液相色譜串接質(zhì)譜聯(lián)用快速分析肉食品中克侖特羅對映異構(gòu)體

王占良 張建麗 趙宇 張亦農(nóng)

國家體育總局反興奮劑中心食品藥品興奮劑檢測實(shí)驗(yàn)室（北京100029）

克侖特羅（Clenbuterol）化學(xué)名為2-[（叔丁氨基）甲基]-4-氨基-3，5-二氯苯甲醇鹽酸鹽， 商品名為克喘素、平喘素等，是一種人工合成的β2-腎上腺素受體激動劑。 由于可明顯促進(jìn)動物生長，并增加瘦肉率，在國內(nèi)的畜牧業(yè)中時有非法使用。 克侖特羅具有蛋白同化作用， 因此作為興奮劑被世界反興奮劑機(jī)構(gòu)（World Anti-Doping Agency，WADA）列入禁止運(yùn)動員使用的一種蛋白同化制劑[1]。 2013年，WADA頒布實(shí)施了新技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)[2]，規(guī)定尿樣中克侖特羅的最低檢測濃度為0.2 μg/L，與之前的標(biāo)準(zhǔn)[3]相比較，檢測限下降了一個數(shù)量級。經(jīng)人體試驗(yàn)研究證實(shí)， 運(yùn)動員食用了克侖特羅殘留濃度為0.1 μg/kg的豬肉或豬內(nèi)臟， 就會造成運(yùn)動員尿檢陽性[4]。 克侖特羅分子含有一個手性中心，R-（-）-克侖特羅和S-（+）-克侖特羅，比例各占50%，化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1。 據(jù)報(bào)道[5，6]，部分克侖特羅陽性的運(yùn)動員尿樣中的R-（-）-克侖特羅和S-（+）-克侖特羅的比例與化學(xué)對照品中比例有差異，R-（-）-克侖特羅在尿樣中的含量更高。 而目前克侖特羅對映異構(gòu)體的拆分主要利用高效液相色譜法、毛細(xì)管電泳法、薄層色譜法等，以上方法很難滿足肉食品樣品基質(zhì)復(fù)雜、快速檢測的要求。因此， 本研究采用液相色譜串接質(zhì)譜聯(lián)用分析肉食品中克侖特羅對映異構(gòu)體， 旨在建立快速的分析肉食品中R-（-）-克侖特羅和S-（+）-克侖特羅比例的方法，了解肉食品中的克侖特羅異構(gòu)體比值分布情況是否與標(biāo)準(zhǔn)品有差異。 為解析運(yùn)動員尿樣中克侖特羅的食源性來源提供證據(jù)。

圖1 R-（-）-克侖特羅和S-（+）-克侖特羅的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與裝置

Agilent 1200HPLC/6410A MS/MS液相色譜串接質(zhì)譜儀：美國安捷倫公司產(chǎn)品，配有電噴霧離子源（ESI）；Waters 20孔固相萃取裝置： 美國沃特世公司產(chǎn)品；Sigma X3R高速冷凍離心機(jī)：美國西格瑪奧德里奇公司產(chǎn)品；Ika T18分散機(jī)：廣州儀科實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司德國伊爾姆真空泵： 德國伊爾姆真空泵制造有限公司產(chǎn)品；Dri-block DB-3D氮?dú)獯蹈裳b置：英國TECHNE公司產(chǎn)品；MILIQ純水機(jī)：美國密理博公司產(chǎn)品。

1.2 主要材料與試劑

R-（-）-克侖特羅和S-（+）-克侖特羅購買自Toronto research chemicals inc.， 精密稱取配制成1 mg/ml的甲醇溶液，化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1；D9-克侖特羅購買自澳大利亞標(biāo)物中心， 精密稱取配制成1 mg/ml的甲醇溶液；氫氧化鈉、氨水、高氯酸為分析純：北京化學(xué)試劑廠產(chǎn)品；甲醇、甲酸銨：色譜純，美國DIKMA公司產(chǎn)品；50 ml螺口玻璃離心管、螺口玻璃試管、進(jìn)樣小瓶、進(jìn)樣小瓶鋁蓋：美國National公司產(chǎn)品；美國西格瑪奧德里奇公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Astec CHIROBIOTICTMT 150 mm×2.1 mm×5 μm；流動相為10 mmol/L甲酸銨的甲醇溶液；流速為0.4 ml/min； 柱溫20℃； 進(jìn)樣量10 μl； 樣品采集時間7 min。

1.3.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI），正離子模式，掃描方式為多反應(yīng)檢測方式（MRM），采集離子對見表1；干燥氣流速為10 L/min；干燥氣溫度300℃；霧化氣壓力40 psi。

1.4 肉樣前處理方法

肉樣200 g，切成直徑約1 cm的肉丁，準(zhǔn)確稱取10 g（誤差0.2 g）置于50 ml塑料離心管內(nèi)，加入質(zhì)量濃度為0.1 μg/ L的D9-克侖特羅50 μL、20%的甲醇水溶液10 ml，12000 rmp/min的轉(zhuǎn)速勻漿1 min，4 ml的純凈水清洗刀頭2次， 合并清洗液于樣品塑料離心管內(nèi)， 加入2 ml的濃高氯酸，蝸旋提取30 s，溫度-10℃下10000 rpm/min轉(zhuǎn)速離心8 min， 收集上層提取液于50 ml的塑料離心管內(nèi)，加入濃度12 Mol/L的NaOH溶液1.4 ml，調(diào)節(jié)PH在4 ± 1，待凈化。

MCX 6 cc 150 mg的固相萃取柱（6 ml的5%的甲醇氨，6 ml的甲醇，6 ml的水，6 ml的0.1 mMol/L的高氯酸溶液依次活化）， 將塑料離心管內(nèi)溶液全部上柱， 6 ml的甲醇淋洗，6 ml的5%的甲醇氨洗脫， 收集洗脫液，在溫度65℃下氮?dú)獯蹈桑?加入500 μL的流動相溶液溶解殘?jiān)?，?jīng)0.2 μm針頭濾器過濾后，待分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法優(yōu)化

克侖特羅在肉食品中主要以游離形式為主， 而且克侖特羅呈弱堿性，適合采取酸性提取，提取物中含有蛋白質(zhì)、脂肪等雜質(zhì)，基質(zhì)效應(yīng)明顯，采取MCX固相萃取柱純化后，基質(zhì)效應(yīng)明顯降低，見2.2圖2。 結(jié)果顯示，樣品采取酸性提取，MCX固相萃取柱純化， 基質(zhì)干擾少，可以滿足檢測要求。通過比較不同流速和柱溫對克侖特羅保留的影響， 結(jié)果顯示化合物隨流速的降低可以獲得更長的保留， 柱溫的降低可以延長保留時間并獲得更好的色譜分離。 經(jīng)過優(yōu)化，最終選擇流速0.4 ml/min，柱溫20℃。 通過比較不同碰撞能量下離子對響應(yīng)強(qiáng)度的變化，對R-（-）-克侖特羅和S-（+）-克侖特羅的質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果列于表1。

表1 克侖特羅的質(zhì)譜參數(shù)

2.2 方法專屬性

稱取約10 g的空白肉食品樣品， 分別添加了檢測限濃度S-（+）-克侖特羅、R-（-）-克侖特羅的肉樣，按照1.4方法進(jìn)行操作， 所得到的多反應(yīng)離子對監(jiān)測色譜圖示于圖2。 結(jié)果表明，R-（-）-克侖特羅和S-（+）-克侖特羅的特征離子對分離良好，相互間沒有影響和變化；R-（-）-克侖特羅和S-（+）-克侖特羅的出峰位置在空白樣品中無干擾峰出現(xiàn)，該方法具有較好的專屬性。

圖2 樣品中R-（-）-克侖特羅和S-（+）-克侖特羅的色譜分離圖

2.3 校準(zhǔn)曲線、檢出限及定量限

配制R-（-）-克侖特羅和S-（+）-克侖特羅質(zhì)量濃度為0.2～4 μg/kg的系列樣品各1份，經(jīng)1.4的前處理方法處理并儀器分析后，以R-（-）-克侖特羅和S-（+）-克侖特羅的定量離子色譜峰面積與D9-克侖特羅的定量離子色譜峰面積之比（Y）為縱坐標(biāo)，以分析物標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)做校準(zhǔn)曲線，線性方程結(jié)果見表2。由表2中數(shù)據(jù)可看出，各分析物校準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)平方均大于0.99，表明目標(biāo)分析物在質(zhì)量濃度0.2～4 μg/kg內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，且無背景干擾。

檢出限（LOD）和定量限（LOQ）采用向空白樣品中逐級降低加標(biāo)濃度的方法來確定。 以3倍信噪比（S/N=3）對應(yīng)的目標(biāo)物濃度作為檢出限，以S/N=10對應(yīng)的目標(biāo)物濃度作為定量限， 獲得的各目標(biāo)物的檢出限和定量限見表2。

表2 R-（-）-克侖特羅和S-（+）-克侖特羅的線性方程、檢測限和定量限

2.4 回收率、日內(nèi)及日間精密度

日內(nèi)精密度、日間精密度均是每個質(zhì)量濃度點(diǎn)做6個平行樣本，連續(xù)4天進(jìn)樣。表3是添加水0.2、0.6及4 μg/kg時的回收率、日內(nèi)及日間精密度。 由數(shù)據(jù)可以看出，R-（-）-克侖特羅和S-（+）-克侖特羅在3種添加水平下平均回收率為81.1%～110.2%， 日內(nèi)精密度為2.4%～5.4%，日間精密度為5.3%～7.8%，能夠滿足常規(guī)檢測需要。

表3 不同添加水平下各目標(biāo)物的加標(biāo)回收率、日內(nèi)及日間精密度（RSD）（n=6）

2.5 陽性樣品中克侖特羅異構(gòu)體比值情況

以R-（-）-克侖特羅的峰面積與內(nèi)標(biāo)中D9-R-（-）-克侖特羅的比值與S-（+）-克侖特羅內(nèi)標(biāo)中D9-S-（-）-克侖特羅的比值相比計(jì)算后確定為該樣品中克侖特羅異構(gòu)體比值。

在添加的0.4 μg/kg和2 μg/kg克侖特羅對照品的空白肉食品中， 經(jīng)計(jì)算其R構(gòu)型/S構(gòu)型的比值為1.00和1.02，與克侖特羅標(biāo)準(zhǔn)品中比值基本一致。 說明本方法可以真實(shí)反映和計(jì)算出肉食品中R構(gòu)型/S構(gòu)型的比值，證明該方法的可靠性和重現(xiàn)性。

采用本方法， 對實(shí)驗(yàn)室采集自全國各地的85例含有克侖特羅肉樣樣品進(jìn)行分析和計(jì)算，結(jié)果見圖3。R構(gòu)型/S構(gòu)型比值最大值為2.82，最小值為0.69，平均值為1.47。 在全部85例樣品中， 比值高于2的有14例， 占比16.5%；比值在1.47和2之間的有22例，占比25.9%；比值在1到1.47之間的有40例，占比47.1%；比值小于1的有9例，占比10.6%。 以上結(jié)果說明，接近90%的檢出克侖特羅的肉食品中，R構(gòu)型/S構(gòu)型比值高于1，證明現(xiàn)有主要受克侖特羅污染的肉食品中R構(gòu)型的濃度比S構(gòu)型的濃度更高。此結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道[6]的克侖特羅陽性運(yùn)動員的尿樣中R構(gòu)型和S構(gòu)型比值高于1是一致的，為證明運(yùn)動員尿液中克侖特羅的食源性來源提供了重要證據(jù)。

3 總結(jié)

本研究建立了液相色譜串接質(zhì)譜聯(lián)用法分析肉食品樣中R-（-）-克侖特羅和S-（+）-克侖特羅比值的檢測方法。 采用固相萃取柱純化，可顯著降低基質(zhì)效應(yīng)。該方法樣品前處理簡單、快速、可靠。

圖3 陽性肉食品中克侖特羅異構(gòu)體間比值（R構(gòu)型/S構(gòu)型）

[1] World anti-doping agency.WADA Prohibited list 2013. 2013：1-9.

[2] World anti -doping agency.TD2013 MRPL - Minimum Required Performance Levels.，2013：1-4.

[3] World anti -doping agency.TD2007 MRPL - Minimum Required Performance Levels. World anti-doping agency，2007：1-4.

[4] 張建麗，王占良，高照，等. 人體食源性鹽酸克倫特羅尿樣興奮劑陽性可能性研究 [J]. 中國運(yùn)動醫(yī)學(xué)雜志，2010，29（5）：580-583.

[5] Smith DJ. Stereochemical composition of clenbuterol residues in edible tissues of swine [J]. J Agr Food Chem，2000，48：6036-6040.

[6] Mario T，Andreas T，Simon B，et al. Does the analysis of the enantiomeric composition of clenbuterol in human urine enable the differentiation of illicit clenbuterol administration from food contamination in sports drug testing [J]. Rapid Commun. Mass Spetrom，2013，27：507-512.