小鼠S1PR3慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)

王 航，蔡克銀，黃 浩

(1.廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院干部病房二科，湖北 武漢 430070；2.深圳市合一康生物科技有限公司臨床醫(yī)學(xué)中心，廣東 深圳 513000)

·論 著·

小鼠S1PR3慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)

王 航1，蔡克銀1，黃 浩2

(1.廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院干部病房二科，湖北 武漢 430070；2.深圳市合一康生物科技有限公司臨床醫(yī)學(xué)中心，廣東 深圳 513000)

目的 構(gòu)建小鼠1-磷酸鞘氨醇受體3(S1PR3)慢病毒表達(dá)載體，并檢測(cè)其表達(dá)情況。方法小鼠心肌組織mRNA并逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，設(shè)計(jì)并合成引物，采用亞克隆方式將目的基因克隆至慢病毒表達(dá)載體pLent-IRES-EGFP中，將表達(dá)載體與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)293T細(xì)胞，進(jìn)行目的基因的過表達(dá)慢病毒包裝，隨后收集培養(yǎng)成功病毒，使用病毒感染小鼠L929細(xì)胞，檢測(cè)感染后L929細(xì)胞表達(dá)S1PR3情況。結(jié)果從小鼠心機(jī)組織cDNA中擴(kuò)增出大小約1 100 bp的目的片段；雙酶切后成功將S1PR3克隆到慢病毒表達(dá)載體pLent-IRES-EGFP，表達(dá)質(zhì)粒與包裝質(zhì)粒供轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后48 h就可以看到細(xì)胞中成功表達(dá)綠色熒光。收集培養(yǎng)成功病毒感染小鼠L929細(xì)胞，成功表達(dá)出S1PR3。結(jié)論本研究成功構(gòu)建了可以高表達(dá)S1PR3的pLenti6.3-S1PR3-IRES-EGFP慢病毒表達(dá)載體，為進(jìn)一步調(diào)控S1PR3相關(guān)的細(xì)胞功能奠定了基礎(chǔ)。

慢病毒；1-磷酸鞘氨醇受體3；血管損傷；再內(nèi)皮化

1-磷酸鞘氨醇(Sphingosine-1-phosphate，S1P)是鞘磷脂代謝過程中產(chǎn)生的一種重要的信號(hào)分子，S1P受體共有5型，而3型受體S1PR3，因?yàn)樵谘軆?nèi)皮損傷后修復(fù)的過程中有重要作用引起關(guān)注。研究表明，S1PR3可以募集中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞而共同參與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成[1]。我們應(yīng)用第三代慢病毒(Lentivirus)載體表達(dá)系統(tǒng)，成功構(gòu)建了高表達(dá)小鼠S1PR3的重組慢病毒，用于探索某些信號(hào)通路在血管內(nèi)皮損傷后的修復(fù)過程中的相關(guān)機(jī)理，為臨床防治AS提供可行的參考。

1 材料與方法

1.1 材料 Opti-MEM培養(yǎng)基和Trizol試劑購(gòu)自Invitrogen公司；限制性內(nèi)切酶、T4連接酶均購(gòu)自德國(guó)Sigma公司；小量質(zhì)粒純化試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；質(zhì)粒中量提取試劑盒、凝膠回收試劑盒均購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司；293FT細(xì)胞株購(gòu)自Invitrogen公司；DEPC、AMV反轉(zhuǎn)錄酶、dNTPs、Rnasin、TaqDNA聚合酶和DL2000 Marker為TaKaRa公司產(chǎn)品；哺乳類動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑盒POLO delivererTM3000購(gòu)自銳賽(上海)生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成 依據(jù)Genbank所公布小鼠基因的序列，我們?cè)O(shè)計(jì)了S1PR3上、下游引物，同時(shí)分別將酶切位點(diǎn)BamHⅠ及NheⅠ添加到目的片段的上、下游。引物由銳賽(上海)生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。

1.3 慢病毒表達(dá)載體pLenti6.3-S1PR3-IRES-EGFP構(gòu)建 正常小鼠心肌組織分離，提取mRNA并逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA模板，PCR擴(kuò)增目的片段。具體PCR體系如下：模板1 μl，引物各2 μl，MgSO4(50 mmol/L)1 μl，dNTP(10 mmol/L)1 μl，10×Buffer，5.0 μl，plentinum pfx polymerase(5 U/μl)0.2 μl，總體積50 μl。PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，68℃延伸60 s，共45個(gè)循環(huán)，隨后68℃5 min。待PCR結(jié)束，瓊脂糖凝膠電泳，并回收約1 100 bp的片段，使用NheⅠ、BamHⅠ對(duì)所回收PCR的片段與目的載體分別進(jìn)行酶切，具體酶切體系如下：10×Buffer 3 μl，PCR產(chǎn)物/目的質(zhì)粒1 μg，限制性內(nèi)切酶NheⅠ、BamHⅠ各0.5 μl，總體積30 μl，37℃酶切5 h，瓊脂糖電泳分離酶切產(chǎn)物，凝膠回收試劑盒回收目的片段。目的基因與載體基因的連接：連接體系如下：10×T4連接酶緩沖液1 μl，T4連接酶1 μl，目的條帶、載體酶切產(chǎn)物均各2 μl，總體積共為10 μl。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，氨芐(Amp)陽(yáng)性的LB平皿涂板，30oC培養(yǎng)10～12 h。挑選取單菌落，進(jìn)行菌落的PCR鑒定。具體PCR擴(kuò)增體系、循環(huán)程序如下：10×Buffer 1.5 μl，MgCl2(25 mmol/L)1.5 μl，dNTPs (10 mmol/L)0.5 μl，引物(10 mmol/L)各0.5 μl，Taq(5 U/μl)0.1 μl，總體積15 μl。循環(huán)條件如下：95℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸60 s，共45個(gè)循環(huán)，隨后72℃延伸5 min。將已鑒定為陽(yáng)性的克隆接種至LB液體培養(yǎng)基，搖菌10～12 h，并于第二天提取質(zhì)粒，隨后DNA測(cè)序以進(jìn)行鑒定。

1.4 重組病毒的包裝、擴(kuò)增 抽提質(zhì)粒的濃度在1 μg/μl左右，DNA的A260/A280在1.8～2.0之間。參照POLOdeliverer?3000 Transfection Reagent轉(zhuǎn)染流程，選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好的293細(xì)胞包裝病毒，將包裝質(zhì)粒、慢病毒表達(dá)載體pLenti-S1PR3-IRES-EGFP共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染之后48 h，第一次收集293T細(xì)胞培養(yǎng)的上清液；細(xì)胞換液后，繼續(xù)培養(yǎng)72～80 h，第二次收集培養(yǎng)的上清液，并與第一次所收集的病毒上清液相互混合。3 000 r/min離心10 min，除去細(xì)胞碎片。經(jīng)醋酸纖維素膜(0.45 μm)濾器將混合的上清液過濾至Beckman SW28離心管，收集濾液，每管分裝36 ml病毒。4°C 22 000 r/min離心2 h之后，小心取出離心管，吸棄上清液，然后于每管中分別加入預(yù)冷的DMEM 130 μl。待沉淀溶解完全后，收集病毒溶液，統(tǒng)一按照100 μl/管，分裝至1.5 ml EP管中。-80°C保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 慢病毒滴度測(cè)定 采用熒光顯微鏡直接觀測(cè)。將慢病毒濃縮液倍比稀釋，準(zhǔn)備生長(zhǎng)狀態(tài)良好的293細(xì)胞，每孔內(nèi)均添加無(wú)抗生素、含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)液400 μl。隨后，各孔再均添加終濃度為8 μg/ml(control細(xì)胞組除外)的Polybrene。將病毒原液倍比稀釋，各感染孔內(nèi)添加100 μl，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后，吸棄上清、更換培養(yǎng)基，加入10%FBS+1%P/S+1%Glutamax +500 μl DMEM繼續(xù)培養(yǎng)。熒光顯微鏡下觀察感染72 h后各組細(xì)胞熒光表達(dá)情況，通過計(jì)算各組GFP陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)，推算所制備的慢病毒滴度。

1.6 S1PR3表達(dá)檢測(cè) 選取培養(yǎng)的生長(zhǎng)狀態(tài)良好的小鼠L929細(xì)胞，待融合度達(dá)到50%后加入病毒原液及Polybrene促進(jìn)感染(終濃度為8μg/ml)。熒光顯微鏡下動(dòng)態(tài)觀察GFP的表達(dá)情況，并拍照、記錄。感染48 h后，棄上清，Trizol裂解細(xì)胞，提取RNA。DNaseI處理后，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用SYBR Green法熒光定量PCR檢測(cè)目的基因的表達(dá)情況?！鳌鰿t法計(jì)算各目的基因的相對(duì)表達(dá)定量，引物信息見表1。

表1 引物信息

2 結(jié)果

2.1 目的片段的PCR擴(kuò)增 使用引物BamHⅠ-F和NheⅠ-Ry從小鼠心肌組織cDNA模板中擴(kuò)增出S1PR3目的片段，并在目的片段上下游分別添加了BamHⅠ和Nhe1酶切位點(diǎn)，大小約1 100 bp，見圖1。

2.2 重組克隆的菌落PCR鑒定 挑取轉(zhuǎn)化產(chǎn)物單菌落，進(jìn)行菌落PCR鑒定重組質(zhì)粒。清晰可見大小約1 100 bp目的條帶，見圖2。

2.3 病毒包裝 選擇培養(yǎng)生長(zhǎng)狀態(tài)良好的293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后動(dòng)態(tài)觀察，轉(zhuǎn)染48 h的293T細(xì)胞中有明顯綠色熒光表達(dá)，見圖3和圖4。

圖1 目的片段的PCR擴(kuò)增法

圖2 pLenti6.3-S1PR3-IRES-EGFP重組載體菌落PCR鑒定

圖3 轉(zhuǎn)染后48 h，白光(×100)

圖4 轉(zhuǎn)染后48 h，熒光(×100)

2.4 目的基因表達(dá)檢測(cè) 使用培養(yǎng)好的病毒感染L929細(xì)胞，隨后使用Real time PCR法檢測(cè)感染后細(xì)胞的目的基因表達(dá)情況。可見重組病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞組中，目的條帶呈高表達(dá)；而空白載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞組中未見目的基因S1PR3的表達(dá)，見圖5和圖6。

圖5 S1PR3和內(nèi)參的溶解曲線

圖6 S1PR3目的基因表達(dá)情況

3 討論

S1P的特異性受體主要可分為5類(S1PR1-5)，它們均屬于G蛋白耦聯(lián)受體。心血管系統(tǒng)的多種細(xì)胞如內(nèi)皮細(xì)胞、vSMCs、巨噬細(xì)胞等均可不同程度表達(dá)S1PR1、S1PR2或S1PR3，S1PR1耦聯(lián)Gi，作用相對(duì)較單一；S1PR2、S1PR3則可與Gi、Gq、G12/13等蛋白耦聯(lián)，參與不同細(xì)胞內(nèi)各種信號(hào)通路的調(diào)控，具有多種重要的生物學(xué)效用。Walter等[2]發(fā)現(xiàn)S1P刺激EPCs后，CXCR4蛋白表達(dá)增強(qiáng)，EPCs的遷移和管型形成能力也增強(qiáng)，而該作用必須依賴于S1PR3的存在。

研究表明，S1PR3參與調(diào)節(jié)AS過程中損傷部位中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的募集[1]，促進(jìn)小鼠胚胎纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖[2]。然而，對(duì)于不同部位的vSMCs，S1PR3所發(fā)揮的生物學(xué)作用卻存在兩種完全相異的結(jié)果。Keul等[1]在使用頸動(dòng)脈結(jié)扎模型時(shí)發(fā)現(xiàn)，WT小鼠血管內(nèi)膜的損傷修復(fù)能力明顯優(yōu)于S1PR3-/-小鼠，這一結(jié)果顯示：S1PR3主要通過抑制vSMCs遷移、增殖，從而有效減少損傷后血管內(nèi)膜的增生。而Shimizu等[3]使用髂-股動(dòng)脈剝脫模型中意外的發(fā)現(xiàn)S1PR3-/-小鼠血管內(nèi)膜的損傷修復(fù)能力明顯優(yōu)于WT小鼠，這一結(jié)果則顯示：S1PR3對(duì)損傷后血管內(nèi)膜的增生起到了一定的促進(jìn)作用。他們分析認(rèn)為：小鼠頸動(dòng)脈S1PR3表達(dá)較低，而髂-股動(dòng)脈的S1PR3表達(dá)處于相對(duì)較高的水平，是導(dǎo)致兩種完全不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生的主要原因。細(xì)胞表面S1PR3表達(dá)的高低，可能是引起S1PR3信號(hào)激活后不同功能的重要原因，因此制備S1PR3高表達(dá)的病毒載體，調(diào)高原本低表達(dá)的細(xì)胞受體，是否能改變細(xì)胞的功能，值得進(jìn)一步探索。

目前，廣泛應(yīng)用于基因治療和研究的載體主要可分為兩大類：即非病毒類和病毒類[4-5]。非病毒載體的轉(zhuǎn)染效率相對(duì)較低、且在體內(nèi)表達(dá)不穩(wěn)定，因而應(yīng)用受到較大限制。而病毒載體具有轉(zhuǎn)染效率高、可在病毒調(diào)節(jié)信號(hào)控制下表達(dá)外源治療基因、能分離外源基因等特點(diǎn)，應(yīng)用較廣。其中逆轉(zhuǎn)錄病毒具備宿主細(xì)胞廣泛、對(duì)感染細(xì)胞毒性小、易有效整合入宿主細(xì)胞基因組，病毒顆粒可被機(jī)體免疫途徑降解、可與內(nèi)源性病毒重組等特點(diǎn)，體外制備過程中易于獲取較高滴度的病毒液，既可以感染分裂期的細(xì)胞又可以感染非分裂期的細(xì)胞，臨床及實(shí)驗(yàn)研究中應(yīng)用非常廣泛。

本研究成功地使用第三代慢病毒載體系統(tǒng)構(gòu)建了高表達(dá)小鼠的S1PR3的重組慢病毒載體，并成功收獲滴度較高的慢病毒。而將制備成功的S1PR3慢病毒感染小鼠L929細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)感染后的小鼠可以明顯明顯目的條帶表達(dá)，而感染空載體的細(xì)胞中，未見S1PR3表達(dá)，為進(jìn)一步調(diào)控S1PR3相關(guān)的細(xì)胞功能奠定了基礎(chǔ)。

[1]Keul P,Lucke S,von Wnuck Lipinski K,et al.Sphingosine-1-phosphate receptor 3 promotes recruitment of monocyte/macrophages in inflammation and atherosclerosis[J].Circ Res,2011,108(3): 314-323.

[2]Walter DH,Rochwalsky U,Reinhold J,et al.Sphingosine-1-phosphate stim μlates the functional capacity of progenitor cells by activation of the CXCR4-dependent signaling pathway via the S1P3 receptor[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2007,27(2):275-282.

[3]Shimizu T,De Wispelaere A,Winkler M,et al.Sphingosine-1-phosphate receptor 3 promotes neointimal hyperplasia in mouse iliac-femoral arteries[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2012,32(4): 955-961.

[4] Basner-Tschakarjan E,Bijjiga E,Martino AT.Pre-clinical assessment of immune responses to adeno-associated virus(AAV)vectors [J].Front Immunol,2014,5:28.

[5] Nair N,Kasai T,Seno M.Bacteria:Prospective savior in battle against cancer[J].Anticancer Res,2014,34(11):6289-6296.

Construction of the recombinant expression lentivirus vector carrying S1PR3 gene.

WANG Hang1,CAI Ke-yin1, HUANG Hao2.1.Second Department of Geratology,Wuhan General Hospital of Guangzhou Command,Wuhan 430070, Hubei,CHINA;2.Clinical Medical Center,Shenzhen Hornetcorn Biotechnology Co.Ltd.Shenzhen 513000,Guangdong, CHINA

ObjectiveTo construct the recombinant lentivirus vector carrying sphingosine-1-phosphate receptor 3(S1PR3)gene.MethodsThe fragment of S1PR3 gene from the cDNA of the cardiac muscle of mouse was cloned into the lentivirus vector pLent-IRES-EGFP.Then the recombinant vector and the Packaging Mix were cotransfected into the 293T cells.Filtered culture media were harvested and the viral titer was checked by observing the expression of green fluorescent protein(GFP).Mouse L929 cells were infected with the lentivirus and the expression of the S1PR3 of the L929 cells was detected by the real time PCR.ResultsA 1 100 bp fragment was amplified from cDNA of mouse myocardial tissue.Then after double enzyme digestion,S1PR3 was successfully cloned into the lentiviral expression vector pLent-IRES-EGFP.Green fluorescence was observed 48 h after transfection into 293 cells. L929 cells were collected and cultured successfully,and S1PR3 was successfully expressed.ConclusionThe recombinant lentivirus vector carrying S1PR3 gene(pLenti6.3-S1PR3-IRES-EGFP)with high expression of S1PR3 was constructed successfully in the mouse L929 cells successfully,laying basis for regulating S1PR3-related cell function.

Lentivirus;Sphingosine-1-phosphate receptor 3(S1PR3);Vascular injury;Reendothelialization

R-332

A

1003—6350（2015）18—2653—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.18.0967

2015-03-09)

國(guó)家自然科學(xué)基金(編號(hào)：81300153)

黃 浩。E-mail：didigoe@163.com