqMan技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于僅使用一個(gè)反應(yīng)且操作簡(jiǎn)單，可以在單管反應(yīng)中檢出樣本的基因型，可以在2小時(shí)內(nèi)快速對(duì)96個(gè)樣本進(jìn)行基因突變的檢測(cè)。TaqMan技術(shù)最先在Sevall發(fā)表的文章中提及［11］。2010年1項(xiàng)對(duì)Invader、Verigene和TaqMan三種基因突變檢測(cè)方法進(jìn)行50個(gè)樣本分型的對(duì)比研究表明，TaqMan基因檢測(cè)方法較為經(jīng)濟(jì)，且所需樣本DNA量較其他兩種方法少，僅需5～20 ng［12］。

2009年IWPC建立最大樣本量的模型時(shí)，即使用了TaqMan對(duì)5 052個(gè)樣本進(jìn)行CYP2C9及VKORC1的基因分型［13］。該研究通過(guò)隨機(jī)抽取480個(gè)樣本進(jìn)行基因分型的質(zhì)量控制，結(jié)果表明，Taq-Man對(duì)CYP2C9基因分型結(jié)果的一致性為97.8％，對(duì)VKORC1基因分型結(jié)果的一致性為97.7％。先后國(guó)內(nèi)外在華法林的研究中，對(duì)CYP2C9及VKORC1基因突變檢測(cè)也廣泛應(yīng)用了該方法［14-18］。

1.3焦磷酸測(cè)序法（pyrosequencing）

焦磷酸測(cè)序法是測(cè)序法的一種，是新近發(fā)展起來(lái)的基于酶催化化學(xué)反應(yīng)的測(cè)序技術(shù)，可以快速準(zhǔn)確地測(cè)定一段較短的目標(biāo)片段。其基本原理是4種脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）之一被加入引物延伸反應(yīng)體系中，當(dāng)加入的dNTP恰好與DNA模板的下一個(gè)堿基配對(duì)，則會(huì)在DNA聚合酶的作用下，添加到測(cè)序引物的3′末端，同時(shí)釋放出一分子的焦磷酸，這個(gè)焦磷酸分子是一系列后續(xù)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的必備材料。如果沒(méi)有摻入dNTP就不會(huì)產(chǎn)生光信號(hào)，而在加入下一種dNTP之前，反應(yīng)體系中剩余的dNTP會(huì)在酶的作用下發(fā)生降解。因此，觀(guān)察導(dǎo)致發(fā)光的dNTP類(lèi)型就能確定單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）的基因型。

焦磷酸測(cè)序法具有省時(shí)、低費(fèi)用、準(zhǔn)確性高、易于實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)化、可對(duì)SNP位點(diǎn)進(jìn)行突變頻率的定量分析等優(yōu)點(diǎn)，是近年來(lái)一種備受關(guān)注的SNP基因分型方法。與一些標(biāo)準(zhǔn)基因分型方法相比，焦磷酸測(cè)序法還存在一些不足。首先，該方法在進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)，生物素標(biāo)記引物價(jià)格較高；其次，該方法的應(yīng)用限于短片段PCR產(chǎn)物（建議不超過(guò)200 bp），無(wú)法對(duì)較長(zhǎng)片段的產(chǎn)物進(jìn)行精確的測(cè)序分析，這就限制了焦磷酸測(cè)序技術(shù)在基因測(cè)序中的廣泛應(yīng)用；再者，該方法對(duì)測(cè)序片段中連續(xù)的相同堿基（3個(gè)以上）的判讀容易出現(xiàn)誤差。2008年King等［19］將其與其他三種商業(yè)測(cè)序方法INFINITI analyzer、Invader assay、Tag-It Mutation Detection assay進(jìn)行比較研究，對(duì)112個(gè)樣本進(jìn)行CYP2C9及VKORC1基因分型，結(jié)果表明焦磷酸測(cè)序法對(duì)CYP2C9*2、CYP2C9*3及VKORC1分型的準(zhǔn)確率分別為99％、100％、100％，且分型時(shí)間約為4小時(shí)。

近年又發(fā)展了一種單筒聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-焦磷酸測(cè)序法（single-tube PCR-pyrosequencing），且在華法林研究中有應(yīng)用［20-21］。與簡(jiǎn)單的焦磷酸測(cè)序法相比，該法每次可對(duì)96個(gè)樣本進(jìn)行測(cè)定，具有更省時(shí)且更經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)。2014年Kim等［22］使用了1種新型的基因突變檢測(cè)方法，即多元焦磷酸測(cè)序?qū)?50個(gè)樣本進(jìn)行CYP2C9及VKORC1基因突變的檢測(cè)，其結(jié)果與單焦磷酸測(cè)序法結(jié)果100％一致。測(cè)序結(jié)果通過(guò)直接測(cè)序法進(jìn)行驗(yàn)證，表明多元焦磷酸測(cè)序方法所得結(jié)果快速而可靠。

1.4高分辨率熔解曲線(xiàn)分析技術(shù)（high resolution melting，HRM）

HRM是近幾年興起的SNP及突變研究工具，HRM通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)升溫過(guò)程中雙鏈DNA熒光染料與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的結(jié)合情況，來(lái)判斷是否存在SNP。不同SNP位點(diǎn)、不同基因型等都會(huì)影響熔解曲線(xiàn)的峰形，因此HRM分析能夠有效區(qū)分不同SNP位點(diǎn)與不同基因型。HRM是在熔解曲線(xiàn)分析技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，二者的差別在于，常規(guī)熔解曲線(xiàn)升溫時(shí)每步升高0.5～1℃，而高分辨率熔解曲線(xiàn)每步升溫0.02～0.1℃；兩種熔解曲線(xiàn)所使用的熒光染料亦不相同，高分辨率熔解曲線(xiàn)必需使用飽和熒光染料，而普通熔解曲線(xiàn)由于對(duì)分辨率要求不高，則可使用非飽和熒光染料。HRM由于使用新型的飽和染料和高分辨率的儀器，有著極高的分辨率。

作為新一代的遺傳掃描工具，HRM具有靈敏度高、速度快、操作簡(jiǎn)單、選擇性好、價(jià)格低廉、實(shí)現(xiàn)了真正的閉管操作等優(yōu)點(diǎn)，使其越來(lái)越多的受到了廣大研究者的關(guān)注［23］。

2012年相關(guān)研究者新建立了一種用于檢測(cè)CYP2C9及VKORC1的HRM方法［24］，對(duì)100個(gè)華法林治療患者的樣本進(jìn)行CYP2C9*3及VKORC1的基因分型，并將該方法與傳統(tǒng)的PCRRFLP、直接測(cè)序法及TaqMan探針?lè)ㄟM(jìn)行了比較，證明了該方法更簡(jiǎn)單、更經(jīng)濟(jì)、更快速。該結(jié)果促進(jìn)了后續(xù)華法林研究中對(duì)HRM的使用［25-26］。

1.5即時(shí)檢測(cè)（point-of-care testing，POCT）

POCT是一種新型的即時(shí)檢測(cè)技術(shù)。2009年歐盟遺傳藥物學(xué)和抗凝治療（european pharmacogenetics of anticoagulant therapy，EU-PACT）成員發(fā)表香豆素類(lèi)大型隨機(jī)對(duì)照臨床試驗(yàn)方案［27］，說(shuō)明將使用POCT進(jìn)行基因分型，并指出該方法可在1.5小時(shí)內(nèi)得到分型結(jié)果。2011年EU-PACT試驗(yàn)組成員Howard等［28］發(fā)表以HyBeacon為探針而建立的新型熒光PCR基因分型方法，并以適用于POCT的標(biāo)準(zhǔn)PCR儀器Genie 1進(jìn)行分型。該方法從指尖無(wú)菌采血或采靜脈血于真空管中，直接使用未經(jīng)提取DNA的血樣進(jìn)行基因分型。該研究通過(guò)隨機(jī)選取128個(gè)新鮮或冷凍的血液進(jìn)行基因分型，同批血樣分別在其他實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行Taqman及PCR-RFLP分型進(jìn)行方法驗(yàn)證，結(jié)果表明3種方法一致性為100％。2013年EU-PACT研究者將華法林試驗(yàn)結(jié)果文章發(fā)表于新英格蘭雜志［29］，通過(guò)對(duì)455個(gè)患者的樣本進(jìn)行基因分型，表明該方法從收到血樣至得到分型結(jié)果僅需2小時(shí)。通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)的Taqman及PCR-RFLP驗(yàn)證比較，結(jié)果表明該方法更高效。

POCT的優(yōu)點(diǎn)在于無(wú)需在實(shí)驗(yàn)室操作，實(shí)現(xiàn)了床旁檢測(cè)；無(wú)需提取DNA，操作簡(jiǎn)單；耗時(shí)短，可快速得到結(jié)果，適用于華法林研究及其臨床應(yīng)用；費(fèi)用較低，每個(gè)分析約需50美元，一般研究可以負(fù)擔(dān)；準(zhǔn)確性高。但該方法的缺點(diǎn)在于需要特定的HyBeacon探針及Genie 1分型儀器，一般實(shí)驗(yàn)室可能尚不具備；POCT目前僅在EU-PACT大型臨床試驗(yàn)中得以驗(yàn)證，其準(zhǔn)確性有待進(jìn)一步通過(guò)大樣本量驗(yàn)證，因此該方法有待臨床進(jìn)一步驗(yàn)證和推廣。

2　其他檢測(cè)技術(shù)

2.1熔解曲線(xiàn)分析技術(shù)（melting curve analysis）

熔解曲線(xiàn)分析技術(shù)的基本原理是利用熒光標(biāo)記的DNA探針與目標(biāo)DNA互補(bǔ)，進(jìn)而發(fā)射熒光，而未被結(jié)合的熒光標(biāo)記DNA探針將猝滅。與探針結(jié)合序列的多態(tài)性將引起堿基對(duì)的錯(cuò)配，從而破壞探針，使其融解即變性。與野生型相比，突變型在不同溫度下發(fā)射的熒光也有相應(yīng)的改變，熒光的負(fù)導(dǎo)數(shù)的變化作為溫度的函數(shù)，將生成表明樣本基因型的特征峰。

2008年的一項(xiàng)比較研究表明，該方法的缺陷為目的基因臨近的未知基因多態(tài)性的干擾，這也限制了該方法的廣泛應(yīng)用［30］。但通過(guò)設(shè)計(jì)更好的探針，可消除該潛在缺陷。

2.2質(zhì)譜法（mass spectrometry，MS）

MS檢測(cè)方法的原理是使用質(zhì)譜直接或間接檢測(cè)等位基因特異性延伸來(lái)區(qū)分反應(yīng)產(chǎn)物。各種等位基因區(qū)分反應(yīng)如單堿基延伸及其變化形式、等位基因特異性肽核酸（peptide nucleic acid，PNA）、Invader、堿基特異性裂解和等位基因特異性PCR均已成功地和質(zhì)譜檢測(cè)法聯(lián)合應(yīng)用。因?yàn)橘|(zhì)譜法測(cè)定的是DNA分子的基本性質(zhì)即反應(yīng)產(chǎn)物的分子量，因而是最直接的檢測(cè)方法，不需任何標(biāo)記物。2009年IWPC研究中，部分VKORC1的基因分型即應(yīng)用了該方法。

MS檢測(cè)方法的優(yōu)點(diǎn)是高分辨率，可以輕易區(qū)分僅相差一個(gè)堿基的DNA分子；分析時(shí)間短，分析每個(gè)樣品只需幾毫秒，所以即使MS逐個(gè)分析每個(gè)樣品，檢測(cè)通量仍然很高；通過(guò)合理的設(shè)計(jì)探針，可實(shí)現(xiàn)中度的多重化。MS檢測(cè)方法的最大缺點(diǎn)是對(duì)分析樣品純度要求苛刻，隨著對(duì)產(chǎn)品純化過(guò)程的改進(jìn)，可以克服這個(gè)不足。

2010年Yang等［31］報(bào)告了一種新型的表面增強(qiáng)激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（surface-enhanced laser desorption/ionization time-of-filght mass spectrometry，SELDI-TOF MS）分型方法。通過(guò)DNA雙向測(cè)序法對(duì)189個(gè)樣本的SELDI-TOF MS檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行準(zhǔn)確性評(píng)估，結(jié)果一致性為100％。該方法與傳統(tǒng)的MS法比較，簡(jiǎn)化了操作過(guò)程，取消了許多繁瑣的試驗(yàn)步驟，檢測(cè)CYP2C9及VKORC1三個(gè)位點(diǎn)突變所需時(shí)間少于5小時(shí)，該分型方法的準(zhǔn)確性已通過(guò)雙向DNA測(cè)序得以證實(shí)。這種新型的多重復(fù)路基因分型方法提供了良好的臨床試驗(yàn)平臺(tái)，促進(jìn)了華法林個(gè)體化用藥的臨床研究。

2.3變性高效液相色譜法（denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC）

DHPLC是利用發(fā)生錯(cuò)配的雜合雙鏈DNA與純合雙鏈DNA解鏈特征的差異將它們分離開(kāi)來(lái)。由于雜合雙鏈DNA錯(cuò)配位點(diǎn)處氫鍵被破壞而形成“鼓泡”，在部分加熱變性的條件下，更易于解鏈形成Y形結(jié)構(gòu)，與固定相的結(jié)合能力降低，所以雜合雙鏈將先于純合雙鏈被洗脫出來(lái)，通過(guò)洗脫峰的不同就可判斷是否有突變存在。部分研究者也使用了該方法進(jìn)行CYP2C9及VKORC1的基因突變檢測(cè)［32-33］。

與測(cè)序法相比，DHPLC簡(jiǎn)單、快速、敏感性高，不僅可用于已知突變的檢測(cè)，還可以用于未知突變的掃描。但該方法尚未通過(guò)大樣本量的驗(yàn)證，因此目前其臨床應(yīng)用相對(duì)較少。

3　基因分型試劑盒及平臺(tái)

基因分型平臺(tái)不僅可為華法林的大型臨床研究提供技術(shù)支持，也為華法林的臨床應(yīng)用提供了一定的保障，但基因分型平臺(tái)需要較特殊的儀器設(shè)備?；蚍中驮噭┖?，由于便于攜帶，操作簡(jiǎn)便，可為華法林的臨床應(yīng)用帶來(lái)便利。

3.1目前已獲CFDA批文的CYP2C9及VKORC1基因分型試劑盒

（1）上海百傲科技股份有限公司研發(fā)的CYP2C9和VKORC1基因多態(tài)性檢測(cè)試劑盒（PCR-芯片雜交法）于2012年獲CFDA批準(zhǔn)，是國(guó)內(nèi)首個(gè)獲批準(zhǔn)的檢測(cè)CYP2C9及VKORC1的試劑盒，該試劑盒每次可對(duì)12個(gè)標(biāo)本進(jìn)行基因突變的檢測(cè)。

（2）中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司的VKORC1和CYP2C9基因檢測(cè)試劑盒（PCR-電化學(xué)基因芯片法）也于2014年獲CFDA批準(zhǔn)，可一次檢測(cè)24個(gè)標(biāo)本。

3.2目前已獲FDA及CFDA批文的CYP2C9及VKORC1基因分型平臺(tái)

（1）美國(guó)TrimGen公司研發(fā)的eQ-PCRTMLC華法林基因分型平臺(tái)于2009年獲得FDA批準(zhǔn)上市，510（k）編碼為k073071，需使用特殊設(shè)備LightCycler? Real-TimePCRSysteminstrumentmodel 1.2［34］。

（2）美國(guó)ParagonDx有限責(zé)任企業(yè)研發(fā)的可對(duì)CYP2C9和VKORC1快速基因分型分析的平臺(tái)于2008年獲FDA批準(zhǔn)上市，510（k）編碼為k071867，需使用特殊設(shè)備Cepheid Smart Cycler Dx［35］。

（3）美國(guó)Nanosphere公司研發(fā)的Verigene華法林代謝核酸測(cè)試系統(tǒng)于2007年獲FDA批準(zhǔn)上市，510（k）編碼為k070804，需使用特殊設(shè)備The Verigene?System［36］。

（4）美國(guó)Osmetech分子診斷公司研發(fā)的eSensor?華法林敏感性測(cè)試，eSensor?XT-8系統(tǒng)于2008年獲FDA批準(zhǔn)上市，510（k）編碼為k073720，需使用特殊設(shè)備The eSensor?XT-8 Instrument［37］。

（5）美國(guó)GenMark診斷公司研發(fā)的eSensor華法林敏感性唾液測(cè)試平臺(tái)于2011年獲FDA批準(zhǔn)上市，510（k）編碼為k110786，需使用特殊設(shè)備Oragene·Dx collection device（k110701）models OGD-500，OGD-575，OXD-525 and OYD-500，eSensor?XT-8 Instrument［38］。

（6）美國(guó)Autogenomics公司研發(fā)的INFINITI 2C9-VKORC1華法林多元檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)于2007年獲FDA批準(zhǔn)上市，510（k）編碼為k073014，需使用特殊設(shè)備Autogenomics INFINITI Analyzer［39］。

（7）佛山達(dá)安醫(yī)療設(shè)備有限公司開(kāi)發(fā)生產(chǎn)的電化學(xué)基因芯片檢測(cè)儀，于2014年獲CFDA批準(zhǔn)，與中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司的VKORC1和CYP2C9基因檢測(cè)試劑盒配套使用。

4　結(jié)語(yǔ)

PCR-RFLP及TaqMan技術(shù)由于操作簡(jiǎn)單，耗時(shí)短，近年被廣泛用于CYP2C9及VKORC1基因突變的檢測(cè)。HRM及POCT雖然應(yīng)用時(shí)間較短，但由于其具有高靈敏度、高通量且省時(shí)、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)越性，有望成為CYP2C9及VKORC1基因突變檢測(cè)的主流方法。MS及DHPLC目前應(yīng)用于華法林研究尚不多，有待進(jìn)一步臨床研究加以驗(yàn)證。

目前用于CYP2C9及VKORC1基因突變檢測(cè)的試劑盒較少，國(guó)內(nèi)僅一個(gè)試劑盒獲CFDA批準(zhǔn)上市。美國(guó)FDA已批準(zhǔn)一些分型平臺(tái)上市，這些分型平臺(tái)為華法林的臨床研究和應(yīng)用奠定了一定的基礎(chǔ)，但這些分型平臺(tái)均需要較特殊的儀器設(shè)備，尚未得到普遍應(yīng)用。因此研發(fā)高準(zhǔn)確性、高靈敏度、簡(jiǎn)單、省時(shí)、經(jīng)濟(jì)的CYP2C9及VKORC1基因分型平臺(tái)及試劑盒，對(duì)華法林的臨床研究及使用均具有重要意義。

華法林為抗凝治療的一線(xiàn)藥物，但由于個(gè)體差異大，易引起血栓及出血等風(fēng)險(xiǎn)，導(dǎo)致其在中國(guó)的使用率非常低。多項(xiàng)研究表明CYP2C9及VKORC1對(duì)個(gè)體劑量差異有顯著影響，因此有效的基因分型方法對(duì)華法林的臨床應(yīng)用有重要的意義。通過(guò)對(duì)上述分型方法的分析比較，PCR-RFLP、TaqMan由于操作簡(jiǎn)便、省時(shí)、且通過(guò)了大量研究驗(yàn)證等特點(diǎn)，均適于臨床推廣應(yīng)用。HRM由于省時(shí)、操作簡(jiǎn)便、價(jià)格低廉等更突出的優(yōu)越性，加以大樣本驗(yàn)證，最適于臨床推廣應(yīng)用。POCT具備極為省時(shí)且操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確性高等特點(diǎn)，如果其所需的特殊探針及儀器設(shè)備能夠普及，則推薦其大規(guī)模臨床應(yīng)用。

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The overview of warfarin related gene mutation detection technologies

SUN Xue1，2，KUANG Yun1，2，YANG Xiding1，2，GUO Chengxian2，YANG Guoping2★
（1.Pharmaceutical College of Central South University，Changsha，Hunan，China，410013；2.Center of Clinical Pharmacology，the Third Xiangya Hospital，Central South University，Changsha，Hunan，China，410013）

Warfarin is a kind of commonly prescribed oral anticoagulant for preventing thromboembolic disease.However，it is prone to cause thromboembolism or bleeding due to its narrow therapeutic window. The predominant polymorphisms in CYP2C9 and VKORC1 genes，encoding for metabolizing enzyme cytochrome P450 2C9（CYP2C9）and target enzyme vitamin K epoxide reductase complex subunit 1（VKORC1），have significant impact on individual differences in dose requirement.So the detection of CYP2C9 and VKORC1 mutation has important reference value to individualized therapy.At present，the usually detection methods of CYP2C9 and VKORC1 include PCR-RFLP，TaqMan，pyrosequencing，HRM，POCT，melting curve analysis，MS，DHPLC，and so on.The characteristics of these detection methods will be compared in this article to find out the most suitable technical detection methods for clinical application and promotion.

Warfarin；CYP2C9；VKORC1；Gene mutation detection

科技部國(guó)際科技合作與交流專(zhuān)項(xiàng)（2014DFA30900）；國(guó)家自然科學(xué)基金（81373476）

1.中南大學(xué)藥學(xué)院，湖南，長(zhǎng)沙410013 2.中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院臨床藥理中心，湖南，長(zhǎng)沙410013

陽(yáng)國(guó)平，E-mail：ygp9880@163.com