分子病理學技術(shù)在腫瘤診治中的應(yīng)用

董賀 孫青

·述評·

分子病理學技術(shù)在腫瘤診治中的應(yīng)用

董賀 孫青★

近幾十年來，新興學科——分子病理學的出現(xiàn)，使得人類對疾病特別是腫瘤的研究從器官、組織、細胞水平深入到蛋白、染色體和DNA水平。這不僅能為病理診斷提供更準確、更客觀的依據(jù)，且可更好地指導腫瘤的靶向治療和預后判斷等，極大地推動了病理學的發(fā)展。分子病理學的技術(shù)如免疫組化、原位雜交、基因突變檢測、生物芯片、流式細胞術(shù)等，已經(jīng)得到了廣泛應(yīng)用，并將在未來的醫(yī)療領(lǐng)域里扮演越來越重要的角色。本文就近年來分子病理學技術(shù)在腫瘤診治中的應(yīng)用進行綜述。

分子病理學技術(shù)；腫瘤診治

傳統(tǒng)病理學通常分為診斷病理學和實驗病理學。前者通過尸體解剖（autopsy）、活體組織檢查（biopsy）和細胞學（cytology）檢查對疾病做出最終診斷；后者則以動物實驗或在體外培養(yǎng)的細胞為材料進行研究。近幾十年來，隨著分子生物學、免疫學、遺傳學等學科的發(fā)展和免疫組化、原位雜交、流式細胞術(shù)等技術(shù)的應(yīng)用，極大地推動了病理學的發(fā)展，逐漸形成了一門新的分支學科——分子病理學，使得對疾病特別是腫瘤的研究從器官、組織、細胞水平深入到蛋白、染色體和DNA水平；并使形態(tài)學觀察從定性走向定位、定量，更具客觀性和可重復性。而分子病理學技術(shù)能為病理診斷提供更準確、更客觀的依據(jù)，從而更好地指導腫瘤的靶向治療和預后判斷等，是現(xiàn)代病理學發(fā)展的方向和必不可少的手段。下面就相關(guān)分子病理學技術(shù)在腫瘤診治中的應(yīng)用作簡要介紹。

1 免疫組織化學（immunohistochem istry，IHC）

免疫組織化學是在蛋白水平上，利用抗原抗體的特異性結(jié)合反應(yīng)檢測和定位組織和細胞中某種蛋白成分的技術(shù)。免疫組化技術(shù)有較高的特異性和敏感性，能同時將細胞成分定位與形態(tài)學改變結(jié)合起來，且直接在組織切片、細胞涂片或培養(yǎng)細胞爬片上檢測，結(jié)合計算機圖像分析等技術(shù)，可對被檢測物質(zhì)進行定量分析?，F(xiàn)在已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各種蛋白表達水平的檢測、細胞屬性和來源的判定、淋巴細胞的免疫表型分析、細胞增殖和凋亡的研究、激素受體和耐藥基因蛋白表達的檢測等。如對乳腺癌患者進行ER、PR、HER2的檢測可以判斷患者的預后和對靶向治療藥物（赫賽汀等）的敏感性及指導內(nèi)分泌治療［1］；進行ERCC、RRM 1、TS、TOPOIIA、β-tubulin-Ⅲ等耐藥基因蛋白表達的檢測，以預測其對抗腫瘤化療藥物如鉑類、吉西他濱、培美曲賽和紫杉醇類的療效等［2－3］。

2 原位雜交（in situ hybridization，ISH）

原位雜交是用經(jīng)標記的核苷酸片段作為探針，通過雜交直接在組織切片、細胞涂片或培養(yǎng)細胞爬片上檢測和定位某一特定靶基因存在與否的技術(shù)。ISH的原理是DNA變性、復性和堿基互補配對結(jié)合。根據(jù)探針標記物的不同，如熒光素、地高辛、生物素、放射性物質(zhì)等，又分為熒光原位雜交，顯色原位雜交，銀染原位雜交等。

2.1 熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）

FISH可以檢測基因（染色體）在較大的范圍內(nèi)發(fā)生的異常改變，如基因擴增、基因缺失、染色體轉(zhuǎn)位或染色體數(shù)目變化等，因其性能穩(wěn)定和結(jié)果直觀等優(yōu)點，已有很多商品化的試劑盒，如美國Vysis、北京金菩嘉、廣州安必平等。目前主要被用于乳腺癌和胃癌HER2基因擴增，尿路上皮癌、宮頸癌、淋巴瘤、白血病、性染色體的檢測和產(chǎn)前診斷。在免疫組化檢測乳腺癌和胃癌HER2蛋白表達意義不明確時，需做FISH檢測進一步驗證其有無HER2基因的擴增，以正確指導赫賽汀的應(yīng)用；此外還對化療以及疾病的預后預測有重要的指導意義［4］，是判斷HER2基因擴增的金標準。FISH一般采用雙色探針標記，其優(yōu)點是對比鮮明，紅色信號和綠色信號融合時可產(chǎn)生黃色信號，可用于一些融合或轉(zhuǎn)位基因的判斷。缺點是需配備熒光顯微鏡及采圖軟件（FISH工作站），且玻片不能長期保存。

2.2 顯色原位雜交（chromogenic in situ hybridization，CISH）

CISH的應(yīng)用也很廣泛，即一般意義的原位雜交。利用生物素和親合素系統(tǒng)標記探針和第一抗體，用辣根過氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP）標記第二抗體，以DAB系統(tǒng)顯色后，就可在組織切片上把目的DNA標記出來。如應(yīng)用原位雜交法檢測人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）、EB病毒（epstein-barr virus，EBV）等。原位雜交與免疫組化相比，具有高度特異性，尤其在無法得到可靠抗體時，不失為一種較好的檢測方法。在普通光學顯微鏡下即可觀察且能長期保存是其獨特的優(yōu)勢。缺點是操作步驟多，易出現(xiàn)不穩(wěn)定因素和人為差異［5］。

2.3 銀染原位雜交（silver in situ hybridization，SISH）

近年來發(fā)展起來的SISH技術(shù)，將銀沉淀和酶標記顯色方法相結(jié)合，把HER2基因標記為黑色信號，染色體著絲粒標記為紅色信號，標記過程在全自動免疫組化機上進行，并能在普通光學顯微鏡下觀察并判讀，且能永久保存，結(jié)果與FISH符合率高，可達94～99％［6－7］。隨著探針成本的降低其將具有更廣闊的應(yīng)用前景。

3 基因突變檢測

近年來興起的針對腫瘤的靶向治療，與傳統(tǒng)的化學療法相比，其特點在于能選擇性地殺傷腫瘤細胞，而對正常細胞低損傷或無損傷，具有高選擇性和不良反應(yīng)少的優(yōu)點。而實現(xiàn)有效靶向治療建立在檢測靶基因是否發(fā)生突變的基礎(chǔ)上。因此，基因突變檢測對指導腫瘤的靶向治療非常關(guān)鍵。其中有些已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用，如EGFR基因突變檢測易瑞沙和特羅凱等靶向藥物是否適用于非小細胞肺癌患者［8］，KRAS基因突變檢測西妥昔和帕尼等是否適用于結(jié)直腸癌患者［9］，KIT和PDGFRA基因突變檢測胃腸道間質(zhì)瘤患者是否會對靶向治療藥物伊馬替尼產(chǎn)生耐藥性［10］等。

基因突變是指染色體上一個位點內(nèi)遺傳物質(zhì)的變化，主要形式有點突變、缺失突變、插入突變、基因易位或重排、甲基化及其他方式導致的基因結(jié)構(gòu)異常?；蛲蛔儗е碌陌┗蛲蛔儭⒁职┗蚴Щ?、基因表達失調(diào)等是腫瘤發(fā)生的重要因素。目前檢測基因突變的方法有測序法、實時定量熒光PCR法、高分辨率熔解曲線法、擴增阻滯突變系統(tǒng)法等。

3.1 基因測序（gene sequencing，GS）

此技術(shù)能夠最真實地反映基因上的信息，被普遍認為是分子診斷的金標準。目前已由經(jīng)典的Sanger測序發(fā)展到二代測序技術(shù)，如Roche公司的454技術(shù)、Illumina公司的Solexa技術(shù)以及ABI公司的SOLiD技術(shù)等；測序通量也急速提高，費用則大大降低［11－12］。相對于Sanger測序，其它方法盡管靈敏度或特異度有所提高，但只能針對一些已知的常見突變進行，不能用于檢測罕見或未知突變。而Sanger測序的缺點則是檢測過程比較繁瑣，耗時長；對標本中所含腫瘤組織的量要求比較高，且敏感性低，一般不能檢出低于20％的突變［13］。

3.2 高分辨率熔解曲線（high resolutionmelting，HRM）

HRM是一種在實時定量熒光PCR的基礎(chǔ)上，通過飽和染料監(jiān)測核酸的熔解曲線變化并進行分析的方法。單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNP）位點不匹配會使雙鏈DNA在升溫過程中先解開，熒光染料從局部解鏈的DNA分子上釋放，從熒光強度與時間曲線上就可以判斷是否存在SNP，而且不同SNP位點、雜合子與純合子等都會影響熔解曲線的峰形，因此HRM分析能夠有效區(qū)分不同SNP位點與不同基因型。HRM檢測無需使用序列特異性探針，不受突變堿基位點和種類的局限，具有高靈敏度、成本低、高通量等優(yōu)點，可應(yīng)用于突變篩選、基因分型等多方面［14－15］。由于HRM能夠?qū)螇A基差異進行區(qū)分，所以對溫度分辨率的要求相當高，需要特定的儀器或配件。Ma等［16］分別用直接測序法和HRM方法檢測了100例結(jié)直腸癌患者的KRAS基因突變，HRM方法可檢出11種突變類型，較測序法更為敏感，兩種方法的一致性達95％。

3.3 擴增阻滯突變系統(tǒng)（amplification refractory mutation system，ARMS）

ARMS法利用擴增阻滯突變的原理設(shè)計探針，如其中EGFR 29型的試劑盒涵蓋了EGFR基因的29個突變點，包括3種18外顯子突變、19種19外顯子突變、5種20外顯子突變和2種21外顯子突變等，能檢測絕大多數(shù)已知的EGFR基因突變類型。此法靈敏度高，能檢出1％的常見突變，尤其是對于腫瘤細胞含量較少的樣本，如穿刺、體液樣本等具有很大的優(yōu)勢［17］；且其操作簡便，耗時短，若與Sanger測序聯(lián)合應(yīng)用將使診斷更全面可靠。

4 生物芯片

生物芯片技術(shù)是近來影響深遠的重大科技進展之一，是融生物學、微電子學和計算機科學等為一體的前沿技術(shù)。該技術(shù)將高密度的核酸、蛋白質(zhì)、組織等包被在硅片、玻片等固相支持物上，通過設(shè)計不同的陣列、使用特定的分析方法可使該技術(shù)具有多種不同的用途，如基因表達譜研究、基因突變檢測、多態(tài)性分析、產(chǎn)前診斷、分子標志物篩選等，為功能基因組的研究及醫(yī)學診斷的發(fā)展提供了有力的工具。

4.1 基因芯片

采用基因芯片可分析患者和腫瘤高發(fā)人群的基因表達譜，并與正常對照組進行比對，為發(fā)現(xiàn)腫瘤致病基因提供線索；同時通過檢測突變基因，還對具有發(fā)生腫瘤風險的個體提前預警；并使基于廣泛基因表達分析的腫瘤分類方法成為可能，以區(qū)分利用常規(guī)手段難以辨明的腫瘤，提高了診斷的準確率［18］。在產(chǎn)前診斷方面，基因芯片由于成本限制，尚未成為主流手段，但其相對于傳統(tǒng)產(chǎn)前檢測技術(shù)，仍具有高分辨率的優(yōu)勢和廣闊的前景［19］。

4.2 蛋白質(zhì)芯片

蛋白質(zhì)芯片技術(shù)為腫瘤標志物的聯(lián)合檢測提供了理想工具?，F(xiàn)已有多篇文獻報道，利用蛋白質(zhì)芯片來檢測腫瘤相關(guān)的血清蛋白，并利用聯(lián)合診斷的方法對樣品進行分級［20－21］。如卵巢癌單個腫瘤標志物CA125已經(jīng)被IL-18、FGF-2和CA125聯(lián)合診斷所取代［22］。由于血清蛋白的變化受性別、激素水平及營養(yǎng)狀況等影響，而對腫瘤組織進行原位研究可以避免這些影響。Melle等［23］利用蛋白質(zhì)芯片系統(tǒng)和顯微切割技術(shù)分析頭頸部腫瘤組織及其鄰近淋巴結(jié)，找出了2個有顯著差異表達的蛋白，未來可以作為腫瘤診斷和預后判斷的新指標。

4.3 組織芯片

組織芯片將很多微小組織整齊地排列在一起，從而提供了一種高通量、大樣本以及快速的疾病形態(tài)學分析工具。組織芯片技術(shù)與傳統(tǒng)的病理學相結(jié)合，可做HE染色、特殊染色、免疫組化、原位雜交等。它的優(yōu)點是具有良好的內(nèi)對照和實驗條件的一致性。林茂松等［24］采集了54例直腸癌組織和40例癌旁直腸粘膜組織制成組織芯片，采用免疫組織化學染色方法檢測了多種蛋白因子的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)p53、CyclinD1、Bcl-2的異常表達與直腸癌的發(fā)生有關(guān)。

5 其他方法

5.1 流式細胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）

流式細胞術(shù)是利用流式細胞儀進行的一種單細胞定量分析和分選的技術(shù)，適用于單細胞懸液的樣本（可以是血液、體液和細胞培養(yǎng)懸液），它是免疫細胞化學、激光和計算機科學綜合的產(chǎn)物。流式細胞術(shù)在腫瘤診治領(lǐng)域現(xiàn)也得到了廣泛的應(yīng)用。DNA非整倍體的出現(xiàn)是癌前病變向早期癌變發(fā)展的一個重要指標。流式細胞術(shù)可測定DNA含量的變化，即DNA非整倍體的出現(xiàn)，對癌前病變的性質(zhì)及發(fā)展趨勢做出評估，有助于癌變的早期診斷。流式細胞術(shù)還可以應(yīng)用在白血病和非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin's lymphoma，NH）的分型方面。傳統(tǒng)形態(tài)學檢查是診斷白血病的基礎(chǔ)，但有局限性。當遇到形態(tài)學難以診斷的白血病，只有靠免疫分型來輔助診斷。目前白血病免疫分型主要用流式細胞術(shù)進行以下檢測：（1）急性淋巴細胞性白血?。╝cute lymphoblastic leukem ia，ALL）的類型及分化階段；（2）急性髓細胞性白血?。╝cutemyelocytic leukem ia，AML）的亞型；（3）診斷急性未分化白血病、一些少見類型白血病和混合型白血??；（4）指導治療和判斷預后等［25－26］。在臨床上，T淋巴細胞亞群分析對于腫瘤患者免疫功能的監(jiān)測具有重要的意義［27］。流式細胞術(shù)可以通過對腫瘤細胞和免疫細胞狀態(tài)的監(jiān)測來評估療效，從而調(diào)整治療方案［28］。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤干細胞是腫瘤耐藥性和復發(fā)的根源［29］。流式細胞術(shù)還可以通過針對腫瘤干細胞的特殊標記，將腫瘤干細胞分選出來，對其進行研究，以達到徹底治愈腫瘤的目的［30］。

5.2 PCR-反向點雜交法（PCR-reverse dot hybridization，PCR-RDH）

將PCR反應(yīng)產(chǎn)物與載有特定序列探針的膜條進行雜交以顯示出結(jié)果。可用于檢測HPV，對宮頸樣本、陰道分泌物、其他新鮮或石蠟活檢樣本，通過簡單的DNA提取、PCR、雜交幾個步驟，就能在膜條上對HPV分型。目前市場上有HPV 28型檢測試劑盒，能檢出15種高危型、3種疑似高危型和10種低危型。

5.3 實時熒光定量PCR（real time PCR，RT-PCR）

此方法利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移的原理，用熒光信號的強度定量檢測PCR產(chǎn)物，即模板DNA的拷貝數(shù)，在分子病理學中得到了廣泛應(yīng)用。如檢測結(jié)核桿菌等病原菌，能檢出最低103個拷貝數(shù)／m L，比傳統(tǒng)的特殊染色的檢出率提高很多。還有對非小細胞肺癌（non-small cell long cancer，NSCLC）的間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK）融合基因［31－32］用RT-PCR方法檢測，相對于FISH法來說，靈敏度更高，結(jié)果判斷更為客觀；缺點是樣本中RNA易降解，且易污染，對實驗室環(huán)境要求高［33］。RT-PCR也常用于對其他病原菌如肝炎病毒等的檢測［34－35］。

6 小結(jié)與展望

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個體化治療和靶向用藥是未來醫(yī)療的必然趨勢，而這均建立在對患者進行全面檢測的基礎(chǔ)上，如用免疫組化檢測細胞中蛋白的表達水平，用原位雜交和基因突變檢測分析細胞中核酸的含量及改變，用生物芯片來進行規(guī)?；姆治龊捅葘Φ鹊?。隨著醫(yī)療水平的提高和各種新技術(shù)的應(yīng)用，分子病理學必將在未來的醫(yī)療領(lǐng)域里扮演越來越重要的角色。

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The application ofmolecular pathological technology in the diagnosis and treatment of tumors

DONG He,SUN Qing★
(Department of Pathology,Qianfoshɑn Hospitɑl A ffiliɑted to Shɑndong University,Jinan,Shandong,China, 250014)

In recent decades,the development of molecular pathology has deepen people’s know ledge of disease and tumor from the level of organ,tissue,cell to the level of protein,chromosome and DNA.Themolecular pathological technology has greatly promoted the development ofmodern pathology by providing more precisive and objective evidence to guide the target therapy and prognosis of tumors.Molecular pathological technology has been w idely applied,such as immunohistochemistry,in situ hybridization,gene mutation detection,biochips,flow cytometry and so on.The molecular pathology w ill play amore and more important role in the futuremedical treatment.Here we summarize the application of molecular pathology technology in recent years in the diagnosis and treatment of tumors.

Molecular pathological technology；Diagnosis and treatment of tumors

國家自然科學基金（81272420）；山東省科技發(fā)展計劃（2011GSF11838）；山東自然科學基金（2R2012HM 085）；濟南市科技發(fā)展計劃項目（201202039）

山東大學附屬千佛山醫(yī)院病理科，山東，濟南250014

★通訊作者：孫青，E-mail：qingsw99＠163.com