角膜潰瘍病原體篩選及耐藥性分析

王建芳

（張家口市第四醫(yī)院檢驗科，河北 張家口 075000）

角膜潰瘍病原體篩選及耐藥性分析

王建芳

（張家口市第四醫(yī)院檢驗科，河北 張家口 075000）

目的 篩選角膜潰瘍病原體菌種并分析病原體的耐藥性。方法選取2012年10月至2013年9月在我院就診的角膜潰瘍患者123例，取潰瘍組織標(biāo)本，篩選并鑒定菌種，采用濾紙擴(kuò)散法評價篩選菌種對常用抗生素藥物的敏感性。結(jié)果篩選到細(xì)菌菌種有綠膿桿菌、肺炎鏈球菌、莫拉－阿克森費爾德二氏桿菌和葡萄球菌；真菌菌種有鐮刀菌、曲霉菌和白色念珠菌。白色念球菌陽性者93例，陽性率為75.61%，陽性率最高；肺炎鏈球菌陽性者12例，陽性率為9.76%，陽性率最低。葡萄球菌和白色念球菌對9種抗生素的耐藥率均為60.00%，而肺炎鏈球菌和綠膿桿菌對3種抗生素的耐藥率均為20.00%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論角膜潰瘍病原體主要以細(xì)菌和真菌為主，且真菌的耐藥性較強(qiáng)。

角膜潰瘍；病原體；耐藥性；葡萄球菌

角膜潰瘍患者會有眼球周圍積膿，表現(xiàn)為白色、黃白色或灰白色潰瘍，隨著疾病進(jìn)展病情更加嚴(yán)重。潰瘍嚴(yán)重會直接影響患者視力，嚴(yán)重者會有眼部水腫[1]。目前治療方案以抗生素治療為主，主要是用于殺死角膜潰瘍的病原體(細(xì)菌和真菌)[2]，但大量的抗生素使用會引發(fā)病原體的耐藥性，從而造成抗生素?zé)o法發(fā)揮治療效果。有關(guān)病原體的耐藥性臨床上經(jīng)常出現(xiàn)，且呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢[3]。本文首先篩選了角膜潰瘍病原體細(xì)菌和真菌，并研究病原體的耐藥性，現(xiàn)報道如下：

1 資料與方法

1.1 材料 選取2012年10月至2013年9月在我院就診的角膜潰瘍患者123例，用無菌鑷子取每位患者眼角膜潰瘍處潰瘍組織，在無菌條件下放入盛有10 ml已滅菌的無菌水錐形瓶中，蓋上紗布，系緊瓶口，錐形瓶中有玻璃珠。震蕩錐形瓶，使?jié)兘M織充分與無菌水混勻，用于菌種篩選。

1.2 菌種篩選 將混勻的懸液進(jìn)行10倍稀釋，一直稀釋下去，將103、104、105、106、107、108、109和1010倍稀釋的菌液取0.5 ml，在超凈臺無菌條件下吸入細(xì)菌固體培養(yǎng)基和真菌PDA固體培養(yǎng)基中，分別用涂布棒涂平，然后細(xì)菌培養(yǎng)基培養(yǎng)皿放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～18 h，真菌PDA固體培養(yǎng)基放入28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h以上。挑取單菌落的培養(yǎng)皿，進(jìn)行單菌落分析以及1.4的菌種鑒定程序。

1.3 菌種鑒定 首先取細(xì)菌培養(yǎng)基上生長的菌落特征不同的菌落涂片進(jìn)行革蘭氏染色，鑒定細(xì)菌的革蘭氏特征。根據(jù)葡萄球菌、鏈球菌、腸球菌桿菌菌落特征進(jìn)行鑒定并統(tǒng)計，計算123例患者中各種細(xì)菌病原體陽性率。挑取PDA培養(yǎng)基上單菌落的真菌進(jìn)行鑒定，通過水片在較暗的視野下觀看，G染色為G+，菌體較大，通過芽管實驗鑒定出Cal，該菌占真菌分離的80%以上，可通過印度墨汁染色可以初步判斷為新隱球菌，其他真菌可通過生化實驗鑒定到種。最后根據(jù)文獻(xiàn)[4]描述方法進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，最終確定病灶處菌種種類。

1.4 耐藥性分析 將浸有藥物的濾紙圓片貼在瓊脂培養(yǎng)基上，藥物慢慢向四周擴(kuò)散。如果藥物能抑制微生物的生長，則藥物擴(kuò)散之處微生物便不會生長，形成圓形的不生長微生物菌落的圈。藥敏紙片均為英國Oxoid公司產(chǎn)品，包括一定濃度的氨芐西林、頭孢噻肟、頭孢哌酮、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢哌酮/舒巴坦、頭孢西丁、頭孢他啶、頭孢吡肟、環(huán)丙沙星、哌拉西林、亞胺培南、磺胺甲惡唑、慶大霉素、阿米卡星和碳青霉烯類。對藥物的敏感性分為三級：敏感、中等敏感、耐藥。三個等級相對于大腸埃希菌的抑菌圈直徑作比較得出，敏感：對抗生素的抑菌圈直徑與大腸埃希菌的抑菌圈直徑無顯著性差異；中等敏感：對抗生素的抑菌圈直徑是大腸埃希菌的抑菌圈直徑的50%及以上，且具有顯著性差異；耐藥：鮑曼不動桿菌對抗生素的抑菌圈直徑是大腸埃希菌的抑菌圈直徑的50%以下，具有顯著性差異。分別統(tǒng)計分離的不同菌種對以上各類抗生素的敏感性及耐藥的抗生素種類數(shù)量和比例。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，所有計數(shù)資料比較均采用χ2檢驗，以P＜0.05時表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 角膜潰瘍病原體篩選結(jié)果 篩選到細(xì)菌菌種有綠膿桿菌、肺炎鏈球菌、莫拉-阿克森費爾德二氏桿菌和葡萄球菌；真菌菌種有鐮刀菌、曲霉菌和白色念珠菌。其中綠膿桿菌陽性者61例(49.59%)、肺炎鏈球菌陽性者12例(9.76%)、莫拉-阿克森費爾德二氏桿菌陽性者45例(36.59%)、葡萄球菌陽性者35例(28.46%)、鐮刀菌陽性者73例(59.35%)、曲霉菌陽性者23例(18.70%)、白色念珠菌陽性者93例(75.61%)。

2.2 病原體耐藥性分析 將每種篩選的菌種對待測抗生素的敏感、中等敏感和耐藥情況進(jìn)行統(tǒng)計分析顯示，葡萄球菌和白色念球菌對9種抗生素的耐藥率均為60.00%，顯著高于肺炎鏈球菌和綠膿桿菌耐藥率(均為20.00%)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。

表1 病原體對15種抗生素的耐藥性分析[例（%）]

3 討論

角膜潰瘍是由于眼球因暴露空氣接觸細(xì)菌造成角膜被細(xì)菌、病毒或真菌感染，引起角膜處感染潰瘍，主要是由于異物損傷、剔除異物損傷、沙眼及其他原因造成的感染[5]。此外，維生素A缺乏、面癱、眼瞼閉合阻礙等也會引起角膜潰瘍[6]。在發(fā)病初期，癥狀表現(xiàn)為怕光、易流淚、眼痛、角膜處出現(xiàn)白色小點或片狀浸潤，嚴(yán)重時癥狀明顯，睜不開眼、視力減退、眼痛難忍等[7]，可見明顯灰白色組織壞死的潰瘍性脫落，并且伴發(fā)紫紅色充血。嚴(yán)重時會出現(xiàn)潰瘍向四周擴(kuò)散蔓延、角膜穿孔等癥狀。可見，角膜潰瘍對人體的傷害很大，需要深入了解并且采取合適的預(yù)防和治療方法。引起角膜潰瘍的病原體主要有細(xì)菌和真菌兩大類，不同類型病原體造成的危害不同，認(rèn)識和了解病原體有助于合理使用抗生素，達(dá)到快速較好的治療效果[8]。同時，抗生素耐藥性一直是抗生素臨床治療的瓶頸問題，角膜潰瘍病原體抗生素使用也不例外，因此了解病原體的耐藥性對于合理使用抗生素有很大的幫助作用。

有關(guān)角膜潰瘍病原體篩選和藥物敏感性報道很多，主要發(fā)現(xiàn)曲霉菌[9]、金黃色葡萄球菌[10]、綠膿桿菌[10]、茄病鐮刀菌[11]、白色念珠菌、肺炎鏈球菌、莫拉-阿克森費爾德二氏桿菌[12]等。本文篩選到的細(xì)菌菌種有綠膿桿菌、肺炎鏈球菌、莫拉-阿克森費爾德二氏桿菌和葡萄球菌；真菌菌種有鐮刀菌、曲霉菌和白色念珠菌，跟上述報道一致。王建芳[13]通過刮片收集了166例化膿性角膜潰瘍病例潰瘍標(biāo)本，篩選到的病原體55.45%為細(xì)菌，19.3%為真菌。趙懇等[14]通過藥敏試驗分析了篩選的病原體敏感性特征，結(jié)果得出細(xì)菌對藥物敏感，真菌較不敏感。耐藥性問題一直是抗生素臨床使用顧忌的問題，因此本文重點對本院接收的角膜潰瘍患者病灶中病原體進(jìn)行分離，并且鑒定病原體種類并分析每種病原菌對常見抗生素的耐藥情況。結(jié)果顯示，葡萄球菌和白色念球菌對9種抗生素耐藥，耐藥率均為60.00%，而肺炎鏈球菌和綠膿桿菌僅對3種抗生素耐藥，耐藥率均為20.00%，說明真菌的耐藥性較細(xì)菌高，此結(jié)果對指導(dǎo)角膜潰瘍抗生素用藥具有重要參考價值。

雖然本文明確了角膜潰瘍病原體種類以及耐藥性特征，但僅具有參考性價值。限于病例數(shù)量、區(qū)域差異以及醫(yī)院差異等因素，會出現(xiàn)結(jié)果不一致的情況，但值得肯定的是，角膜潰瘍患者病灶處的病原體有綠膿桿菌、肺炎鏈球菌、莫拉-阿克森費爾德二氏桿菌和葡萄球菌、鐮刀菌、曲霉菌和白色念珠菌，并且存在耐藥性。

[1]Knox CNE,Tole DM,Georgoudis P,et al.Peripheral ulcerative keratitis and corneal melt:a 10-year single center review with historical comparison[J].Cornea,2014,33(1):27-31.

[2]Alhassan MB,Rabiu M,Agbabiaka IO.Interventions for Mooren's ulcer[J].Cochrane Database Syst Rev,2014,1:CD006131.

[3]Mascarenhas J,Lalitha P,Prajna NV,et al.Acanthamoeba,fungal, and bacterial keratitis:a comparison of risk factors and clinical features[J].Am J Ophthalmol,2014,157(1):56-62.

[4]郁二蒙,畢香梅,謝 駿,等.攝食不同餌料草魚腸道菌群PCR-DGGE指紋圖譜構(gòu)建及分子鑒定[J].生物技術(shù)通報,2012, 9:179-184.

[5]Mamikonian VR,Voevodina TM,Fedorov AA,et al.Experimental and morphological study of the effect of antiangiogenic therapy on corneal neovessels[J].Vestn Oftalmol,2013,129(6):45-50.

[6]Alsalem JA,Patel D,Susarla R,et al.Characterization of vitamin D production by human ocular barrier cells[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2014,55(4):2140-2147.

[7]Galicia-Carreon J,Santacruz C,Hong E,et al.The ocular surface: from physiology to the ocular allergic diseases[J].Rev Alerg Mex, 2013,60(4):172-183.

[8]Dutta D,Ozkan J,Willcox MD.Biocompatibility of antimicrobial melimine lenses:rabbit and human studies[J].Optom Vis Sci, 2014,91(5):570-581.

[9]姚曉明,黎 明,聶丹瑤,等.曲霉菌在活體角膜潰瘍和培養(yǎng)菌落中的共焦顯微鏡比較[J].中國實用眼科雜志,2010,28(9): 954-957.

[10]張文華,潘志強(qiáng),王智群,等.化膿性角膜潰瘍常見致病菌的變遷[J].中華眼科雜志,2002,38(1):8-12.

[11]朱井麗,王守芹,馬伯書,等.茄病鐮刀菌引起角膜潰瘍1例[J].中國實驗診斷學(xué),2008,12(7):938.

[12]劉鳳華,雷玉琳,鄭秀云,等.棘阿米巴性角膜潰瘍一例[J].中國實用眼科雜志,2013,31(9):1214.

[13]王建芳.166例化膿性角膜潰瘍病病原體分析[J].河北北方學(xué)院學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2009,26(4):40-41.

[14]趙 懇,李 偉.植物外傷性角膜潰瘍病原體檢測及藥敏試驗65例臨床分析[J].咸寧學(xué)院學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2008,22(2):139-140.

R772.21

B

1003—6350（2015）03—0448—02

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.03.0162

2014-08-05)

王建芳。E-mail：2924073595@qq.com