外周血游離腫瘤DNA測定在非小細(xì)胞肺癌患者中的應(yīng)用價(jià)值

洪英財(cái)，陳懷生，林少霖，王正，楊林，王光鎖，李富榮，黃同海

（暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院深圳市人民醫(yī)院胸外科，廣東深圳518000）

外周血游離腫瘤DNA測定在非小細(xì)胞肺癌患者中的應(yīng)用價(jià)值

洪英財(cái)，陳懷生，林少霖，王正，楊林，王光鎖，李富榮，黃同海

（暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院深圳市人民醫(yī)院胸外科，廣東深圳518000）

目的探討Ion Torrent測定外周血DNA在非小細(xì)胞肺癌中的臨床價(jià)值。方法選擇患者80例，通過Ion Torrent測序測定其EGFR濃度，觀察EGFR濃度與EGFR基因型及與吉非替尼治療敏感情況的關(guān)系，并分析EGFR突變與否者的1年生存率。結(jié)果突變型EGFR 32例，野生型EGFR 48例，吉非替尼敏感者30例，吉非替尼不敏感者50例，突變型EGFR濃度明顯高于野生型EGFR(P＜0.05)，對(duì)吉非替尼治療敏感者的血清EGFR濃度顯著高于吉非替尼治療不敏感者(P＜0.05)。結(jié)論采用Ion Torrent測定外周血DNA技術(shù)了解患者基因型，有針對(duì)性的使用靶向治療藥物，其準(zhǔn)確性更高，且能有效延長患者生存時(shí)間。

Ion Torrent測定；外周血DNA；非小細(xì)胞肺癌

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一。由于其不易被早期診斷，且至今仍未有有效的治療方案，導(dǎo)致肺癌的5年生存率低于15%，而基因治療更有助于肺癌患者提高臨床療效，延長其生存時(shí)間[1]。循環(huán)DNA作為游離DNA主要出現(xiàn)在人體外周血或者體液中，而腫瘤患者循環(huán)DNA的來源尚不明確。有報(bào)道稱，腫瘤細(xì)胞的凋亡是其主要的生成方式。研究還發(fā)現(xiàn)，非小細(xì)胞肺癌患者的血漿循環(huán)DNA會(huì)表現(xiàn)出極為異常的變化，提示循環(huán)DNA基因也可作為腫瘤標(biāo)志物[2]。

Ion Torrent測序是第三代測序技術(shù)，其不但使DNA聚合酶自身反應(yīng)速度得到實(shí)現(xiàn)，能夠在一秒鐘即可測10個(gè)堿基，相對(duì)于化學(xué)法測序其效率顯著提高甚至超過2萬倍，同時(shí)實(shí)現(xiàn)了DNA聚合酶內(nèi)反應(yīng)的自身延續(xù)，對(duì)于蛋白質(zhì)片段的合成具有積極意義，顯著提高了基因組的重復(fù)序列的拼接效率[3]。其能能夠直接測RNA的序列，降低體外逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的系統(tǒng)誤差[4]，并對(duì)甲基化的DNA序列進(jìn)行直接的測定，更好的提高了基因測序效率，從而實(shí)現(xiàn)了基因?qū)用鎸?duì)患者的外周血DNA進(jìn)行檢測，對(duì)非小細(xì)胞肺癌患者進(jìn)行基因診斷和治療的可行性[5]。本研究主要通過Ion Torrent測序了解患者EGFR基因型，并結(jié)合PCR測定EGFR濃度，評(píng)價(jià)Ion Torrent測定外周血DNA的價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2012年8月至2014年2月我院收治的非小細(xì)胞肺癌患者80例，所有患者均經(jīng)臨床表現(xiàn)、影像學(xué)檢查以及病理組織活檢確診，其中Ion Torrent測序確定突變型EGFR 32例，野生型EGFR 48例，對(duì)吉非替尼治療敏感者30例，對(duì)吉非替尼治療不敏感者50例。

1.2 入選及排除標(biāo)準(zhǔn)入組標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)病理組織學(xué)/細(xì)胞學(xué)檢查診斷為非小細(xì)胞肺癌；(2)年齡18～75歲；(3)ECOG評(píng)分0～2分；(4)預(yù)計(jì)生存期≥2個(gè)月；(5)主要器官功能正常；(6)自愿入組，簽署知情同意書，依從性好，配合隨訪；(7)距離大手術(shù)4周以上。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并未能控制的中樞神經(jīng)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移，具有顱高壓表現(xiàn)；(2)具有出血傾向，特別是1個(gè)月內(nèi)出現(xiàn)過明顯的消化道出血；或正在接受溶栓或抗凝治療；(3)30 d內(nèi)使用過其他研究藥物，或同時(shí)參加其他臨床研究；(4)6個(gè)月內(nèi)出現(xiàn)過心肌梗塞，或目前存在不穩(wěn)定性心絞痛、心功能不全；(5)合并嚴(yán)重慢性阻塞性肺病和/或呼吸衰竭；(6)雙側(cè)胸腔大量積液或包裹性胸腔積液；(7)患者依從性差，或患有精神疾病；(8)已知對(duì)本試驗(yàn)用藥及其輔料過敏；(9)目前存在未控制的嚴(yán)重感染；(10)妊娠期或哺乳期女性患者，不愿采取避孕措施的育齡患者(包括男性)。

1.3 Ion Torrent測序的工作原理以基因組學(xué)技術(shù)為基礎(chǔ)，結(jié)合無創(chuàng)檢測技術(shù)，通過采用新一代快速測序平臺(tái)—第三代測序技術(shù)Ion Torrent，來對(duì)非小細(xì)胞肺癌患者外周血循環(huán)DNA進(jìn)行檢測，探索其在個(gè)體化用藥指導(dǎo)上的價(jià)值。先將含測序的DNA樣本置入微孔，然后使用數(shù)量巨大的且未經(jīng)處理的核苷酸(DNTP)，依次穿過微孔；根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則DNA聚合酶會(huì)將相應(yīng)核苷酸置入延伸鏈，通過延伸反映獲得的氫離子直接改變反映體系的pH值，測序儀就可以這種變化為基礎(chǔ)進(jìn)行測序。

1.4 EGFR濃度測定所有非小細(xì)胞肺癌患者在均留取血樣3 ml，并對(duì)癌組織中定量壞死組織，置入冰箱保存?zhèn)溆茫谑炃衅l(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞含量均高于70%。按照不同病理類型進(jìn)行分組，置入枸鹽酸鈉抗凝劑(ACD)，保存在冰箱中，有效使用期為1周。DNA提取：所有標(biāo)本的DNA抽提均用常規(guī)蛋白酶K消化、酚-氯仿抽提，經(jīng)紫外分光光度計(jì)定量，將濃度稀釋到350～450 ng/ml，-20℃保存?zhèn)溆?。?0μl PCR反應(yīng)體系中加入基因組DNA 1 μl，5 μl PCR緩沖液，dNTP 200μmol/L，每對(duì)引物各20 pmol/L，Taq DNA聚合酶0.5 U，在反應(yīng)液表面加30μl高壓消毒甘油；采用熱啟動(dòng)法，97℃變性10 min，隨后降至88℃，循環(huán)條件為94℃60 s，54℃～57℃60 s，72℃60 s，38個(gè)循環(huán)后72℃，延伸10 min。

1.5 研究方法所有患者均應(yīng)用Ion Torrent測序技術(shù)測定其EGFR突變情況，了解其突變型與野生型比率，并通過臨床驗(yàn)證得到對(duì)吉非替尼治療敏感與否的比率。通過PCR技術(shù)測定EGFR濃度，觀察EGFR濃度與EGFR基因型及與吉非替尼治療敏感情況的關(guān)系，并分析EGFR突變與否者的1年生存率。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩組間均數(shù)的比較使用t檢驗(yàn)，生存情況使用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EGFR突變與否者的EGFR濃度比較突變型(32例)的EGFR濃度為(1643.7±123.7)copy×105/ml，明顯高于野生型(48例)的(648.9±81.5)copy×105/ml，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=42.473，P＜0.05)。

2.2 吉非替尼敏感與否者的血清EGFR濃度比較對(duì)吉非替尼治療敏感者30例，其血清EGFR濃度為(893.3±132.3)copy×105/ml，對(duì)吉非替尼治療不敏感者50例，其血清EGFR濃度為(532.8±98.9)copy× 105/ml，兩者的血清EGFR濃度比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=13.803，P＜0.05)。

2.3 EGFR突變與否的1年生存曲線比較突變型EGFR 1年生存26例，死亡6例，生存率為81.25%，野生型EGFR 1年生存36例，死亡12例，生存率為75.0%，兩組患者的1年生存率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。EGFR突變與否的1年生存曲線，見圖1。

圖1 EGFR突變與否1年生存曲線

3 討論

腫瘤循環(huán)DNA主要是由少數(shù)衰亡細(xì)胞的DNA釋放出來的。在健康狀態(tài)下，循環(huán)游離DNA的釋放與消除則會(huì)保持一種相對(duì)平衡的狀態(tài)[6]。循環(huán)游離DNA可作為人體健康的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)[7]。其改變與多種疾病存在著密切聯(lián)系。主要來源為[8]：①腫瘤細(xì)胞或微轉(zhuǎn)移灶；②腫瘤細(xì)胞壞死或凋亡；③腫瘤細(xì)胞自行釋放DNA。腫瘤組織釋放出的DNA會(huì)逐漸進(jìn)入血液，導(dǎo)致血漿DNA濃度升高。循環(huán)DNA與腫瘤組織細(xì)胞保持著相同的特異性。腫瘤患者在經(jīng)過各種有效治療后其外周血循環(huán)DNA的數(shù)量減少，而治療后患者外周血循環(huán)DNA的濃度不降反升時(shí)，即提示患者生存率有所降低[9]。Ion Torrent測序技術(shù)借助了半導(dǎo)體芯片技術(shù)，和激光測序不同的是，它是建立在化學(xué)和數(shù)字信息基礎(chǔ)之上的一種新型技術(shù)[10]。

EGFR突變?yōu)橥怙@子E19 del和外顯21 L858 R突變，能夠在接近50%的患者身上監(jiān)測到，其誘發(fā)的酪氨酸激酶活化，是靶向治療藥物厄洛替尼、吉非替尼治療活性的指標(biāo)之一[11]。EGFR基因突變檢測是以腫瘤組織樣本為基礎(chǔ)的。但是中晚期肺癌患都不耐受手術(shù)，導(dǎo)致較難獲得腫瘤組織樣本，雖然可以采用纖維支氣管鏡活檢組織，但其會(huì)造成較大創(chuàng)傷，不適用于大部分患者。所以在需要進(jìn)行多人篩查或病情進(jìn)展檢查時(shí)，通過組織標(biāo)本檢測EGFR基因突變能更好的為臨床治療提供依據(jù)。其中外周血樣本獲取較為容易、且會(huì)創(chuàng)傷微小，可用于病情監(jiān)測優(yōu)質(zhì)標(biāo)本。但在血行轉(zhuǎn)移前外周血中循環(huán)癌細(xì)胞非常少，常規(guī)方法很難在外周血中檢測出癌細(xì)胞EGFR基因突變。Ion Torrent測定外周血DNA基因突變的靈敏度和特異性越來越高，使EGFR基因突變檢測方法得到了巨大的發(fā)展。

采用Ion Torrent測定外周血DNA技術(shù)對(duì)血漿總游離DNA定量分析在提取血漿游離DNA時(shí)目前尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)[12]，導(dǎo)致不同實(shí)驗(yàn)室最終測量的血漿DNA水平不一樣，實(shí)驗(yàn)結(jié)果無法進(jìn)行比較[13]。但隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步，隨著Ion Torrent測定外周血DNA技術(shù)逐漸成為被廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)研究，通過與其他分子生物學(xué)技術(shù)的聯(lián)合使用提高了極微量基因測試水平[14]，能夠準(zhǔn)確檢測微量游離DNA，了解患者基因型，有助于腫瘤的早期診斷和療效評(píng)估等?；颊郀顟B(tài)會(huì)對(duì)血漿游離DNA產(chǎn)生較大影響，因此聯(lián)合多個(gè)靶基因有助于游離DNA的測定[15]。本研究結(jié)合常規(guī)使用的PCR技術(shù)進(jìn)行檢測后發(fā)現(xiàn)，突變型EGFR其EGFR濃度顯著高于野生型EGFR者，對(duì)吉非替尼治療敏感者其血清EGFR濃度顯著高于吉非替尼治療不敏感者。且通過Ion Torrent測定外周血DNA基因檢測針對(duì)性的使用吉非替尼靶向治療后，對(duì)于EGFR突變與否患者，其1年生存率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

綜上所述，采用Ion Torrent測定外周血DNA技術(shù)了解患者基因型，有針對(duì)性的使用靶向治療藥物，其準(zhǔn)確性更高，且能有效延長患者生存時(shí)間。

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Value of peripheral blood DNA determination by Ion Torrent in patients with non-small cell lung cancer.

HONG Ying-cai,CHEN Huai-sheng,LIN Shao-lin,WANG Zheng,YANG Lin,WANG Guang-suo,LI Fu-rong,HUANG Tong-hai.Department of Thoracic Surgery,Shenzhen People's Hospital,the Second Clinical Medical College of Jinan University,Shenzhen 518000,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo evaluate the clinical value of peripheral blood DNA determination by Ion Torrent in patients with non-small cell lung cancer.MethodsEighty patients of non-small cell lung cancer were enrolled,in which the epidermal growth factor receptor(EGFR)concentration was measured with Ion Torrent,Then the relationships between EGFR levels,EGFR genotype,and sensitive situation of gefitinib therapy were investigated,and one-year survival rate of the patients with or without EGFR mutation were analyzed.ResultsAmong the 80 patients,32 had mutant EGFR and 48 had wild-type EGFR.Thirty patients were sensitive to gefitinib and 50 were not sensitive to gefitinib.Levels of EGFR in mutant EGFR was significantly higher than those in wild-type EGFR(P＜0.05).And the levels were significantly higher in gefitinib-sensitive patients than patients not sensitive to gefitinib(P＜0.05).ConclusionPeripheral blood DNA measured with Ion Torrent can ientify the patients’genotype and target therapies,which results in higher accuracy and prolonged survival time.

Ion Torrent;Peripheral blood DNA;Non-small cell lung cancer

R734.2

A

1003—6350（2015）01—0053—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.01.0017

2014-07-09)

2012年度廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)研究基金項(xiàng)目（編號(hào)：A2012566）

陳懷生。E-mail：hyc55@126.com