133例乙型肝炎病毒X基因測序結(jié)果分析

高 慧，何金花，崔美玲，陳偉明，潘蓮娣

（廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院檢驗科，廣東 廣州 511400）

133例乙型肝炎病毒X基因測序結(jié)果分析

高 慧，何金花，崔美玲，陳偉明，潘蓮娣

（廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院檢驗科，廣東 廣州 511400）

目的 對乙型肝炎病毒(HBV)感染者血清標(biāo)本的HBV X基因進(jìn)行測序，以了解其突變情況。方法從廣州市番禺區(qū)133例HBV感染者的血清標(biāo)本中提取HBV DNA，以PCR方法擴(kuò)增HBV X基因，再進(jìn)行測序，根據(jù)患者不同病程將其分為乙肝攜帶組(ASC組)36例、慢性肝炎組(CHB組)40例、肝硬化組(LC組)34例和肝癌組(HCC組)23例，并對結(jié)果進(jìn)行綜合比較分析。結(jié)果人均堿基突變數(shù)ASC組為(5.17±0.86)、CHB組為(5.05±0.80)、LC組為(3.43±0.59)，HCC組為(2.05±0.44)，ASC組、CHB組和LC組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，而HCC組均低于ASC組、CHB組、LC組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；HBV X基因突變檢出率排前4位的位點是：A1762T聯(lián)合G1764A雙變異為85例(63.91%)，T1719G聯(lián)合G1721A同時變異為77例(57.89%)，T1544A為62例(46.62%)，T1753C為45例(33.83%)。前4位突變檢出率均在LC組中最高(P＜0.05)。結(jié)論對HBV X基因的高突變位點進(jìn)行檢測為肝硬化及肝癌的發(fā)病機(jī)制提供線索，對盡早預(yù)防和預(yù)測肝硬化及肝癌具有重要意義。

肝炎病毒；乙型；測序；X基因；基因型；變異；肝硬化；肝癌

乙型肝炎病毒簡稱乙肝病毒(HBV)，我國是乙肝感染的大國，發(fā)病率高，感染力強(qiáng)，各個年齡組均有乙肝病例發(fā)生，嚴(yán)重者可致肝癌[1-2]。HBV為雙鏈環(huán)形DNA病毒，雙鏈分別稱為正鏈、負(fù)鏈。負(fù)鏈有4個開放區(qū)，其中最小的開放讀碼框為X基因[3]，其變異可能具有重要生物學(xué)意義。最近許多國家地區(qū)都獨自進(jìn)行了HBV的基因突變與相應(yīng)地區(qū)肝癌(HCC)的相關(guān)性研究，結(jié)果顯示，突變的類型以及相關(guān)性，不同地區(qū)不盡一致[4-6]。廣州市番禺區(qū)尚未報道此具體情況，本文對僅來自廣州市番禺區(qū)的133例乙肝患者的血清標(biāo)本進(jìn)行基因測序，現(xiàn)將測序結(jié)果報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2011年6月至2013年6月本院傳染科門診及住院HBV DNA陽性患者133例，其中男性108例，女性25例，年齡19～78歲，均出生于廣州市番禺區(qū)，并在本區(qū)生活至今，將患者分為乙肝攜帶組(ASC組)36例，平均年齡(37±10.93)歲；慢性肝炎組(CHB組)40例，平均年齡(40±16.48)歲；肝硬化組(LC組)34例，平均年齡(52±10.16)歲；肝癌組(HCC組)23例，平均年齡(58±10.74)歲。四組患者的年齡比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《病毒性肝炎防治方案》[4]，肝癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)符合2001年修訂的《原發(fā)性肝癌的臨床診斷與分期標(biāo)準(zhǔn)》[7]，血清收集后于-70℃凍存至檢測。

1.2 HBV基因型序列 自美國國立生物技術(shù)信息中心基因庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/x85254.1)中下載B及C基因型各1個。

1.3 方法 血清HBV DNA提取采用經(jīng)典酚-氯仿抽提法，HBV X基因擴(kuò)增：上游引物序列5'-ctaggctgtgctgccaact-3'，下游引物序列5'-ggaaaaagttgcatggtgct-3'，PCR反應(yīng)體系為ddH2O 15.3μl、10×Bufffer 2.0μl、Template 1.0μl、Primer F 0.5μl、Primer R 0.5μl、dNTP 0.5μl、TransStartTaq Polymerase 0.2μl、Volume 20μl；PCR循環(huán)參數(shù)為預(yù)變性95℃5 min；95℃45 s、60℃45 s、72℃30 s，共9個循環(huán)；95℃45 s、57℃45 s、72℃30 s，共34個循環(huán)；延伸72℃5 min。PCR產(chǎn)物送至金唯智生物科技有限公司測序部進(jìn)行測序，測序結(jié)果與2個標(biāo)準(zhǔn)B及C基因型序列均不同的堿基即為突變堿基。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，人均堿基突變數(shù)兩兩比較采用t檢驗，多組比較采用方差分析，HBV X基因突變檢出率采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組人均堿基突變數(shù)比較 人均堿基突變數(shù)ASC組為(5.17±0.86)、CHB組為(5.05±0.80)、LC組為(3.43±0.59)、HCC組為(2.05±0.44)，ASC組、CHB組、LC組之間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(ASC與CHB：t= 1.176，P=0.996＞0.05；ASC與LC：t=1.044，P=1.000＞0.05；CHB與LC：t=0.992，P=0.999＞0.05)，HCC組均低于ASC組、CHB組和LC組(F=0.966，P=0.043＜0.05；F=0.910，P=0.003＜0.05；F=0.732，P=0.001＜0.05)。

2.2 突變點檢出率情況 133例患者HBV X基因共有29種突變，前4位突變檢出率的位點是A1762T聯(lián)合G1764A雙變異為85例(63.91%)，檢出率在LC組中最高(χ2=28.165，P=0.000＜0.05)；T1719G聯(lián)合G1721A同時變異為77例(57.89%)，檢出率在LC組中最高(χ2=7.853，P=0.049＜0.05)；1544A為62例(46.62%)，檢出率在LC組中最高(χ2=53.764，P= 0.000＜0.05)；T1753C為45例(33.83%)檢出率在LC組中最高(χ2=12.728，P=0.005＜0.05)，見表1。

表1 HBV X基因區(qū)突變的分布情況

注:核苷酸類G為鳥嘌呤；A為腺嘌呤；C為胞嘧啶；T為胸腺嘧啶。氨基酸類F為苯丙氨酸；L為亮氨酸；S為絲氨酸；Y為酪氨酸；C為半胱氨酸；P為脯氨酸；H為組氨酸；Q為谷氨酰胺；R為精氨酸；I為異亮氨酸；M為蛋氨酸；T為蘇氨酸；N為天冬酰胺；K為賴氨酸；S為絲氨酸；R為精氨酸；V為纈氨酸；A為丙氨酸；D為天冬氨酸；E為谷氨酸；G為甘氨酸。

3 討論

近年來國內(nèi)不斷有關(guān)于HBV X基因的突變情況以及突變與HCC的聯(lián)系的報道，大致如下：BCP(基本啟動子nt1742-1849)的突變研究主要集中在第二個AT富含區(qū)的突變熱點區(qū)，尤以A1762T及G1764A的聯(lián)合點突變?yōu)槌Ｒ姡Q為雙突變，可以減少HBeAg的表達(dá)，增強(qiáng)病毒的復(fù)制，在HCC患者中經(jīng)常會發(fā)現(xiàn)這種變異；CP(啟動子nt1643-1849)聚集變異導(dǎo)致HBV DNA轉(zhuǎn)錄有明顯激活作用的肝細(xì)胞核因子的結(jié)合位點的出現(xiàn)，對病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制具有明顯增強(qiáng)作用[5-8]。

在本組資料中，LC組中人均堿基突變數(shù)最高，HCC組最低，與文獻(xiàn)[9]報道HCC組突變率最高不同，其中一個原因可能是不同地區(qū)的人群遺傳背景不盡一致，HBV的基因突變也不盡相同，另一個原因可能是乙肝患者病情的進(jìn)展與HBV X堿基突變數(shù)量無關(guān)，而是與突變位置有關(guān)。

據(jù)報道，在HBV X基因的不同型別中，我國以B、C基因型為主[10-11]，本研究測序的結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)B基因型和C基因型對比，與兩者均不相同的堿基即為突變堿基。本組資料中，點突變率發(fā)生最高的是A1762T聯(lián)合G1764A雙變異，其中LC組中最高97.06%，其次是HCC組73.91%。已有很多報道[9-12]揭示該雙變異在肝硬化和肝癌發(fā)生中起促進(jìn)作用，本研究與該文獻(xiàn)基本吻合，但本研究中，但該雙變異在ASC組及CHB組中也不低，分別為50.0%及42.5%，該結(jié)果提示在廣州市番禺區(qū)，A1762T/G1764A雙突變除了在LC組及HCC組中有非常高的突變率，在ASC及CHB組中的突變也不低，這類人群是否最終發(fā)展為LC或HCC，還待進(jìn)一步跟蹤觀察。這類人群，尤其是ASC患者，常常因臨床癥狀不明顯，而忽視對病情的監(jiān)測及估計，建議本區(qū)的肝炎患者在條件許可下對該雙突變位點進(jìn)行檢測，以評估病情惡變的風(fēng)險。此外，在ASC組中有1例及HCC組中有2例A1762T單變異，在CHB組及HCC組各有1例G1764A單變異，這種單變異的臨床意義尚不明確，有待進(jìn)一步研究。

另一個熱點突變T1719G，此單突變在ASC組中檢出率(41.67%)最高，HCC組(8.7%)中最低(P＜0.05)，與文獻(xiàn)[9]吻合，該文獻(xiàn)報道T1719G突變能降低HBV的致病性和致癌作用，但是值得注意的是，T1719G聯(lián)合G1721A同時突變，LC組中則由T1719G單突變的11.76%上升至 T1719G聯(lián)合G1721A雙突變的76.47%，突變率最高，HCC組由8.7%上升至52.17%。G1721A單突變例數(shù)較少，只在CHB組有1例，LC組有3例，因其單突變并未導(dǎo)致氨基酸的種類改變(L116L)，應(yīng)該沒有臨床意義，T1719G單突變致病作用不大，但其聯(lián)合G1721A雙突變的致病性則大大增加，尤其是對肝硬化有促進(jìn)作用。這也說明，肝炎患者病情的進(jìn)展可能與堿基突變位置及其組合突變有關(guān)。

在本組資料中T1544A點突變在ASC組及CHB組的突變率30.56%及32.50%，LC組全部突變，突變率為100%，在HCC組則降到17.30%，提示，該點突變與肝癌的發(fā)生關(guān)系不大，與肝硬化的發(fā)生明顯相關(guān)，至于該點突變是否可作為肝硬化的特異性突變位點之一，還為言尚早，因為本研究LC組的人數(shù)為34例，還需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量才作結(jié)論。

本組資料中A1775G點突變，檢出率由ASC組、CHB組的36.11%及37.50%，上升至LC組的100%、HCC組的73.91%，因該點突變并未導(dǎo)致其所翻譯的氨基酸的改變(L134L)，可能單突變時無臨床意義，但不排除其聯(lián)合其他點突變時，則加大病程的進(jìn)展。

綜上所述，133例HBV患者血清HBV X基因突變復(fù)雜多樣，前4位有義突變點檢出率及人均突變點數(shù)均在肝硬化組中最高。這一結(jié)果顯示，在本地區(qū)這些熱點突變很可能促進(jìn)了肝炎向肝硬化方向的發(fā)展，對這些突變位點進(jìn)行檢測，可了解疾病的發(fā)展及預(yù)后，并為臨床治療提供參考。對于肝炎患者，包括HBV攜帶者，均應(yīng)長期觀察，定期復(fù)查，檢出并控制無癥狀的肝炎，從而獲得及時處理，延緩疾病的進(jìn)展。

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Sequencing analysis of hepatitis B virus X genes from 133 cases of patients.

GAO Hui,HE Jin-hua,CUI Mei-ling, CHEN Wei-ming,PAN Lian-di.Department of Clinical Laboratory,Panyu Center Hospital,Guangzhou 511400, Guangdong,CHINA

ObjectiveTo understand the mutation of hepatitis B virus X gene by gene sequencing from HBV infected serum.MethodsHBV DNAs were extracted from the serum of 133 infectors from Panyu area,and HBV X genes were amplified by PCR and then sequenced.According to the different courses of disease,patients were divided into four groups:36 cases of hepatitis B virus carrier(ASC),40 cases of chronic hepatitis(CHB),34 cases of liver cirrhosis(LC)and 23 cases of hepatocellular carcinoma(HCC).And the results were comprehensively and comparatively analyzed.ResultsThe mutation numbers per capita of four groups were as follows:ASC group(5.17±0.86), CHB group(5.05±0.80),LC group(3.43±0.86)and HCC group(2.05±0.44).And there were no statistically significant difference between the ASC group,CHB group and LC group(P＞0.05),while the number in HCC group was lower than that in the other three groups(P＜0.05).The top 4 sites of HBV X gene mutation detection rates were:85 cases of A1762T/G1764A double mutation(63.91%),77 cases of T1719G/G1721A simultaneous mutation(57.89%),62 cases of T1544A(46.62%)and 45 cases of T1753C(33.83%).The top 4 sites of mutation detection rates were all highest in LC group(P＜0.05).ConclusionDetection of the high mutation site of HBV X gene could help provide clues for studying the mechanism of liver cirrhosis and liver cancer,which also presents significant reference for clinical practice.

Hepatitis virus;Hepatitis B;Sequencing;X gene;Genotype;Variation;Liver cirrhosis;Hepatocarcinoma

R512.6+2

A

1003—6350（2015）07—1001—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.07.0357

2014-09-30)

廣州市番禺區(qū)科技計劃項目（編號：2012-Z-03-17）

高 慧。E-mail：gaohui5555@126.com