直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者接受西妥昔單抗治療后出現(xiàn)K-RAS基因突變的檢測與治療探討

司海燕，王偉蘭，戴廣海

解放軍總醫(yī)院 腫瘤內(nèi)二科，北京 100853

西妥昔單抗是以表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)為作用靶點的嵌合性單抗，為目前常用的分子靶向治療藥物。研究表明，K-RAS基因突變可以導致結(jié)直腸癌患者對西妥昔單抗原發(fā)性耐藥[1]，因此《美國國立癌癥綜合網(wǎng)絡(NCCN)結(jié)直腸癌臨床實踐指南》2008版明確指出，所有轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者都應檢測K-RAS基因狀態(tài)，并且只有K-RAS野生型患者才建議接受西妥昔單抗治療。約25%的結(jié)直腸癌患者存在K-RAS基因突變，但文獻較少對K-RAS野生型晚期大腸癌患者在接受西妥昔單抗治療期間出現(xiàn)K-RAS基因突變報道。本文報道1例K-RAS野生型直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者在接受43個月西妥昔單抗治療后發(fā)生K-RAS突變的病例，并通過相關的文獻探討西妥昔單抗與K-RAS基因發(fā)生突變的關系，以了解西妥昔單抗的耐藥機制以及后續(xù)克服耐藥的策略。

資料和方法

1 資料 患者女性，70歲，確診直腸癌肝轉(zhuǎn)移4年余，直腸切除術后3年8個月，肝局部消融治療6個月、雙肺轉(zhuǎn)移2個月，為行進一步治療于2015年5月9日入院。

2 方法 針對此例K-RAS野生型直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者接受西妥昔單抗治療后出現(xiàn)K-RAS基因突變的臨床資料并文獻復習，進行2011年術后標本基因檢測及2014年肝轉(zhuǎn)移病灶基因檢測，對比檢測結(jié)果并制訂治療方案，觀察及評價治療效果。結(jié)果判讀：通過PCR的檢測方法，得出肝轉(zhuǎn)移病灶K-RAS基因位點61密碼子181C>A Q61K突變的結(jié)果。

3 PCR檢測 1)DNA提?。喝∈灠駱吮厩衅?，經(jīng)二甲苯及梯度乙醇脫蠟，加入蛋白酶K消化，按照操作說明書提取DNA，設計引物：第一外顯子上游引物5'-ACAGCACTCTGGCTATTT-3'，下游引 物5'-TATCAAAGAATGGTCCTG-3'。2)PCR擴增：PCR反應體系(總體系50 μl)包括10×PCR緩沖液，dNTPs 0.2 mmol/L，Taq DNA聚合酶2 U，基因組DNA 100 ng，MgCI21.5 mmol/L，引物各1 μmol/L，反應條件為94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)30次，最后72℃延伸5 min。3)電泳鑒定及陽性PCR產(chǎn)物測序：PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳純化鑒定后，用ABI 3130XL測序儀進行序列分析，測序文件經(jīng)軟件分析后進行結(jié)果判讀。

結(jié) 果

1 病理 2011年5月7日患者術前腸鏡活檢病理：(直乙交界)中－高分化腺癌。2011年8月30日腹腔鏡下行直腸癌切除術。術后病理：淺表潰瘍型腺癌，中分化，腫瘤大小1.5 cm×0.5 cm×0.5 cm，腫瘤侵及肌肉層，上、下切緣均未見癌。2014年10月29日肝轉(zhuǎn)移病灶穿刺活檢病理：(肝S7段、肝S8段交界近膈病灶)穿刺肝組織內(nèi)見中分化腺癌浸潤，結(jié)合病史考慮結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移可能性大。

2 影像學表現(xiàn) 2011年5月腹部超聲示：肝多發(fā)低回聲結(jié)節(jié)，轉(zhuǎn)移癌可能性大；乙狀結(jié)腸管壁增厚，直腸癌可能大。腹部CT：肝內(nèi)多發(fā)轉(zhuǎn)移瘤。結(jié)腸氣鋇雙重造影：乙狀結(jié)腸癌。2015年3月腹部MRI：肝新發(fā)轉(zhuǎn)移灶，肺CT：雙肺轉(zhuǎn)移。

3 手術 2011年8月30日行腹腔鏡下直腸癌切除術。

4 藥物治療 診斷明確后于2011年5 - 7月行5周期西妥昔單抗+奧沙利鉑+亞葉酸鈣+氟尿嘧啶方案術前轉(zhuǎn)化治療，治療后復查肝轉(zhuǎn)移病灶較前明顯縮小。于術后9 ~ 12個月行第6 ~ 11周期前述方案化療(第8周期后因經(jīng)濟因素停用靶向藥物)，2012年2月- 2013年4月行第12 ~ 29周期卡培他濱維持治療。2013年7月- 2014年5月因肝病灶增大更換為FOLFIRI、5-Fu、伊立替康方案＋西妥昔單抗靶向治療。2014年5 - 12月給予西妥昔單抗維持治療，后因肝轉(zhuǎn)移灶病理提示K-RAS基因突變停用西妥昔單抗。2014年10月復查肝病灶增大，2014年10月29日行“彩超引導下肝S7、S8段交界近膈病灶穿刺活檢手術+肝病灶消融治療”。2014年11月3日彩超引導下行第2次“肝病灶消融治療”。2015年3月因肝新發(fā)病灶、雙肺轉(zhuǎn)移更換為貝伐珠單抗+奧沙利鉑方案治療4周期。

5 基因檢測 2011年5月腸鏡活檢標本基因檢測：EGFR、K-RAS未見突變；2014年12月31日術后標本補查K-RAS基因檢測未見突變；2014年10月29日肝轉(zhuǎn)移病灶穿刺活檢標本基因檢測：K-RAS 61密碼子181C＞A Q61K基因位點突變，B-RAF、N-RAS未見突變。

6 療效評價 通過病理科將手術標本與肝轉(zhuǎn)移病灶穿刺標本進行RAS基因檢測，得出接受西妥昔單抗治療后出現(xiàn)K-RAS基因突變及一線治療無進展生存時間(progression free survival，PFS)43個月，二線治療PFS 2個月的結(jié)果，PFS顯著延長，病情得到有效控制。

討 論

西妥昔單抗是抑制腫瘤細胞EGFR的IgG1單克隆抗體，以比自然配體更高的親和力與EGFR結(jié)合，從而抑制自然配體與EGFR的結(jié)合，導致細胞表面受體及受體信號傳導下調(diào)。K-RAS基因突變是最常見的大腸癌相關基因改變之一。當K-RAS基因呈突變狀態(tài)時RAS蛋白持續(xù)活化，即使阻斷上游EGFR也無法調(diào)控下游事件的發(fā)生，因此腫瘤會持續(xù)生長、增殖甚至轉(zhuǎn)移。故一旦K-RAS基因突變，即可導致腫瘤對EGFR單抗耐藥[2-3]。因此，K-RAS基因突變型的結(jié)直腸癌患者不能從西妥昔單抗治療中獲益，而K-RAS野生型患者可以從西妥昔單抗治療中獲益。本例患者原發(fā)灶檢測為K-RAS野生型，應用西妥昔單抗治療3年余，證實該患者確實從西妥昔單抗的治療中獲益。

研究表明，EGFR抑制劑耐藥分為原發(fā)性耐藥和繼發(fā)性耐藥。原發(fā)性耐藥機制包括細胞內(nèi)參與EGFR信號轉(zhuǎn)導通路的K-RAS、NRAS、BRAF、PIK3CA、ERBB2、MET基因的突變，PTEN蛋白表達的缺失等[4-6]。繼發(fā)性耐藥機制大概劃分為二類：第一類是破壞了西妥昔單抗和EGFR連接的基因突變，如EGFR胞外域S492R的基因突變；第二類是繞過EGFR激活其下游信號途徑，如K-RAS或BRAF基因突變，MET或ERBB2的基因擴增等。研究顯示，EGFR抑制劑西妥昔單抗治療轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌(metastaticcolorectalcancer，mCRC)導致了繼發(fā)性耐藥。EGFR胞外域S492R的基因突變在未治療的CRC患者中沒有發(fā)現(xiàn)過，只在應用過西妥昔單抗治療的患者生物樣本中發(fā)現(xiàn)，也許是西妥昔單抗誘導了耐藥[7]。另有報道，西妥昔單抗的使用誘導了K-RAS基因的突變，導致繼發(fā)性耐藥[8-10]。由于腫瘤的異質(zhì)性，腸癌肝轉(zhuǎn)移患者腫瘤組織中大部分表現(xiàn)為K-RAS野生型細胞，同時有極少量的K-RAS基因突變細胞。西妥昔單抗使K-RAS野生型的細胞被殺死，K-RAS基因突變的細胞不斷生長引起繼發(fā)性耐藥。而化療藥物通常不會導致K-RAS基因發(fā)生突變。本例患者在西妥昔單抗應用43個月后出現(xiàn)K-RAS基因突變，考慮與西妥昔單抗誘導K-RAS基因發(fā)生突變導致繼發(fā)性耐藥有關。

有研究發(fā)現(xiàn)，PCR檢測接受西妥昔單抗治療腫瘤患者的外周血循環(huán)腫瘤細胞(CTCs)出現(xiàn)K-RAS突變通常較影像學提示腫瘤進展早10個月，因此可考慮作為早期檢測西妥昔單抗繼發(fā)性耐藥的重要手段[11]。MEK抑制劑可能逆轉(zhuǎn)K-RAS突變導致的西妥昔單抗繼發(fā)耐藥[12]。K-RAS突變是導致西妥昔單抗原發(fā)和繼發(fā)性耐藥的機制之一，隨著CTCs這一研究領域的不斷發(fā)展，檢測外周血循環(huán)腫瘤細胞可以盡早發(fā)現(xiàn)K-RAS基因突變狀態(tài)，盡早使用MEK抑制劑可能逆轉(zhuǎn)K-RAS突變導致的西妥昔單抗繼發(fā)耐藥。

通過檢索2011 - 2015年解放軍總醫(yī)院腫瘤內(nèi)二科日間病房4年100余例晚期結(jié)直腸癌患者病例，其中10例由病理科進行原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移病灶RAS基因檢測，目前僅此1例經(jīng)治療后出現(xiàn)K-RAS基因突變，提示增加送檢率及再次穿刺轉(zhuǎn)移病灶進行基因檢測的必要性。

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