• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    腎癌患者手術前后血清miRNA-21的差異表達及意義

    2015-04-13 13:05:28阿不都熱扎克木拉提熱夏提王文光哈木拉提吐送閆昆吾王玉杰
    海南醫(yī)學 2015年7期
    關鍵詞:腎癌標志物曲線

    楊 益,阿不都·熱扎克,木拉提·熱夏提,王文光,哈木拉提·吐送,閆昆吾,王玉杰

    (新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院泌尿外科,新疆 烏魯木齊 830054)

    腎癌患者手術前后血清miRNA-21的差異表達及意義

    楊 益,阿不都·熱扎克,木拉提·熱夏提,王文光,哈木拉提·吐送,閆昆吾,王玉杰

    (新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院泌尿外科,新疆 烏魯木齊 830054)

    目的 觀察血清miRNA-21在腎癌患者中表達的差異,以篩選腎癌術后檢測指標。方法提取32例腎癌患者(術前一次,術后6個月一次)、20例健康人群(對照組)及15例腎臟良性腫瘤患者血清,采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)測量miRNA-21在各組的差異表達。結果不同民族、性別和年齡水平的腎癌術前患者,其血清miRNA-21的表達比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05),而血清miRNA-21在腎癌術前組、對照組及腎臟良性腫瘤組之間比較差異有統(tǒng)計學意義(Z=27.658,P=0.001),兩兩比較結果顯示:腎癌術前組與對照組比較(Z=腎細胞癌;微小RNA;血清;生物標志物5.072,P=0.000)、腎癌術前組與良性腫瘤組比較(Z=-2.5,P=0.012)、良性腫瘤與對照組比較(Z=-2.439,P=0.014)差異均有統(tǒng)計學意義;血清miRNA-21在腎癌術前和術后6個月之間比較差異有統(tǒng)計學意義(Z=-2.674,P=0.007);血清miRNA-21在腎癌術前組中高表達(術前組中位數(shù)0.34,良性腫瘤組中位數(shù)0.15,對照組中位數(shù)0.06),血清miRNA-21在腎癌術后6個月的表達呈下調(diào)趨勢(術前中位0.34,術后6個月中位數(shù)0.15)。miRNA-21篩查腎癌的敏感度為90%、特異度為84.4%,ROC曲線下面積(AUC)為0.92。結論血清miRNA-21在腎癌患者中高表達,其有可能成為腎癌診斷、術后檢測的生化標志物。

    腎細胞癌;微小RNA;血清;生物標志物

    微小RNA(miRNA)是一類新的、非蛋白編碼的單鏈RNA,通過與靶基因mRNA非翻譯區(qū)(3'UTR)完全互補或部分互補結合達到靶基因翻譯抑制或降解作用[1]。1993年,miRNA被首次發(fā)現(xiàn)。經(jīng)過多年努力,miRNA作用機制及功能研究方面取得重大突破,成為生命科學領域重大前沿之一。多項研究表明[2-7],miRNA在生理、病理過程中尤其在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中均起到調(diào)節(jié)作用,其在腫瘤組織中異常表達已廣泛報道:miRNA成為腫瘤重要的調(diào)節(jié)因子,對細胞增殖、細胞周期控制、逃避細胞凋亡、組織侵襲及轉移、血管形成及無限復制潛力均起到重要的調(diào)節(jié)作用,并且據(jù)報道,miRNA可能成為多種癌癥的腫瘤標志物[8-9]。迄今已在包括腎癌等的多種癌癥中發(fā)現(xiàn)特定的miRNA表達譜,其表現(xiàn)為高、低表達[1,10-11]。但上述這些研究主要局限在通過有創(chuàng)的穿刺或者手術得到癌癥組織與癌旁正常組織,分析其miRNA情況,而對于血清、血液miRNA研究比較少見。已有報道稱,miRNA在血漿、血清和其他體液中表達有一定豐度,此外,血液中miRNA的表達量在男性、女性以及不同年齡階段相似[12]。miRNAs不僅在血清中具有可測量的豐度,而且具有非常良好的穩(wěn)定性,不易受溫度、酸堿度、放置時間長短影響[13]。這些血清miRNA作為一種新的生物標志物,表現(xiàn)出極大的潛力。因此我們應用RT-qPCR分析比較血清miRNA-21在腎癌患者術前與術后6個月的差異,初步探討miRNA-21能否成為腎癌術后的檢測指標。

    1 資料與方法

    1.1 一般資料 采取隨機數(shù)表法,抽取2011年11月至2012年12月新疆重大疾病資源生物樣本庫保存的原發(fā)性腎癌患者術前及術后6個月血清標本各32例以及腎臟良性腫瘤患者血清標本15例(所取標本均經(jīng)新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準,并獲得患者知情同意)。腎癌患者術前組、腎臟良性腫瘤組抽血前均未行放化療、手術切除和介入等任何相關治療。腎癌患者男性18例,女性14例;漢族20例,維吾爾族12例;年齡34~72歲,中位年齡65歲;>50歲19例,≤50歲13例。腎臟良性腫瘤組男9例,女6例;年齡22~43歲,中位年齡33歲。健康對照組來源于本院體檢中心,名族、年齡、性別比例均與腎癌組相匹配。

    1.2 方法 (1)使用一次性真空采血管采集血清,收集受試者空腹外周血3~5 ml,室溫靜置15~30 min,4℃離心10 min,小心吸取上清液到潔凈1.5 ml離心管,3 h內(nèi)分離血清,-80℃冰箱保存。(2)miRNA分離,按照miRcute miRNA提取分離試劑盒(離心柱型)說明書嚴格操作,使用紫外分光光度儀測定濃度,-80℃冰箱保存待用。(3)miRNA逆轉錄:首先miRNA 3'末端進行加Poly(A)處理,其次Poly(A)修飾的miRNA進行逆轉錄,兩階段設置37℃60 min,合成的cDNA反應液放置-20℃保存待用。(3)RT-qPCR取適量上述cDNA放入去RNase的PCR管中,參照TIANGEN BIOTECH公司SYBRGreen熒光定量PCR檢測試劑盒說明書加入上下游引物、2×SYBR Green PCR Master Mix,無RNase H2O配成20μl反應體系。將配好的反應體系放入Icycler IQ/Q5 PCR儀系統(tǒng)中,設置反應程序參數(shù):94℃2 min,94℃20 s,60℃34 s,共40個循環(huán)。每個樣本重復2次,記錄每個PCR管中熒光信號達到設定的閾值時所循環(huán)的次數(shù)即CT值。以miRNA-16為內(nèi)參照,根據(jù)Schmittgen等[14]采用的相對定量法計算,F(xiàn)=2-△ct,△ct=ctmiRNA-21-ctmiRNA-16,F(xiàn)表示目標基因表達量相對于同一樣本miRNA-16的變化倍數(shù)。

    1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS18.0軟件進行統(tǒng)計學分析,資料非正態(tài),方差不齊,多個樣本比較采用非參數(shù)Kruskkal-WallisH秩和檢驗,兩兩比較采用Wilcoxon秩和檢驗,術前、術后比較采用自身配對Wilcoxon符號秩和檢驗。使用Medcalc計算敏感度、特異度及其曲線下面積(ROC)。miRNA-21與臨床資料關系采用χ2檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結果

    2.1 miRNA-21和miRNA-16的擴增曲線和溶解曲線 圖1為miRNA-21和miRNA-16部分擴增曲線,圖2為它們的溶解曲線,溶解曲線均為單峰,說明擴增產(chǎn)物特異,無其他產(chǎn)物及二聚體。

    圖1 miRNA部分擴展曲線

    圖2 miRNA部分溶解曲線

    2.2 三組受試者的血清miRNA-21表達比較 腎癌術前組患者的血清miRNA-21表達為0.344 (0.211,0.511);腎臟良性腫瘤組患者的miRNA-21表達為0.15(0.062,0.364);健康對照組miRNA-21表達為0.669(0.019,0.140)。三組的血清miRNA-21表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);三者之間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

    2.3 血清miRNA-21在腎癌患者術前與術后6個月組中的差異 腎癌術前組患者的血清miRNA-21為0.344(0.211,0.511);腎癌術后組患者的miRNA-21為0.148(0.044,0.440)。腎癌患者術前與腎癌術后6個月組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),miRNA-21相對水平在術后降低,接近腎臟良性腫瘤組。

    2.4 血清miRNA-21的表達水平對腎癌患者的診斷效率 利用Medcalc軟件得出最佳診斷分界點,計算miRNA-21篩查腎癌的敏感度為90%、特異度為84.4%(見圖3)。ROC曲線下面積(AUC)為0.92,95%置信區(qū)間(0.812,0.977),AUC假設檢驗P<0.001為差異有統(tǒng)計學意義。

    圖3 miRNA-21受試者工作曲線

    3 討論

    腎細胞癌(RCC)是泌尿系統(tǒng)常見腫瘤,占成人惡性腫瘤的3%左右,死亡率在40%以上[15-16]。通常,腎癌早期無臨床癥狀,并缺乏早期診斷方法。目前,手術切除仍是腎癌唯一的治療方法,根治性腎切除術后,還存在20%~40%的復發(fā)率。目前臨床上仍無標準血清生物標志物,用來診斷腎癌或發(fā)現(xiàn)早期復發(fā)患者。據(jù)文獻報道,雖然現(xiàn)存幾種血清蛋白可用于晚期或復發(fā)性腎癌的檢測[17],但不具備標準分子標記物的特異性及敏感性特征。因此尋找一種無創(chuàng)可行的早期診斷方法對臨床工作及其重要。

    本研究前期根據(jù)生物信息學及國內(nèi)外研究進展做了大量篩選工作。已有文獻報道,在多種腫瘤中(甲狀腺癌、乳腺癌、膠質(zhì)母細胞瘤、食管鱗狀癌、膽管癌、大腸癌、宮頸癌),miRNA-21是表達上調(diào)最頻繁的miRNA之一,其表達在腫瘤組明顯高于健康對照組[18-23]。MiRNA-21參與形成RAS致癌信號,轉錄誘導AP1下游的RAS基因,并發(fā)揮其致癌基因的致癌作用[24]。腎癌由多種基因調(diào)控紊亂導致,其具體機制尚不清楚,可能是以一種或多種致癌基因上調(diào)作用為主導或以一種或多種抑癌基因下調(diào)作用為主導,也可能是一種或多種致癌基因與一種或多種抑癌基因的共同主導作用聯(lián)合導致。張濤等[25]報道腎癌有關的下調(diào)抑癌基因有VHL(Von Hippel-Lindau)、p53和p16;與腎癌有關的上調(diào)原癌基因有myc基因家族。

    本實驗應用miRNA-16作為內(nèi)參基因,對靶基因進行歸一化處理,減少目標基因個體化差異。分析結果顯示:首先,血清miRNA-21在腎癌患者的表達高于健康對照和腎臟良性腫瘤組,因此我們猜想血清miRNA-21在腎癌患者的高表達可能與腎癌的發(fā)生有關。2013年,Dey等[26]的相關文獻報道,miRNA-21不僅在腎癌中表達上調(diào),而且調(diào)節(jié)腎癌細胞的增殖和侵襲,在此基礎上得知,PTEN可能是miR-21的下游靶基因,由此,miR-21在人體外的作用也得到研究證實。其次,血清miRNA-21在腎癌患者術后的表達低于術前患者。很多研究表明miRNA-21是致癌基因,其表達增大到一定閾值可能發(fā)生腎癌。本研究認為,腎癌患者術后、放化療、免疫治療及基因治療后,當血清miRNA-21的表達低于某一限定值時,即可判定預后轉歸情況,從而達到臨床評估腎癌患者治療效果和預測復發(fā)轉移的目的。根據(jù)Medcalc軟件得出的診斷試驗結果表明,血清miRNA-21在篩查腎癌時具有較高的敏感度和特異度,由AUC>0.9,我們得出結論:血清miRNA-21具有較高的篩查價值。

    血清miRNA不僅有理由成為腎癌診斷、預測療效的生物標志物,而且在腫瘤的基因治療中擁有良好前景。相信不遠的將來,血清miRNA成為癌癥的“金標準”時代會成為現(xiàn)實。盡管如此,本研究仍存在一些局限性??紤]在以后實驗中增加樣本量、隨訪時間以及采用多中心挑取樣本。并且本課題在確定血清miRNA-21可能致癌的表達閾值研究方面仍需更多努力。

    [1]Slaby O,Jancovicova J,Lakomy R,et al.Expression of miRNA-106b in conventional renal cell carcinoma is a potential marker for prediction of early metastasis after nephrectomy[J].Journal of Experimental&Clinical Cancer Research:CR,2010,29:90.

    [2]Croce CM.Causes and consequences of microRNA dysregulation in cancer[J].Nature Reviews Genetics,2009,10(10):704-714.

    [3]Zimmerman AL,Wu S.MicroRNAs,cancer and cancer stem cells [J].Cancer Letters,2011,300(1):10-19.

    [4]王 偉,李 覃,石理華,等.微小核糖核酸-34a在膀胱癌組織中表達的臨床意義[J].中華泌尿外科雜志,2012,33(12):939-942.

    [5]解 鵬,徐 鋒,程 文,等.腫瘤浸潤相關性微小RNA在膀胱尿路上皮癌中表達的初步研究[J].中華泌尿外科雜志,2012,33(7): 540-543.

    [6]任海林,孫 巖,李世斌,等.膀胱尿路上皮癌細胞株E2F3基因與miR-17-5p和miR-20a的相互作用[J].中華泌尿外科雜志,2012, 33(4):264-267.

    [7]吳 靜,石志豪,方克偉.miRNA與前列腺癌關系的研究[J].中華泌尿外科雜志,2012,33(7):554-555.

    [8]Corcoran C,Friel AM,Duffy MJ,et al.Intracellular and extracellular microRNAs in breast cancer[J].Clinical Chemistry,2011,57(1): 18-32.

    [9]Bartels CL,Tsongalis GJ.MicroRNAs:novel biomarkers for human cancer[J].Clinical Chemistry,2009,55(4):623-631.

    [10]Slaby O,Svoboda M,Michalek J,et al.MicroRNAs in colorectal cancer:translation of molecular biology into clinical application[J]. Molecular cancer,2009,8:102.

    [11]Redova M,Svoboda M,Slaby O.MicroRNAs and their target gene networks in renal cell carcinoma[J].Biochemical and Biophysical Research Communications,2011,405(2):153-156.

    [12]Taylor DD,Gercel-Taylor C.MicroRNA signatures of tumor-derived exosomes as diagnostic biomarkers of ovarian cancer[J].Gynecologic Cncology,2008,110(1):13-21.

    [13]周素麗,鄭智國,毛偉敏.血清中微小RNA作為腫瘤標記物的研究進展[J].國際腫瘤學雜志,2009,36(8):566-568.

    [14]Schmittgen TD,Livak KJ.Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T)method[J].Nature protocols,2008,3(6): 1101-1108.

    [15]Yi Z,Fu Y,Zhao S,et al.Differential expression of miRNA patterns in renal cell carcinoma and nontumorous tissues[J].Journal of Cancer Research and Clinical Oncology,2010,136(6):855-862.

    [16]Chow TF,Youssef YM,Lianidou E,et al.Differential expression profiling of microRNAs and their potential involvement in renal cell carcinoma pathogenesis[J].Clinical Biochemistry,2010,43 (1-2):150-158.

    [17]Ljungberg B.Prognostic markers in renal cell carcinoma[J].Current Opinion in Urology,2007,17(5):303-308.

    [18]Yao T,Lin Z.MiR-21 is involved in cervical squamous cell tumorigenesis and regulates CCL20[J].Biochimica Et Biophysica Acta, 2012,1822(2):248-260.

    [19]Kumar S,Keerthana R,Pazhanimuthu A,et al.Overexpression of circulating miRNA-21 and miRNA-146a in plasma samples of breast cancer patients[J].Indian Journal of Biochemistry&Biophysics,2013,50(3):210-214.

    [20]Ilhan-Mutlu A,Wagner L,Wohrer A,et al.Plasma microRNA-21 concentration may be a useful biomarker in glioblastoma patients [J].Cancer Investigation,2012,30(8):615-621.

    [21]Horiuchi A,Iinuma H,Akahane T,et al.Prognostic significance of PDCD4 expression and association with microRNA-21 in each Dukes'stage of colorectal cancer patients[J].Oncology Reports, 2012,27(5):1384-1392.

    [22]Liu CZ,Liu W,Zheng Y,et al.PTEN and PDCD4 are bona fide targets of microRNA-21 in human cholangiocarcinoma[J].Chinese Medical Sciences Journal,2012,27(2):65-72.

    [23]Cai EH,Gao YX,Wei ZZ,et al.Serum miR-21 expression in human esophageal squamous cell carcinomas[J].Asian Pacific Journal of Cancer Prevention:APJCP,2012,13(4):1563-1567.

    [24]Lee SK,Calin GA.Non-coding RNAs and cancer:new paradigms in oncology[J].Discovery Medicine,2011,11(58):245-254.

    [25]張 濤,羅志剛.腎癌的基因研究進展[J].當代醫(yī)學,2011,17(9): 25-26.

    [26]Dey N,Das F,Ghosh-Choudhury N,et al.microRNA-21 governs TORC1 activation in renal cancer cell proliferation and invasion[J]. PLoS One,2012,7(6):e37366.

    Differential expression of serum miRNA-21 in patients with renal cell carcinoma before and after surgery and its significance.

    YANG Yi,ABUDU·Rezake,MULATI·Rexiati,WANG Wen-guan,HAMULATI·Tusong,YAN Kun-wu, WANG Yu-jie.Department of Urology,the First Hospital of Xinjiang Medical University,Urumqi 830054,Xinjiang,CHINA

    ObjectiveTo investigate the changes in expression of serum miRNA-21 in patients with renal cell carcinoma(RCC)before and after surgery,and to identify detection indexes for renal cell carcinoma after surgery.MethodsThe expression of serum miRNA-21 was detected by real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR)in a larger cohort,including 32 RCC patients(RCC group),20 healthy individuals(control group)and 15 patients with benign renal tumor(benign tumor group).The RCC patients were detected preoperatively and 6 months postoperatively.ResultsAmong RCC patients,there was no statistically significant differences in serum miRNA-21 expression between different ethnicity,gender and age(P>0.05).Significant differences existed in preoperative RCC patients,controls and patients with benign renal tumor(Z=27.536,P<0.001).Paired comparisons showed statistically significant differences between preoperative RCC patients and the controls(Z=-5.072,P<0.001),preoperative RCC patients and patients with benign renal tumor(Z=-2.5,P<0.012),controls and patients with benign renal tumor (Z=-2.439,P<0.014).Between preoperative and postoperative RCC patients,significant difference was found (Z=-2.684,P<0.007).Serum miRNA-21 expression level revealed an up-regulation in preoperative RCC patients(preoperative RCC group,with a median of 0.34;benign renal tumor group,0.15;control group,0.06),but it a down-regulation in postoperative RCC patients(preoperative RCC group,with a median of 0.34,postoperative RCC group, 0.15).As a biochemical marker,miRNA-21 has sensitivity of 90%,specificity of 84.4%,with an area under the ROC curve(AUC)of 0.92.ConclusionThe differences of serum miRNA-21 expression in a larger cohort(32 RCC patients,20 controls and 15 patients with benign renal tumor)are statistically significant.Therefore,serum miRNA-21 is expected to become a biochemical marker for the diagnosis and post-operational determination of RCC.

    Renal cell carcinoma;miRNA;Serum;Biomarkers

    R737.11

    A

    1003—6350(2015)07—0948—04

    10.3969/j.issn.1003-6350.2015.07.0340

    2014-10-22)

    新疆維吾爾自治區(qū)自然科學基金(編號:2013211A101)

    王玉杰。E-mail:wangyj-mr@vip.sina.com

    猜你喜歡
    腎癌標志物曲線
    未來訪談:出版的第二增長曲線在哪里?
    出版人(2022年8期)2022-08-23 03:36:50
    幸福曲線
    英語文摘(2020年6期)2020-09-21 09:30:40
    沿平坦凸曲線Hilbert變換的L2有界性
    囊性腎癌組織p73、p53和Ki67的表達及其臨床意義
    膿毒癥早期診斷標志物的回顧及研究進展
    夢寐以求的S曲線
    Coco薇(2015年10期)2015-10-19 12:42:05
    冠狀動脈疾病的生物學標志物
    自噬與腎癌
    常規(guī)超聲與超聲造影對小腎癌診斷的對比研究
    VEGF165b的抗血管生成作用在腎癌發(fā)生、發(fā)展中的研究進展
    欧美日韩视频精品一区| 人人妻人人澡人人看| 哪个播放器可以免费观看大片| 日韩中文字幕视频在线看片| 色婷婷久久久亚洲欧美| 欧美黄色片欧美黄色片| 色网站视频免费| 亚洲熟女精品中文字幕| 精品少妇久久久久久888优播| 老司机亚洲免费影院| 十八禁高潮呻吟视频| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 亚洲美女视频黄频| 国产av国产精品国产| 久久精品久久久久久久性| 日韩精品免费视频一区二区三区| av网站免费在线观看视频| 人人妻人人澡人人看| 亚洲,一卡二卡三卡| 妹子高潮喷水视频| 国产在线视频一区二区| 免费观看a级毛片全部| 精品第一国产精品| 国产成人欧美| 性高湖久久久久久久久免费观看| 又大又黄又爽视频免费| 丝袜美足系列| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 欧美xxⅹ黑人| 久久久精品94久久精品| 一区二区三区激情视频| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 一区二区三区精品91| 欧美少妇被猛烈插入视频| 男人爽女人下面视频在线观看| 波多野结衣av一区二区av| 夫妻性生交免费视频一级片| 亚洲免费av在线视频| 9191精品国产免费久久| 天天影视国产精品| 久久免费观看电影| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 欧美成人午夜精品| 国产探花极品一区二区| 日本av免费视频播放| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 99热全是精品| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 亚洲熟女精品中文字幕| 精品国产国语对白av| 老熟女久久久| 亚洲第一区二区三区不卡| 成人国产av品久久久| 国产一区二区三区综合在线观看| 精品国产一区二区久久| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 久久久久久人人人人人| 成人亚洲欧美一区二区av| 又大又黄又爽视频免费| 精品卡一卡二卡四卡免费| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 国产成人啪精品午夜网站| 97人妻天天添夜夜摸| 日韩一区二区视频免费看| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 国产精品三级大全| 免费看不卡的av| 交换朋友夫妻互换小说| 多毛熟女@视频| 少妇 在线观看| 赤兔流量卡办理| 亚洲av国产av综合av卡| av国产精品久久久久影院| 飞空精品影院首页| 波野结衣二区三区在线| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 久久久久网色| 蜜桃在线观看..| 一区二区三区精品91| 色视频在线一区二区三区| 国产精品蜜桃在线观看| 精品国产一区二区三区久久久樱花| av片东京热男人的天堂| 九色亚洲精品在线播放| 99re6热这里在线精品视频| 成人黄色视频免费在线看| 最近中文字幕高清免费大全6| 欧美 日韩 精品 国产| 黄色一级大片看看| 国产成人欧美在线观看 | 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 免费黄色在线免费观看| 不卡视频在线观看欧美| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 最近手机中文字幕大全| 久热这里只有精品99| 男女边摸边吃奶| 搡老乐熟女国产| 性色av一级| 老汉色av国产亚洲站长工具| 久久久久精品久久久久真实原创| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 精品视频人人做人人爽| 黄片无遮挡物在线观看| 亚洲国产欧美网| 一个人免费看片子| av在线观看视频网站免费| 色视频在线一区二区三区| 久久久久久久国产电影| 天堂中文最新版在线下载| 啦啦啦在线观看免费高清www| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 国产av一区二区精品久久| 婷婷色麻豆天堂久久| 精品第一国产精品| 男女午夜视频在线观看| 麻豆av在线久日| 中文字幕最新亚洲高清| 国产在线一区二区三区精| 香蕉丝袜av| av网站在线播放免费| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 深夜精品福利| 十分钟在线观看高清视频www| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 日韩av不卡免费在线播放| 在线观看国产h片| 999精品在线视频| 亚洲av日韩精品久久久久久密 | 熟妇人妻不卡中文字幕| 成人毛片60女人毛片免费| www.熟女人妻精品国产| 久久久久久久大尺度免费视频| videosex国产| 亚洲欧洲日产国产| 久久久久久久大尺度免费视频| 大陆偷拍与自拍| 久久久久国产一级毛片高清牌| 九色亚洲精品在线播放| 亚洲在久久综合| bbb黄色大片| 亚洲欧美清纯卡通| 亚洲成人国产一区在线观看 | 亚洲,一卡二卡三卡| 91成人精品电影| 成年美女黄网站色视频大全免费| 最近中文字幕高清免费大全6| 新久久久久国产一级毛片| 美女大奶头黄色视频| 搡老乐熟女国产| 国产爽快片一区二区三区| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 亚洲国产欧美在线一区| 丝袜在线中文字幕| 99精国产麻豆久久婷婷| 成人漫画全彩无遮挡| 午夜精品国产一区二区电影| 人成视频在线观看免费观看| 亚洲,一卡二卡三卡| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 亚洲人成电影观看| 亚洲综合精品二区| 欧美黑人欧美精品刺激| 女人精品久久久久毛片| 一级a爱视频在线免费观看| 久久av网站| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 不卡av一区二区三区| 国产成人午夜福利电影在线观看| 操美女的视频在线观看| 性色av一级| 亚洲成人av在线免费| av网站在线播放免费| 啦啦啦啦在线视频资源| 精品免费久久久久久久清纯 | 国产亚洲一区二区精品| 色94色欧美一区二区| 成人三级做爰电影| www.自偷自拍.com| 国产精品偷伦视频观看了| 大片免费播放器 马上看| 在线观看免费视频网站a站| 午夜av观看不卡| 亚洲欧美一区二区三区久久| 国产一卡二卡三卡精品 | 亚洲精品中文字幕在线视频| 国产成人精品无人区| 综合色丁香网| 成年动漫av网址| av免费观看日本| 国产精品嫩草影院av在线观看| 欧美激情 高清一区二区三区| 少妇人妻 视频| a级毛片黄视频| 国产探花极品一区二区| 欧美少妇被猛烈插入视频| 男人舔女人的私密视频| 欧美日韩成人在线一区二区| 免费日韩欧美在线观看| 亚洲中文av在线| 午夜激情久久久久久久| 老熟女久久久| 午夜av观看不卡| 日本欧美国产在线视频| 国产免费现黄频在线看| 制服人妻中文乱码| 无遮挡黄片免费观看| 成人手机av| 一区二区三区乱码不卡18| 国产成人午夜福利电影在线观看| 色吧在线观看| 亚洲国产成人一精品久久久| 精品福利永久在线观看| 午夜91福利影院| 久久久欧美国产精品| 精品国产一区二区久久| 欧美亚洲日本最大视频资源| 美女大奶头黄色视频| 中文字幕高清在线视频| 在线观看免费视频网站a站| 99热国产这里只有精品6| av女优亚洲男人天堂| 黄色一级大片看看| 国产一区二区 视频在线| 丁香六月天网| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 热re99久久精品国产66热6| 久久人妻熟女aⅴ| 久久久久久久精品精品| 成人午夜精彩视频在线观看| 中国三级夫妇交换| 中文字幕亚洲精品专区| 中文天堂在线官网| 国产成人a∨麻豆精品| 国产不卡av网站在线观看| 国产成人免费观看mmmm| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 中文字幕高清在线视频| 免费在线观看完整版高清| 亚洲精品乱久久久久久| 久久久久久人妻| 男女边摸边吃奶| 亚洲国产最新在线播放| 亚洲,欧美,日韩| 777米奇影视久久| 欧美日韩亚洲高清精品| 街头女战士在线观看网站| 高清欧美精品videossex| 欧美人与善性xxx| 成人三级做爰电影| tube8黄色片| 男人操女人黄网站| 老司机影院成人| 五月开心婷婷网| av一本久久久久| 国产野战对白在线观看| 视频区图区小说| 欧美成人午夜精品| 色精品久久人妻99蜜桃| 女性被躁到高潮视频| 久久久久久久久久久免费av| 精品少妇久久久久久888优播| 一区福利在线观看| 精品午夜福利在线看| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 国产精品一国产av| 99热全是精品| 美女大奶头黄色视频| 丰满少妇做爰视频| 亚洲中文av在线| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 成人午夜精彩视频在线观看| 日韩av免费高清视频| 九九爱精品视频在线观看| 国产极品天堂在线| 国产片特级美女逼逼视频| 国产高清不卡午夜福利| 精品少妇内射三级| 看免费成人av毛片| 午夜免费鲁丝| 青春草视频在线免费观看| 色婷婷av一区二区三区视频| 亚洲美女搞黄在线观看| 91国产中文字幕| 成人亚洲精品一区在线观看| 黄色毛片三级朝国网站| 中文字幕人妻丝袜一区二区 | 久久毛片免费看一区二区三区| 各种免费的搞黄视频| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 水蜜桃什么品种好| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 男人爽女人下面视频在线观看| 最近中文字幕2019免费版| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 黄片小视频在线播放| 色综合欧美亚洲国产小说| 亚洲精品一区蜜桃| 午夜老司机福利片| 国产深夜福利视频在线观看| 视频区图区小说| 老汉色∧v一级毛片| 日韩av在线免费看完整版不卡| 无限看片的www在线观看| 国产成人精品在线电影| 国产成人a∨麻豆精品| 国产探花极品一区二区| xxxhd国产人妻xxx| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 欧美少妇被猛烈插入视频| av一本久久久久| 美女中出高潮动态图| 中国三级夫妇交换| 丝袜喷水一区| 国产97色在线日韩免费| av在线老鸭窝| 日韩伦理黄色片| 啦啦啦啦在线视频资源| 日韩大码丰满熟妇| 一级a爱视频在线免费观看| 午夜福利网站1000一区二区三区| 在现免费观看毛片| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 欧美乱码精品一区二区三区| 夫妻性生交免费视频一级片| 丰满少妇做爰视频| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 人妻人人澡人人爽人人| 欧美激情高清一区二区三区 | 中文天堂在线官网| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 午夜日韩欧美国产| 大香蕉久久网| 中文字幕高清在线视频| 亚洲成人av在线免费| 成年人午夜在线观看视频| 国产伦人伦偷精品视频| 2021少妇久久久久久久久久久| 丝袜美腿诱惑在线| 亚洲综合精品二区| 51午夜福利影视在线观看| 亚洲国产最新在线播放| 亚洲人成77777在线视频| 午夜福利视频精品| 午夜福利免费观看在线| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 老司机影院毛片| 毛片一级片免费看久久久久| 成人亚洲精品一区在线观看| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 色94色欧美一区二区| 美女福利国产在线| 欧美最新免费一区二区三区| 丰满少妇做爰视频| 男女之事视频高清在线观看 | 久久久久国产精品人妻一区二区| 日韩大码丰满熟妇| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 超色免费av| 国产亚洲av高清不卡| 亚洲精品视频女| 亚洲欧美一区二区三区国产| 国产极品天堂在线| 蜜桃国产av成人99| 看非洲黑人一级黄片| 晚上一个人看的免费电影| 亚洲熟女精品中文字幕| 飞空精品影院首页| 精品国产一区二区久久| 国产日韩欧美亚洲二区| 亚洲国产欧美在线一区| 日韩欧美一区视频在线观看| 国产亚洲最大av| 亚洲精品一二三| 久久久久人妻精品一区果冻| 亚洲在久久综合| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| av有码第一页| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 国产男女超爽视频在线观看| 中文字幕精品免费在线观看视频| 亚洲一码二码三码区别大吗| 最近的中文字幕免费完整| 婷婷色麻豆天堂久久| 青春草国产在线视频| 免费人妻精品一区二区三区视频| 亚洲精品中文字幕在线视频| 亚洲美女视频黄频| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 男女边吃奶边做爰视频| 国产av一区二区精品久久| 欧美精品av麻豆av| 国产精品二区激情视频| 校园人妻丝袜中文字幕| www.av在线官网国产| 久久 成人 亚洲| 午夜福利在线免费观看网站| 中文字幕精品免费在线观看视频| 伊人亚洲综合成人网| 最近2019中文字幕mv第一页| 国产极品天堂在线| 中文字幕制服av| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 男女午夜视频在线观看| 美女扒开内裤让男人捅视频| kizo精华| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 国产成人精品福利久久| 亚洲精品国产av成人精品| 久久精品国产亚洲av高清一级| 成年人午夜在线观看视频| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 国产乱来视频区| 欧美精品一区二区免费开放| www.自偷自拍.com| av又黄又爽大尺度在线免费看| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| www.精华液| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 一二三四中文在线观看免费高清| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 国产精品99久久99久久久不卡 | 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 少妇被粗大猛烈的视频| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 日韩中文字幕视频在线看片| 午夜免费男女啪啪视频观看| 久久青草综合色| 亚洲av日韩精品久久久久久密 | 久久人人爽人人片av| 欧美精品一区二区免费开放| 99久久人妻综合| 日韩中文字幕视频在线看片| 国产成人午夜福利电影在线观看| 国精品久久久久久国模美| 老司机影院毛片| 色婷婷久久久亚洲欧美| 免费人妻精品一区二区三区视频| 成年av动漫网址| 中国三级夫妇交换| 亚洲人成网站在线观看播放| 亚洲精品av麻豆狂野| 国产高清不卡午夜福利| 丝袜脚勾引网站| 男女边摸边吃奶| 国产一级毛片在线| 99久久精品国产亚洲精品| 亚洲国产看品久久| 国产一区二区 视频在线| 伦理电影大哥的女人| 人妻人人澡人人爽人人| 男女边摸边吃奶| 美女视频免费永久观看网站| av福利片在线| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| a级片在线免费高清观看视频| 亚洲 欧美一区二区三区| 大陆偷拍与自拍| 国产精品久久久久久精品电影小说| 视频区图区小说| 欧美精品高潮呻吟av久久| 欧美另类一区| 美女高潮到喷水免费观看| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 精品福利永久在线观看| 美女视频免费永久观看网站| 中国三级夫妇交换| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 黄色毛片三级朝国网站| 大话2 男鬼变身卡| 妹子高潮喷水视频| 最新在线观看一区二区三区 | 看免费成人av毛片| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 亚洲一区二区三区欧美精品| 纯流量卡能插随身wifi吗| 最近最新中文字幕免费大全7| 国产av一区二区精品久久| av国产精品久久久久影院| 免费观看人在逋| 久久人人爽人人片av| 又大又黄又爽视频免费| 久久狼人影院| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 一边摸一边做爽爽视频免费| 国产极品粉嫩免费观看在线| 国产色婷婷99| 黄色怎么调成土黄色| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 日韩 亚洲 欧美在线| 哪个播放器可以免费观看大片| 日本91视频免费播放| 久久ye,这里只有精品| 久久久国产精品麻豆| 曰老女人黄片| 99精品久久久久人妻精品| 一级爰片在线观看| 久久综合国产亚洲精品| 亚洲成人av在线免费| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 国产国语露脸激情在线看| 日本欧美视频一区| 观看美女的网站| 精品国产乱码久久久久久男人| 一二三四在线观看免费中文在| 日韩伦理黄色片| 美女中出高潮动态图| 久久99热这里只频精品6学生| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 亚洲熟女毛片儿| 极品人妻少妇av视频| 另类亚洲欧美激情| 在线观看免费高清a一片| 精品福利永久在线观看| 久久久久久久国产电影| 亚洲欧洲日产国产| 性高湖久久久久久久久免费观看| 午夜激情av网站| 日本一区二区免费在线视频| 成年动漫av网址| 中文字幕av电影在线播放| 满18在线观看网站| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 精品午夜福利在线看| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 日韩电影二区| 亚洲,一卡二卡三卡| 永久免费av网站大全| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 免费不卡黄色视频| 亚洲精品一二三| 一区二区三区乱码不卡18| 只有这里有精品99| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 青青草视频在线视频观看| 久久人妻熟女aⅴ| 婷婷成人精品国产| 国产男人的电影天堂91| www.av在线官网国产| 欧美日韩精品网址| 日本wwww免费看| 午夜福利一区二区在线看| 热re99久久国产66热| 国产黄色免费在线视频| 乱人伦中国视频| 久久久久人妻精品一区果冻| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 啦啦啦啦在线视频资源| 亚洲国产欧美在线一区| 九草在线视频观看| 最近2019中文字幕mv第一页| 色婷婷av一区二区三区视频| 欧美黄色片欧美黄色片| 免费日韩欧美在线观看| 99热国产这里只有精品6| 欧美变态另类bdsm刘玥| 人妻人人澡人人爽人人| 欧美日韩视频精品一区| 男女无遮挡免费网站观看| 高清不卡的av网站| 1024视频免费在线观看| 丁香六月天网| 日本av手机在线免费观看| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 男女高潮啪啪啪动态图| 国产av码专区亚洲av| 丰满饥渴人妻一区二区三| 可以免费在线观看a视频的电影网站 | 精品一区二区免费观看| 国产不卡av网站在线观看| 一本大道久久a久久精品| 一区在线观看完整版| 午夜福利乱码中文字幕| 精品国产国语对白av| 亚洲美女黄色视频免费看| 美女中出高潮动态图| 大片免费播放器 马上看| 免费人妻精品一区二区三区视频| 国产精品久久久av美女十八| 一区二区三区四区激情视频| 国产精品 国内视频| 人人妻,人人澡人人爽秒播 | 亚洲精品国产av成人精品| av免费观看日本| 午夜福利一区二区在线看| 午夜福利影视在线免费观看| 波多野结衣一区麻豆| 两个人免费观看高清视频| 一本久久精品| 欧美日韩一级在线毛片| 成人午夜精彩视频在线观看| 国产在视频线精品| 中文字幕人妻熟女乱码| 两个人免费观看高清视频| 亚洲精品国产av成人精品| 99精品久久久久人妻精品| 国产不卡av网站在线观看| 色婷婷久久久亚洲欧美| 国产麻豆69| 人妻一区二区av| 男人爽女人下面视频在线观看| 性少妇av在线| 亚洲,欧美,日韩| 国产黄色视频一区二区在线观看| 性少妇av在线| 在线天堂中文资源库|