宮瘤消膠囊對子宮肌瘤大鼠子宮平滑肌血管內皮生長因子及其受體表達的影響

李 楠 賀豐杰 李小寧 朱虹麗 陳 梅

(陜西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院婦科，咸陽市 712000，E－mail:linan_80_311@163.com)

迄今為止子宮肌瘤發(fā)生的確切病因尚未明了，但雌、孕激素在其發(fā)生過程中的作用已得到廣泛認可。有研究表明雌孕激素通過介導局部血管生長因子調控血管通透性及血管生成來促進肌瘤的生長并導致臨床癥狀的出現(xiàn)［1－6］。血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是主要的血管生成促進因子，在子宮肌瘤組織的血管生成中起著核心作用。筆者前期實驗已證實宮瘤消膠囊能夠調節(jié)雌、孕激素水平，影響靶器官中雌激素受體、孕激素受體的含量，抑制靶細胞對性激素的反應。目前，宮瘤消膠囊發(fā)揮抑瘤、縮瘤及預防復發(fā)的作用是否與調控VEGF 及其受體的表達有關尚無定論。本文旨在探討宮瘤消膠囊對子宮肌瘤模型大鼠VEGF 及其受體表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與實驗動物

1.1.1 藥物與試劑:宮瘤消膠囊［山東步長神州制藥，批號131107;組成:牡蠣、香附(制)、三棱、莪術、土鱉蟲、仙鶴草、黨參、白術、白花蛇舌草、牡丹皮、吳茱萸;規(guī)格0.5 g/粒，20 粒/板，3 板/盒］、桂枝茯苓膠囊(江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，批號:130907;組成:桂枝、茯苓、牡丹皮、桃仁、白芍;規(guī)格:0.31 g/粒，10 粒/板，6 板/盒)、苯甲酸雌二醇(赤峰博恩藥業(yè)，批號140201;規(guī)格:4 mg×10 支)、黃體酮注射液(浙江仙琚制藥，批號140116.1;規(guī)格1 ml:20 mg×10支);VEGF、VEGF 受體1(vascular endothelial growth factor receptor 1，VEGFR1)、VEGF 受 體2(vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2)單克隆抗體(批號:bs－1665R，bs－1774R，bs－1932R)，購自博奧斯公司;聚偏二氟乙烯膜、辣根過氧化酶標記二抗(K－5007)購自Dako公司;二喹啉甲酸蛋白定量試劑盒購自凱基公司。

1.1.2 實驗動物:清潔級雌性SD 大鼠60 只，未經生育交配，體重(200.0±20.0)g，購自第四軍醫(yī)大學實驗動物中心，合格證號:SCXK(軍)2012－0007。飼養(yǎng)環(huán)境:陜西中醫(yī)藥大學中藥藥理實驗室，室溫(20.0±2.0)℃，動物自由攝食、飲水，普通飼料喂養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠子宮肌瘤模型的建立與分組:大鼠適應性喂養(yǎng)1 周后，按隨機數字表法分為正常對照組、模型組、桂枝茯苓組和宮瘤消小劑量、中劑量、大劑量組，每組10只。模型組、桂枝茯苓組和宮瘤消小劑量、中劑量、大劑量組腹腔注射苯甲酸雌二醇注射液0.5 mg/kg，連續(xù)25 d，后改為腹腔注射黃體酮注射液4 mg/kg，連續(xù)5 d，即可建立子宮肌瘤模型。正常對照組腹腔內注射滅菌花生油0.5 mg/kg，連續(xù)30 d。

1.2.2 處理方法:正常對照組和模型組每日灌以生理鹽水，10 ml/kg，各組均1 次/d。宮瘤消膠囊成人用量為0.5 g/粒，每日3 次，每次4 粒;桂枝茯苓膠囊成人用量為0.31 g/粒，每日3 次，每次3 粒。桂枝茯苓膠囊組按照70 kg 體重成人與大鼠體表面積折算的等效劑量，大鼠的等效劑量相當于成人的6.3 倍，0.25 g/kg 為該組每只大鼠每日灌胃總生藥量，以10 ml/kg的標準計算出每只大鼠每日灌胃總體積，以此體積的生理鹽水溶解總生藥。宮瘤消小劑量組:按照上述方法，計算出0.54 g/kg 為每日總劑量，相當于臨床劑量。宮瘤消中劑量組:按照上述方法，計算出1.35 g/kg 為每日總劑量，相當于臨床劑量的2.5 倍。宮瘤消大劑量組:按照上述方法，給予宮瘤消膠囊劑量3.38 g/kg 為每日總劑量，相當于臨床劑量的6.25 倍。造模結束后2 d，開始灌胃給藥，1 次/d，連續(xù)4周。各組大鼠于灌胃給藥干預后第4 周末分別脫臼處死動物，進行相關檢測。

1.2.3 子宮組織細胞超微結構觀察:處死大鼠后，剖腹沿子宮膀胱連接處剪取子宮，剝離洗凈，在子宮最膨大處取0.5 ～1.0 mm3大小子宮平滑肌，1%鋨酸固定2 h，逐級酒精脫水，將標本置于2%的乙酸異戊酯中3 h，干燥，采用電子顯微鏡(日立H－7650)觀察子宮組織細胞超微結構。

1.2.4 Western Blot 法 檢 測 子 宮 平 滑 肌 VEGF、VEGFR1、VEGFR2 的表達:子宮病理組織取材后，從子宮根部選取一段新鮮病變組織0.5 ～1.0 mm3(正常對照組取子宮相同部位等量正常組織)。將組織標本剪碎，經預冷的磷酸緩沖鹽溶液洗滌2 次，加入1 ml 總蛋白質提取液，勻漿，振搖冰浴30 min，應用低溫高速離心機，保持4℃，15 000 r/min 離心20 min，將上清液吸出后置入干凈環(huán)氧樹脂管，－30℃保存。取50 μl 上清液按BCA 蛋白測定試劑盒測定蛋白含量。樣品煮沸3 min。取50 μg 總蛋白的樣品液，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳電泳;電泳完成后進行電轉膜;轉膜結束后進行膜封閉和一抗、二抗孵育。聚偏二氟乙烯膜通過電化學發(fā)光法顯色，最后曝光于X 膠片上，常規(guī)顯影、定影。內參照為鼠抗人甘油三磷酸脫氫酶單抗(1 ∶5 000)。結果掃描保存至電腦，經采用Quantity One 軟件進行對特異蛋白條帶進行灰度掃描和定量分析處理，得出相對光密度值。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 17.0 軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以表示，多組均數比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD 法，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠子宮組織細胞超微結構觀察 正常對照組子宮平滑肌細胞排列整齊，呈梭形，胞質內細胞器正常，相鄰細胞連接緊密，細胞周圍膠原纖維排列規(guī)則，見圖1。模型組子宮肌瘤細胞顯著增生，體積增大;細胞核近似橢圓形，核體積增大，核仁較大;細胞內含有較豐富的肌微絲，線粒體增生，數目增多，粗面內質網擴張;細胞周圍可見大量增生、排列不規(guī)則的膠原纖維，見圖2。桂枝茯苓組細胞排列稀疏，輕度增生，核質比例失調，細胞器減少，胞質內線粒體輕度肥大增生，可見少量核糖體和擴張的粗面內質網，細胞周圍膠原纖維紊亂、堆積，見圖3。宮瘤消小劑量組細胞排列較稀疏，輕度增生，肌微絲不豐富，胞質內細胞器減少，線粒體和擴張的粗面內質網較少，部分線粒體呈空泡樣改變，細胞周圍膠原纖維度輕度增生、排列紊亂，見圖4。宮瘤消中劑量組細胞排列基本正常，體積略縮小，肌微絲較豐富，胞質內細胞器增多，見線粒體和擴張的粗面內質網，部分線粒體呈空泡樣改變，空泡較多，細胞周圍膠原纖維增生不明顯、排列較規(guī)則，見圖5。宮瘤消大劑量組細胞排列基本正常，體積縮小，部分核固縮，染色質邊集;細胞器基本接近正常，肌微絲含量較少，線粒體數目減少;膠原纖維增生不明顯，排列基本規(guī)則，見圖6。

2.2 各組大鼠子宮平滑肌VEGF、VEGFR1、VEGFR2 的表達情況 各組大鼠子宮平滑肌VEGF、VEGFR1、VEGFR2的表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)。除宮瘤消大劑量組VEGFR2 表達水平均高于正常對照組(P ＞0.05)外，模型組、桂枝茯苓組及宮瘤消各劑量組VEGF、VEGFR1、VEGFR2 的表達水平均高于正常對照組(P ＜0.05)。與模型組比較，宮瘤消小劑量組VEGFR2與之比較僅有下降趨勢，差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)，宮瘤消各劑量組VEGF、VEGFR1、VEGFR2 的表達水平均明顯低于模型組(P ＜0.05)。桂枝茯苓組除了VEGFR2的表達水平低于模型組(P ＜0.05)外，VEGF、VEGFR1的表達水平與模型組比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)。宮瘤消小劑量組VEGFR2 的表達水平與桂枝茯苓膠囊組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)，各劑量宮瘤消組VEGF、VEGFR1、VEGFR2 的表達水平均明顯低于桂枝茯苓組(P ＜0.05)。見表1。

圖1 正常對照組子宮組織細胞超微結構(×8 000)

圖2 模型組子宮組織細胞超微結構(×8 000)

圖3 桂枝茯苓膠囊組子宮組織細胞超微結構(×8 000)

圖4 宮瘤消小劑量組子宮組織細胞超微結構(×8 000)

圖5 宮瘤消中劑量組子宮組織細胞超微結構(×8 000)

圖6 宮瘤消大劑量組子宮組織細胞超微結構(×8 000)

表1 各組大鼠子宮平滑肌VEGF、VEGFR1、VEGFR2 的表達情況，ng/L)

表1 各組大鼠子宮平滑肌VEGF、VEGFR1、VEGFR2 的表達情況，ng/L)

注:與正常對照組比較，#P ＜0.01，與模型組比較，*P ＜0.01。

組別 nVEGF VEGFR1 VEGFR2宮宮宮正 桂瘤瘤瘤常模枝消消消對型茯小中大照組苓劑劑劑組 組量量量 組組組 111111 000000 000 00 0.....321.440167 60 9±±±±±±000 00 0.....000.000745 41 3###***##000 00 0.....321.440298 00 9±±±±±±000 00 0.....000.00864 0619#####*** 00 000 0.....1.1 3337 0 0 846 8±±±±±±00 000 0.....0.0 000 0 12 616 1#*###*F 值 204.053 40.898 140.419 P 值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

3 討 論

子宮肌瘤為女性生殖系統(tǒng)最常見的良性實體腫瘤，其發(fā)生發(fā)展是一個多因素參與的過程，其病因錯綜復雜，涉及種族、性激素、生長因子、癌基因等多個環(huán)節(jié)。雖然病因尚未明確，但目前已公認子宮肌瘤是性激素依賴性腫瘤，雌激素、孕激素與其受體之間的相互作用是子宮肌瘤生長的基礎和促進因素。因此，本研究采用外源性雌孕激素負荷法制造大鼠子宮肌瘤動物模型。通過電鏡觀察到正常對照組大鼠子宮平滑肌細胞排列整齊，胞質內細胞器正常，膠原纖維排列規(guī)則;模型組大鼠子宮平滑肌細胞增生、體積增大，細胞內有豐富的肌微絲，細胞器數量增多，膠原纖維增生紊亂，提示模型組大鼠子宮肌層病理變化與人子宮肌瘤病理組織學結構類似，證實了模型復制成功。在給予不同劑量宮瘤消膠囊治療后，病理學結果顯示，平滑肌細胞的異常增殖受到抑制，部分膠原纖維的紊亂堆積情況得到逆轉。提示宮瘤消膠囊能有效改善雌、孕激素負荷大鼠子宮組織細胞超微結構改變。

足夠的血流供應及血管生成是腫瘤生長的必要條件，子宮肌瘤的生長同樣需要豐富的血供及血管形成。在各種腫瘤中均發(fā)現(xiàn)VEGF 的存在，無論是在體內還是體外研究中，VEGF 均被證實參與了腫瘤血管生成活動。VEGFR1 與VEGFR2 作為與VEGF 特異性結合的受體，是受體酪氨酸激酶家族中的主要成員，兩者與配體結合后能促進內皮細胞分裂增生及新生血管的形成，增加血管通透性，促進可溶解血管基底膜和間質纖維酶的表達，有利于新生血管的生長［7］。

在既往的研究中，有關VEGF 及其受體在子宮肌瘤發(fā)生中的作用報告較少。Harrison－Woolrych 等［8］通過PCR 技術發(fā)現(xiàn)瘤體平滑肌細胞中有VEGF mRNA 及VEGF 肽表達。隨后Hague 等［9］通過試驗將VEGF 表達進行定位，發(fā)現(xiàn)在子宮肌瘤瘤體的內皮細胞、血管平滑肌細胞以及平滑肌細胞中VEGF 呈現(xiàn)高表達。此后鐘一村等［10］通過對人子宮肌瘤中VEGF 及其受體表達的研究，發(fā)現(xiàn)VEGF、VEGFR1 與VEGFR2 蛋白在肌瘤組織中的表達明顯高于周圍正常肌層組織，并且在整個月經期都發(fā)揮著相同的作用，其表達量與肌瘤數量呈正相關。這些研究不但證實了VEGF、VEGFR1 與VEGFR2與肌瘤的發(fā)病密切相關，也揭示了與肌瘤病變程度的內在聯(lián)系。

本文結果顯示，與模型組比較，除宮瘤消小劑量組VEGFR2 表達水平與模型組比較差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)外，宮瘤消各劑量組VEGF、VEGFR1、VEGFR2的表達水平均明顯降低(P ＜0.05)，說明宮瘤消膠囊干預后，VEGFR1 與VEGFR2 的表達水平與VEGF 同步降低，這提示VEGFR1、VEGFR2 與VEGF 的表達水平相適應，對肌瘤的發(fā)病同樣具有重要作用。這種抑制效應提示中藥宮瘤消膠囊抑瘤、縮瘤、預防復發(fā)的作用與干擾VEGF/VEGFR 信號系統(tǒng)從而抑制內皮細胞增生、新血管形成，降低血管通透性，減少甚至阻斷子宮肌瘤血供，進而使瘤細胞萎縮或消亡有關。本文結果提示，小劑量宮瘤消組的VEGFR2 表達水平與模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)，提示其對VEGFR2 的抑制作用相對微弱，這反映了VEGFR2 的表達更活躍，可能對肌瘤的生長起到更大的作用，與肌瘤病變程度的內在聯(lián)系更緊密。隨著劑量的增加，宮瘤消膠囊對VEGFR2 的表達水平逐漸表現(xiàn)出顯著的降調節(jié)效應。其中，宮瘤消膠囊大劑量組對VEGFR2 的作用更為突出，數據顯示該組的VEGFR2表達水平接近正常對照組的水平。這為宮瘤消膠囊抑瘤、縮瘤的最低有效劑量的確定提供了參考。

綜上所述，宮瘤消膠囊對子宮肌瘤模型大鼠VEGF及其受體表達有明顯抑制作用，并能改善子宮肌瘤細胞超微結構。干擾VEGF/VEGFR 信號系統(tǒng)從而抑制內皮細胞增生、新血管形成，降低血管通透性，減少甚至阻斷子宮肌瘤血供，進而使瘤細胞萎縮或消亡可能是宮瘤消膠囊抑瘤、縮瘤、預防復發(fā)的機制之一。

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