治療性HPV DNA疫苗的研究進展

徐思慧，曹保利

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué) 研究生院，天津300193;2.天津南開醫(yī)院 婦產(chǎn)科，天津300100)

2008年在全世界范圍內(nèi)估計有53 萬宮頸癌新發(fā)病例，約有27萬人死于宮頸癌。宮頸癌是僅次于乳腺癌和結(jié)直腸癌的第三大女性常見的癌癥[1]。高危型人乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)持續(xù)感染是子宮頸癌發(fā)生發(fā)展最重要的致病因素[2]。目前，預(yù)防性HPV 疫苗已應(yīng)用于臨床，但是對于已經(jīng)感染HPV的婦女并沒有作用，因此治療性HPV DNA疫苗的研究逐漸成為近年來研究的焦點。

1 HPV 及致癌機制

1.1 HPV

HPV是一種雙鏈DNA 病毒。HPV的基因組功能區(qū)主要由早期區(qū)，晚期區(qū)和長控區(qū)組成。早期區(qū)包括E1，E2，E4，E5，E6和E7。E1 參與病毒DNA復(fù)制，E2 參與病毒基因的轉(zhuǎn)錄、復(fù)制及維護，E4 可能與病毒從宿主細胞釋放有關(guān)，E6 編碼抑制細胞周期的蛋白，可抑制促進細胞凋亡的P53 基因，E7 編碼與腫瘤抑制因子Rb 結(jié)合的蛋白，從而使細胞周期紊亂。晚期區(qū)包括主要衣殼蛋白和次要衣殼蛋白，編碼病毒晚期的結(jié)構(gòu)蛋白，形成完整的病毒顆粒。長控區(qū)位于E區(qū)和L區(qū)之間，調(diào)節(jié)病毒DNA 復(fù)制和基因表達[3-4]。

目前已識別的HPV 達200種，大約有40種左右通過性接觸感染生殖道。這些感染生殖道的HPV根據(jù)其致癌潛能，可以分為高危型和低危型，高危型HPV 導(dǎo)致的宮頸癌占所有宮頸癌的95%，其中HPV16和18是宮頸癌最常見的HPV類型，低危型HPV 可引起良性尖銳濕疣[2，5]。

1.2 HPV 致癌機制

高危型HPV表達癌基因E6和E7是導(dǎo)致宮頸上皮癌變發(fā)生的重要因素。HPV 基因序列與宿主細胞基因組整合，使E2 失活，進而使癌基因E6和E7 過表達，從而破壞細胞周期[6]。E6 蛋白可以與E6 相關(guān)蛋白(E6-associated protein，E6-AP)結(jié)合形成E3 泛素化酶，再與P53 蛋白結(jié)合，使P53 蛋白降解，從而使細胞周期失控而使細胞永生化[7-8]。在正常情況下，腫瘤抑制因子Rb 與p107、p130 和E2F形成復(fù)合物，來阻止靜止期細胞進入細胞周期，同時調(diào)節(jié)細胞凋亡和分化過程。而E7 蛋白可以與Rb結(jié)合，使Rb/E2F 復(fù)合物解離，解除Rb 蛋白的抑制作用，使靜止期細胞進入細胞周期，進而使細胞永生化[5]。

2 治療性HPV DNA疫苗

2.1 治療性HPV DNA疫苗的作用機理

治療性HPV DNA疫苗是將編碼HPV 抗原蛋白的DNA 直接導(dǎo)入機體內(nèi)，外源基因編碼目的蛋白，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生細胞免疫和體液免疫應(yīng)答。DNA疫苗被導(dǎo)入宿主細胞后，可在細胞內(nèi)表達抗原蛋白，一部分抗原蛋白在蛋白酶體降解成多肽，通過抗原肽轉(zhuǎn)運蛋白進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中，與主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ類分子和β2 微球蛋白結(jié)合，再運輸?shù)郊毎け砻?，供CD8+T 淋巴細胞識別，誘導(dǎo)細胞免疫反應(yīng)[9]。另一部分抗原蛋白在溶酶體降解成多肽，與主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ類分子結(jié)合，呈遞到細胞表面，激活CD4+T 淋巴細胞，誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。與此同時，在CD4+T 淋巴細胞輔助下，抗原蛋白刺激B 細胞產(chǎn)生中和抗體，誘導(dǎo)體液免疫[10]。

2.2 治療性HPV DNA疫苗的優(yōu)缺點

治療性HPV DNA疫苗優(yōu)點[11-13]:1)制作簡單，成本低;2)在室溫下性質(zhì)穩(wěn)定，熱穩(wěn)定性好，便于儲存和運輸;3)不需要佐劑;4)抗原持續(xù)表達，增強免疫記憶;5)不需要載體就能誘導(dǎo)免疫反應(yīng);6)可以重復(fù)給藥;7)相比于HPV 活病毒和細菌載體疫苗，DNA疫苗相對安全;8)可同時誘導(dǎo)體液免疫和細胞免疫。

治療性HPV DNA疫苗缺點[12，14]:1)轉(zhuǎn)染宿主細胞效率低，缺乏細胞類型特異性，并且不具備在體內(nèi)擴增和擴散到周圍細胞的能力，所以免疫原性低;2)外源的DNA 插入到宿主細胞基因組中有可能引起腫瘤抑制基因失活或原癌基因激活。

2.3 治療性HPV DNA疫苗改進方法

2.3.1 疫苗遞送途徑的選擇:簡單的DNA疫苗注射轉(zhuǎn)染效率低，而使用基因槍和電穿孔等方法可提高DNA疫苗導(dǎo)入細胞的轉(zhuǎn)染效率?；驑屴D(zhuǎn)染是在較高速度下用包裹DNA的金顆粒轟擊組織轉(zhuǎn)染細胞。而電穿孔是將細胞暴露在足夠高的電場中，使細胞膜通透性瞬時增加，促進宿主細胞對DNA疫苗的攝取，提高細胞免疫反應(yīng)。用電穿孔、基因槍和肌肉注射3種方法傳遞HPV DNA疫苗，結(jié)果顯示相比于肌肉注射，電穿孔和基因槍表現(xiàn)出更好的抗腫瘤性，電穿孔法產(chǎn)生數(shù)量最多的E7 特異性細胞毒性CD8+T細胞[15]。

2.3.2 增加免疫佐劑:接種治療性HPV DNA疫苗其功效是有限的。因此，可以通過使用免疫佐劑來增強疫苗的免疫應(yīng)答。HPV E7 DNA疫苗聯(lián)合白細胞介素-2(interleukin，IL-2)或IL-5 比單獨使用疫苗的抗腫瘤作用好，伴隨著干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)和細胞毒性T 淋巴細胞裂解活性的增加，IL-2作為佐劑效果優(yōu)于IL-5，而在HPV E7 DNA疫苗聯(lián)合IL-2的基礎(chǔ)上增加4-1BB 受體可將腫瘤治愈率由7%～27%提高至27%～67%，不僅提高了腫瘤治愈率，而且延長了腫瘤免疫記憶時間[16]。

此外，將高度優(yōu)化的CpG 基序插入到質(zhì)粒骨架中，用電穿孔技術(shù)傳遞HPV DNA疫苗給小鼠，通過Elispot 分析顯示IFN-γ 和顆粒酶B表達增強，使細胞免疫應(yīng)答增強，具有良好的抗腫瘤效果[17]。結(jié)核分枝桿菌熱休克蛋白70(heat shock protein 70，HSP70)和α-神經(jīng)酰胺可以作為佐劑，使HPV16 E7 DNA疫苗能誘導(dǎo)強烈的E7 特異性CD8+T細胞應(yīng)答，顯著提高抗腫瘤效應(yīng)[18-19]。

2.3.3 微粒包裹疫苗:用可生物降解的聚合物微粒ZYC101a 包裹HPV 16和18的編碼E6、E7 蛋白的質(zhì)粒DNA 片段，采用多中心、隨機雙盲對照方法，將組織活檢證實為CIN 2/3的女性隨機分成安慰劑組和ZYC101a 組，第一次注射后6個月，受試者行宮頸錐切術(shù)，在年齡小于25歲的女性中，ZYC101a 可促進CIN2/3的消退，并且ZYC101a 具有良好的耐受性和安全性[20]。

2.3.4 聯(lián)合放/化療:相比于單獨使用HPV DNA疫苗或單獨放射治療，低劑量放射與鈣網(wǎng)蛋白融合HPV 16 E7的突變型聯(lián)合治療表達E7的TC-1 腫瘤，在治療小鼠的腫瘤和脾中產(chǎn)生數(shù)量最多的E7特異性CD8+T細胞，并顯著增強了治療腫瘤作用[21]。化療藥物環(huán)磷酰胺可抑制調(diào)節(jié)性T細胞，從而使調(diào)節(jié)性T細胞無法抑制細胞毒性CD8+T細胞的功能，因此低劑量的環(huán)磷酰胺可增強HPV DNA疫苗的抗腫瘤作用[22]。此外，芹菜素與HPV16 E7-HSP70 DNA疫苗聯(lián)合治療TC-1 腫瘤使腫瘤細胞更容易溶解，通過產(chǎn)生最多數(shù)量E7 特異性CD8+T細胞從而達到有效的抗腫瘤目的。并且，在體外通過增加芹菜素的劑量可增強使腫瘤細胞凋亡的作用[23]。Toll 樣受體7 激動劑咪喹莫特和血管破壞劑5，6-二甲基占噸酮-4-乙酸(5，6-dimethylxanthenone-4-acetic acid，DMXAA)分別與治療性HPV DNA疫苗聯(lián)合使用可增強DNA疫苗誘發(fā)的抗腫瘤效果[24-25]。

2.3.5 其他:此外，優(yōu)化編碼子可有效改善HPV DNA疫苗效能。優(yōu)化編碼子的HPV DNA疫苗具有較高的免疫原性，并且已證明在動物模型中可誘導(dǎo)強烈的細胞免疫和體液免疫[13]。

3 展望

治療性HPV DNA疫苗具有廣闊的臨床應(yīng)用前景，但將治療性HPV DNA疫苗應(yīng)用于臨床，仍然需要提高其安全性和免疫原性。隨著研究的不斷深入和技術(shù)不斷完善與成熟，相信不久的將來可降低由HPV 感染所引起的宮頸癌發(fā)生率。

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