曲美他嗪和/或瑞舒伐他汀改善心肌梗死大鼠的心功能損傷

譚力力，劉麗敏，李 潞，趙紅麗

(沈陽醫(yī)學院 沈洲醫(yī)院 1.心血管一科， 遼寧 沈陽 110035； 2.干診二科， 遼寧 沈陽 110000)

?

研究論文

曲美他嗪和/或瑞舒伐他汀改善心肌梗死大鼠的心功能損傷

譚力力1，劉麗敏2*，李 潞1，趙紅麗1

(沈陽醫(yī)學院 沈洲醫(yī)院 1.心血管一科， 遼寧 沈陽 110035； 2.干診二科， 遼寧 沈陽 110000)

目的探討曲美他嗪和瑞舒伐他汀對心肌梗死(MI)的心臟保護作用。方法結(jié)扎左冠狀動脈前降支建立大鼠MI模型。大鼠分為假手術組、MI組、曲美他嗪+MI組、瑞舒伐他汀+MI組、聯(lián)合用藥+MI組。MI之后每天給予藥物治療14 d。測定血流動力學參數(shù)。TUNEL染色檢測凋亡指數(shù)。Evans/TTC雙染色測定心肌梗死面積。Western blot測定Bcl-2和Bax表達。結(jié)果與假手術比較，MI大鼠LVSP、dP/dTmax及dP/dTmin均顯著降低(P<0.01)，LVEDP顯著性升高(P<0.01)。與MI組比較，曲美他嗪+ MI組、瑞舒伐他汀+ MI組和聯(lián)合用藥+ MI組的LVSP、dP/dTmax及dP/dTmin均顯著增加，LVEDP呈顯著性下降(P<0.05)。假手術組心肌中未見明顯心肌細胞凋亡。MI組心肌細胞凋亡指數(shù)顯著上升，且Bcl-2和Bax表達也有顯著增加，以Bax表達增加為主。藥物干預后，與MI組相比，心肌細胞凋亡顯著下降，Bcl-2與Bax表達均明顯下降，以Bax下降為主(P<0.05)，上述變化以聯(lián)合用藥組+ MI最明顯。結(jié)論心肌梗死后曲美他嗪和瑞舒伐他汀治療可以改善心功能，可能與抑制心肌細胞凋亡、調(diào)節(jié)Bax和Bcl-2表達有關。兩者聯(lián)合給藥療效更佳。

心肌梗死；凋亡；曲美他嗪；瑞舒伐他汀

心肌梗死指由于動脈粥樣硬化斑塊形成或冠狀動脈痙攣等導致心肌血供下降，最終導致心肌細胞死亡的過程，是臨床心內(nèi)科常見病、多發(fā)病。

他汀類藥物又稱為3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶 A(HMG-COA)還原酶抑制劑。HMG-COA 還原酶是膽固醇合成代謝中的關鍵限速酶，瑞舒伐他汀可競爭性抑制該酶的作用，使膽固醇合成減少，低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)清除增加，并有降三酰甘油作用[1]。他汀類藥物目前已經(jīng)成為心?；颊咧委煹某Ｓ盟帯Ｇ浪菏堑谝粋€臨床用于治療冠心病的代謝藥物，具有抗缺血和抗心絞痛作用[2]。

本實驗通過建立大鼠心肌IPC模型，觀察心肌IPC對梗死面積及凋亡相關基因Bcl-2/Bax表達的影響，以及曲美他嗪和瑞舒伐他汀對細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

SPF級雄性SD大鼠，體質(zhì)量200 g，3～4月齡[北京維通麗華實驗動物有限公司，合格證編號SCXK(京2012-0001)]。曲美他嗪[施維雅(天津)制藥有限公司]；瑞舒伐他汀(阿斯利康制藥有限公司)；Bax 試劑盒、Bcl-2試劑盒和TUNEL試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 大鼠模型的建立及實驗分組：大鼠隨機分為3組：假手術組、MI組、MI+曲美他嗪(T)組、MI+瑞舒伐他汀(R)組和MI+T+R組，每組10只。假手術組大鼠行開胸術，分離冠狀動脈但不阻斷。MI組大鼠同時行冠狀動脈結(jié)扎。MI+T組和MI+R組分別每天給予曲美他嗪20和10 mg/kg瑞舒伐他??；MI+T+R組劑量減半，灌胃給藥，共14 d。

1.2.2 MI模型的建立：常規(guī)方法建立MI模型。

1.2.3 血流動力學參數(shù)的測定：常規(guī)記錄左室收縮壓(LVSP)、左室舒張末壓(LVEDP)、左室內(nèi)壓最大上升速率(dP/dTmax)及左室內(nèi)壓最大下降速率(dP/dTmin)。

1.2.4 心肌缺血面積及梗死面積測定：采用Evans/TTC雙染色法。切片顯示3種顏色，鉆紅色為正常心肌，藍色為梗死危險區(qū)心肌，灰白色為梗死心肌。實驗結(jié)束后，原位結(jié)扎冠狀動脈，80 mmHg壓力下經(jīng)主動脈逆行灌注1%的伊文思藍 (2～3 mL)。摘除大血管、心房及右心室，沿左心室長軸橫切心室為6～8片(厚約2mm)，然后仔細分離非缺血區(qū)和缺血區(qū)。將缺血區(qū)置于1% TTC磷酸緩沖液中，于37℃孵育15 min，此時壞死區(qū)呈灰白色，以此將壞死區(qū)從缺血區(qū)中分離，心肌梗死面積以壞死區(qū)心肌重量/缺血區(qū)心肌重量(AN/AAR)表示。

1.2.5 心肌細胞凋亡指數(shù)(apoptotoc index,AI)：取適量全層心肌組織，按常規(guī)病理組織學方法制備心肌石蠟標本，采用脫氧核糖核酸末端轉(zhuǎn)移酶介導的缺口末端標記法(TdT-mediated dUTP Nick End Labeling,TUNEL)檢測凋亡心肌細胞，按說明書操作。細胞系呈棕褐色或棕黃色顆粒且具備凋亡細胞形態(tài)學特征判定為凋亡細胞。光鏡下根據(jù)凋亡陽性細胞分布情況，每張切片拍攝5個陽性視野，每視野計數(shù)300個心肌細胞中的凋亡陽性細胞數(shù)，以陽性細胞數(shù)所占觀察心肌細胞的比例作為凋亡指數(shù)，即心肌細胞凋亡指數(shù)(%)=(凋亡心肌細胞系數(shù)/正常心肌細胞系數(shù))×100%。每組計數(shù)25個陽性視野(每組5張切片，各取5個陽性視野)，取平均值。

1.2.6 HE染色觀察心肌細胞：將剩余梗死心肌組織置于40 g/L中性甲醛液中固定，經(jīng)石蠟包埋后，取心臟冠狀面最大橫徑處切片，連續(xù)切片3張(厚4 μm)，用于HE染色，以觀察組織的大致形態(tài)、心肌細胞走向及心肌纖維化程度、細胞形態(tài)學及炎性細胞浸潤情況。

1.2.7 Western blot測定Bcl-2和Bax表達：提取總蛋白質(zhì)并進行定量。制膠，制備蛋白質(zhì)樣品并加樣，免疫印跡顯色，烤干保存硝酸纖維素濾膜或攝影，圖像分析儀測定條帶的吸光度值，并作定量分析。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 實驗動物的一般情況

大鼠在造模的過程中有一定的死亡，存活率為87.5%，主要死因為麻醉過量、大出血、惡性心律失常。

2.2 血流動力學結(jié)果

與假手術組比較，MI大鼠 LVSP、dP/dTmax及dP/dTmin均顯著降低，LVEDP顯著升高。與MI組比較，3個藥物干預組LVSP、dP/dTmax及 dP/dTmin均顯著提高，LVEDP顯著降低；上述指標的改善以 MI+T+R組更明顯(表1)。

2.3 各組大鼠心肌缺血重量及梗死重量的變化

心肌梗死后，大鼠缺血心肌重量(AAR)、梗死心肌重量(AN)以及AAR/LV均顯著增加(與假手術組組比：P<0.01)。藥物干預后，AAR、AN、AAR/LV和AN/AAR均顯著降低(與MI組比：P<0.05)。此外，與MI+R組和MI+T組相比，MI+T+R組AAR、AN、AAR/LV和AN/AAR改善更顯著(P<0.05)(表2)。

2.4 各組大鼠心肌細胞凋亡指數(shù)

與假手術組相比，MI大鼠的心肌凋亡細胞數(shù)顯著增多(P<0.01)，且陽性細胞呈灶性分布，尤其以MI組最多。當給予不同藥物干預后，與MI組相比，凋亡細胞數(shù)顯著減少(P<0.05)，以MI+R+T組減少最為明顯(圖1，表3)。

2.5 HE染色檢測心肌纖維化

假手術組大鼠心肌細胞形態(tài)正常，肌纖維排列致密、整齊，間質(zhì)成纖維細胞數(shù)量、形態(tài)正常(圖2A)。MI組大鼠心肌纖維排列疏松，間質(zhì)成纖維細胞顯著增生，膠原纖維增生、變粗，并且將心肌細胞分割呈網(wǎng)篩狀，可見少量炎性細胞浸潤(圖2B)。與MI組相比， MI+T組大鼠心肌纖維化程度顯著減輕，心肌細胞排列較為規(guī)整(圖2C)。與MI組相比，MI+R組大鼠心肌膠原成分顯明減少，排列較為規(guī)則(圖2D)。與MI組相比，MI+T+R組大鼠心肌膠原成分減少，但與假手術組大鼠相比仍存在纖維化改變(圖2E)。

表1 各組血流動力學參數(shù)Table 1 Hemodynamic parameters of all groups

*P<0.01 compared with sham group；#P<0.01 compared with MI+R group or MI+T group(1 mmHg=0.133 kPa).

表2 各組大鼠心肌缺血重量和梗死重量比較Table 2 Myocardial ischemia weight and infarction weight of all groups

*P<0.01 compared with sham group；#P<0.01 compared with MI+R group or MI+T group.

A.sham; B.MI; C.MI+T; D.MI+R; E.MI+R+T圖1 各組大鼠心肌細胞的TUNEL染色Fig 1 TUNEL stains in all groups (×400)

A.Sham; B.MI; C.MI+T; D.MI+R; E.MI+R+T圖2 各組大鼠治療后的心肌細胞HE染色Fig 2 HE stains after treatment in all groups (×400)

表3 各組大鼠心肌細胞凋亡指數(shù)Table 3 Apoptosis index of all groups

*P<0.01 compared with sham group；#P<0.01 compared with MI+R group or MI+T group.

2.6 Western blot檢測Bcl-2和Bax表達

正常大鼠心肌中Bcl-2和Bax低表達或不表達。MI能顯著增加Bcl-2和Bax蛋白表達(P<0.01)，以Bax蛋白表達增加為主，且MI組表達增加最明顯。給予大鼠藥物干預后，與MI組相比，Bcl-2與Bax表達均相應降低(P<0.01)，以Bax減少為主。MI+R+T組與MI+R組和MI+T組相比，Bcl-2與Bax表達明顯下降(P<0.01)(圖3)。

3 討論

冠狀動脈栓塞后的急性期，局部心肌出現(xiàn)微梗死灶，心肌細胞出現(xiàn)壞死和凋亡，凋亡相關基因Bcl-2/Bax表達也相應增加，心功能呈進行性下降[3]。

1.sham; 2.MI; 3.MI+T; 4.MI+R; 5.MI+R+T圖3 各組大鼠心肌中的Bcl-2和Bax表達Fig 3 Expression of Bcl-2 and Bax in all groups

表4 各組大鼠心肌中的Bcl-2和Bax表達Table 4 Expression of Bcl-2 and Bax in all groups

*P<0.01 compared with sham group；#P<0.01 compared with MI+R group or MI+T group.

本研究結(jié)果顯示，光鏡下，心肌梗死大鼠心肌梗死灶周圍區(qū)域可見凋亡細胞。給予藥物治療后，心肌梗死面積顯著縮小，凋亡細胞也明顯減少。血流動力學方面，藥物治療后，大鼠反應心臟收縮功能和左室收縮速率的指標有所提高，而反應心臟舒張功能的指標有所下降，說明藥物治療可以減輕心臟的僵硬度。

目前，心肌梗死的發(fā)病機制尚未完全闡明，通常認為與氧自由基增加﹑鈣超載﹑中性粒細胞浸潤、微血管損傷、細胞凋亡以及能量代謝障礙等有關[4]。離體和在體實驗表明，細胞凋亡是心肌梗死發(fā)病機制的一個重要環(huán)節(jié)。細胞凋亡的發(fā)生是由基因控制的，Bcl-2 家族[5]在細胞凋亡中起重要作用，其成員構(gòu)成一個復雜的網(wǎng)絡，調(diào)節(jié)細胞凋亡。Bcl-2在各種正常細胞發(fā)育過程中存在表達，而成熟和凋亡的細胞中不表達或低表達。Bax基因可能通過與Bcl-2基因本身或Bcl-2基因產(chǎn)物相互作用而發(fā)揮功能[5]。本研究發(fā)現(xiàn)，正常大鼠心肌中Bcl-2和Bax低表達或不表達，而心肌梗死大鼠Bcl-2和Bax蛋白表達明顯增強，以Bax蛋白表達增加為主。Bcl-2蛋白上調(diào)，從而其抑制心肌細胞凋亡的能力增加。給予藥物干預后，Bcl-2與Bax表達均相應降低，以Bax減少為主，說明干預細胞凋亡主要以抑制Bax表達為主。

他汀類藥物又稱 3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶 A(HMG-COA)還原酶抑制劑。HMG-COA 還原酶是膽固醇合成代謝中的關鍵限速酶，瑞舒伐他汀可競爭性抑制該酶的作用，使膽固醇合成減少，低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)清除增加，并有降三酰甘油作用[1]。研究發(fā)現(xiàn)，短期應用瑞舒伐他汀對大鼠缺血心肌有保護作用，主要是通過激活磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidyl inositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶 B(protein kinase B,Akt)信號通路，提高內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)的活性，增加 NO來實現(xiàn)的[4]。

曲美他嗪[2,6]是第一個臨床用于治療冠心病的代謝藥物，具有抗缺血和抗心絞痛作用。曲美他嗪能抑制β-脂肪酸氧化，抑制心肌對脂肪酸的攝取，并增加葡萄糖的氧化，導致游離脂肪酸向葡萄糖氧化的心臟代謝轉(zhuǎn)換，從而改善心肌能量利用，增加線粒體氧化代謝，減輕細胞內(nèi)酸中毒及鈉、鈣堆積，預防氧自由基引起的心肌細胞損傷。

本實驗顯示，給予瑞舒伐他汀和曲美他嗪干預后，心肌細胞AI、心肌血流動力學參數(shù)以及心肌纖維化程度均有一定的改善。同時，Bcl-2和Bax蛋白表達減少，而以Bax表達減少為主。需指出的是，瑞舒伐他汀與曲美他嗪聯(lián)合用藥組效果最好。說明瑞舒伐他汀與曲美他嗪干預在抑制心肌細胞凋亡、抑制心肌纖維化、改善血流動力學參數(shù)等方面有協(xié)同作用。

綜上所述，心肌細胞凋亡及其相關基因Bcl-2和Bax的表達介導了心肌缺血再灌注損傷，瑞舒伐他汀和曲美他嗪治療減少了心肌細胞的凋亡，而曲美他嗪與瑞舒伐他汀的聯(lián)合應用可顯著抑制Bax的表達，從而抑制心肌纖維化、心肌細胞凋亡和改善血流動力學。本研究的結(jié)果將為臨床防治心肌缺血再灌注損傷提供新的治療靶點。

[1] Dobre D,Rossignol P,Murin J,etal.Statin therapy and clinical outcomes in myocardial infarction patients complicated by acute heart failure:insights from the EPHESUS trial [J].Eur J Heart Fail,2012,7.

[2] Banach M,Rysz J,Goch A,etal.The role of trimetazidine after acute myocardial infarction [J].Curr Vasc Pharmacol,2008,6:282-291.

[3] Thielman M,Dorge H,Martin C,etal.Myocardial dysfunction with coronary microembolization:signal transduction through a sequence of nitric oxide,tumor necrosis factor-alpha and sphingosine [J].Cire Res,2002,90:807-813.

[4] Kato R,Foex P.Myocardial protection by anesthetic agents against ischemia-reperfusion injury:an update for anesthesiologists [J].Can J Anaesth,2002,49:777-791.

[5] Chao DT,Korsmeyer SJ.Bcl-2 family:regulators of cell death [J].Annu Rev Immunol.1998,16:395-419.

[6] Marazzi G,Gebara O,Vitale C,etal.Effect of trimetazidineon on quality of life in elderly patients with ischemic dilated cardiomyopathy [J].Adv Ther,2009,26:455-461.

The effect of trimetazidine and/or rosuvastatin on improving the cardiac function damage of rats with myocardial infarction

TAN Li-li1,LIU Li-min2*,LI Lu1,ZHAO Hong-li1

(1.Dept.of Cardiology,the Shenzhou Hospital Affilicated to Shenyang Medical College,Shenyang 110035;2.Cadres Clinics,Shenyang Medical College,Shenyang 110000,China)

Objective To investigate the cardioprotection of trimetazidine and/or rosuvastatin in rats with myocardial infarction (MI).Methods MI was introduced to SD rats by ligating the left anterior descending coronary.Rats were randomly assigned into following groups:sham group,Mi group,trimetazidine (T)+ MI group,rosuvastatin (R)+ MI group and T+ R+ MI group.After treatment for 14 days,all groups’ hemodynamic parameters were measured.Apoptosis index (AI) was detected by TUNEL staining.The myocardial infarction area was measured by Evans/TTC staining.The expression of Bcl-2 and bax was determined by Western blot assay.Results When compared with sham group,the LVSP,dP/dTmax and dP/dTmin of MI rats significantly reduced (P<0.01),but LVEDP markedly increased (P<0.01).When compared with the MI group,the LVSP,dP/dTmax and dP/dTmin in the T+MI group,R+MI group and T+R+MI group significantly increased,and the LVEDP dramatically reduced (P<0.05).The apoptosis index in the MI group significantly increased accompanied by marked increase in the expression of Bcl-2 and Bax,especially the Bax when compared with sham group.After treatment with T and R,the apoptosis index reduced and the expression of Bcl-2 and Bax decreased significantly,mainly the Bax.The above changes were the most evident in the T+R+MI group.Conclusions Treatment with T and/or R can improve the heart function of MI rats,which may be attributed to the reduction in the apoptosis index and decrease in the expression of Bax and Bcl-2 in the myocardium.The cardioprotection is the most obvious after treatment with T and R suggesting the synergistic effect.

myocardial infarction; apoptosis; trimetazidine; rosuvastatin

2014-04-28

2014-12-03

沈陽市科技局科技支撐項目(2011F11-264-1-48)

*通信作者(corresponding author)：lmliu@126.com

1001-6325(2015)03-0355-05

R542.2

A