清熱活血方藥對類風濕患者成纖維樣滑膜細胞OPG、RANKL、TNF-α及IL-17表達影響分析

劉彥龍，楊林，劉娟云

(河南科技大學附屬三門峽市中心醫(yī)院，河南三門峽472000)

清熱活血方藥對類風濕患者成纖維樣滑膜細胞OPG、RANKL、TNF-α及IL-17表達影響分析

劉彥龍，楊林，劉娟云

(河南科技大學附屬三門峽市中心醫(yī)院，河南三門峽472000)

目的:分析清熱活血方藥對類風濕關(guān)節(jié)炎患者成纖維樣滑膜細胞(RA-HFLS)OPG、RANKL、TNF-α、IL-17表達的影響。方法:采用不同劑量的清熱活血方藥治療85例類風濕關(guān)節(jié)炎患者，采用ELISA法檢測成纖維樣滑膜細胞中的OPG、TNF-α及IL-17濃度，Western blot法檢測RANKL蛋白的表達情況。結(jié)果:A、B、C 3組與對照組的TNF-α、IL-17水平、RANKL表達比較差異有統(tǒng)計學意義(F=13.872，P=0.003;F=9.831，P=0.011;F=7.392，P=0.039)，A、B、C 3組高于對照組，B、C 2組低于A組(P＜0.05)，C組低于B組;A、B、C 3組與對照組的OPG分泌差異有統(tǒng)計學意義(F=9.856，P=0.008)，A、B、C 3組高于對照組，B、C 2組高于A組，C組高于B組。結(jié)論:清熱活血方藥能夠抑制RA-HFLS中RANKL、TNF-α及IL-17OPG的表達，促進OPG的分泌。

清熱活血方藥;類風濕關(guān)節(jié)炎;成纖維樣滑膜細胞

中醫(yī)認為，類風濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)屬于“骨痹”“歷節(jié)風”、“鶴膝風”等范疇，是慢性、對稱性關(guān)節(jié)炎為主要臨床特征的免疫性疾?。?］，RA以關(guān)節(jié)腫脹、晨僵、疼痛、畸形和功能障礙為主要臨床表現(xiàn)，其反復發(fā)作，纏綿難愈。清熱活血方藥以清熱利濕與活血通絡(luò)為治療重點，有效緩解患者關(guān)節(jié)腫脹、疼痛，恢復關(guān)節(jié)活動功能［2］?，F(xiàn)選取2012年4月至2013年10月間來我院接受治療的85例類風濕關(guān)節(jié)炎患者進行調(diào)查，并采用不同劑量的清熱活血方藥進行治療，取得了較好的臨床療效，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2012年4月至2013年10月我院風濕免疫科門診和住院治療的類風濕關(guān)節(jié)炎患者作為本研究的研究對象。納入標準:經(jīng)西醫(yī)診斷和中醫(yī)濕熱痹阻、瘀血阻絡(luò)證候診斷的RA患者;年齡在18～65歲;DAS評分≥3.2分;關(guān)節(jié)功能分級在I級、II級、III級;進入研究前1個月內(nèi)患者未服用任何糖皮質(zhì)激素類藥物。排除標準:孕產(chǎn)婦、哺乳期婦女;合并有心、肝、腎功能障礙者;合并有其他風濕類疾病者;合并有其他可能影響本研究結(jié)果疾病類;患者及家屬未簽署知情同意書。符合納入排除標準的共85例，按照隨機數(shù)字表法分為A(低劑量組)、B(中劑量組)、C(高劑量組)3組。另外于同一時間隨機抽取50名來我院體檢的正常體檢者作為本研究的對照組，對照組與研究組具有可比性。

研究組中A組29例，男16例，女13例;年齡19～64歲，平均年齡(48.3±5.6)歲;病程1.1～8年，平均病程(3.7±1.1)年。B組28例，男14例，女14例;年齡18～65歲，平均年齡(49.1±5.3)歲;病程1.2～7.5年，平均病程(3.5±1.3)年。C組28例，男16例，女12例;年齡19～65歲，平均年齡(48.7±4.9)歲;病程0.9～9年，平均病程(3.8± 1.3)年，3組具有可比性。

1.2 方法

各組連續(xù)治療7 d為1個療程，共服用2個療程。所有患者給予清熱活血方藥物，該方由補骨脂、阿膠20 g，黃芪、大棗15 g，雞血藤10 g、黨參8 g，茯苓、熟地黃、桂枝各5 g及炙甘草與木香等多種藥材組成。在混合藥物后加入500 mL水武火加熱，濃縮至200 mL后調(diào)為文火，煎2次后混合，分2次服用。A組患者服用800 ml清熱活血方藥物，B組患者服用100 ml清熱活血方藥物，C組患者增加藥物劑量120 ml。對照組患者為健康志愿者。所有患者均在清晨空腹狀態(tài)下抽取前臂靜脈血，將其送檢分離血清。

1.3 觀察指標

分別記錄成纖維樣滑膜細胞中的OPG、RANKL、TNF-α、IL-17水平。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，定量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示，分析采用t檢驗和方差分析，兩兩比較采用Dunnett-t檢驗或SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義，P＞0.05表示差異無統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.13 組一般情況比較

表1顯示，3組患者的性別、年齡、病程比較差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.307，P=0.858;t=12.381，P=0.537;t=7.326，P=0.136)。

表13 組一般情況比較(±s)

表13 組一般情況比較(±s)

組別例數(shù)年齡病程A組性別男女29161348.3±5.63.7±1.1 B組28141449.1±5.33.5±1.3 C組28161248.7±4.93.8±1.3 t/χ20.30712.3817.326 P 0.8580.5370.136

2.2 不同組成纖維樣滑膜細胞中TNF-α、IL-17水平的比較

表2顯示，經(jīng)方差分析，A、B、C 3組與對照組的TNF-α、IL-17水平比較差異有統(tǒng)計學意義(F= 13.872，P=0.003;F=9.831，P=0.011)，兩兩比較，A、B、C 3組的TNF-α、IL-17水平均高于對照組(P＜0.05)，B、C 2組的TNF-α、IL-17水平低于A組(P＜0.05)，C組低于B組(P＜0.01)。

2.3 不同組成纖維樣滑膜細胞中OPG分泌、RANKL表達比較

圖1、2，表3顯示，經(jīng)方差分析，A、B、C 3組與對照組的OPG分泌、RANKL表達差異有統(tǒng)計學意義(F=9.856，P=0.008;F=7.392，P=0.039)，兩兩比較，A、B、C 3組的OPG分泌均高于對照組(P＜0.05)，B、C 2組的OPG分泌高于A組(P＜0.05)，C組高于B組(P＜0.01)，A、B、C 3組的RANKL表達均高于對照組(P＜0.05)，B、C 2組的OPG分泌低于A組(P＜0.05)，C組低于B組(P＜0.01)。

表2 不同組成纖維樣滑膜細胞中TNF-α、IL-17水平比較(±s，ng/L)

表2 不同組成纖維樣滑膜細胞中TNF-α、IL-17水平比較(±s，ng/L)

注:4組的TNF-α、IL-17水平經(jīng)方差分析(F=13.872，P=0.003，F(xiàn)= 9.831，P=0.011)，與對照組比較:※P＜0.05，與A組比較:△P＜0.05，與B組比較:aP＜0.01

組別例數(shù)TNF-αIL-17 A組2943.21±2.16※92.13±1.05※0.0030.011 B組2834.62±2.45※△73.87±0.97※△C組2827.17±1.98※△a67.83±1.22※△a對照組5025.04±1.7863.21±1.09 F 13.8729.831 P

表3 不同組成纖維樣滑膜細胞中OPG分泌、RANKL表達的比較(±s，%)

表3 不同組成纖維樣滑膜細胞中OPG分泌、RANKL表達的比較(±s，%)

注:4組的OPG分泌、RANKL表達經(jīng)方差分析(F=9.856，P= 0.008，F(xiàn)=7.392，P=0.039)，與對照組比較:aP＜0.05，與A組比較:bP＜0.05，與B組比較:cP＜0.01

OPGRANKL 組別例數(shù)A組295.18±2.08a47.51±1.01a0.0080.039 B組289.83±2.64ab44.85±2.68abC組2818.87±3.17abc41.56±3.35abc對照組503.23±1.0548.33±6.82 F 9.8567.392 P

圖1 OPG分泌情況(A為對照組，B、C、D分別對應為A、B、C組)

3 討論

類風濕疾病屬于中醫(yī)學“骨痹”范疇，其證候為患者關(guān)節(jié)出現(xiàn)疼痛、晨僵、腫脹以及屈伸不便［3］。類風濕患者還會出現(xiàn)神疲乏力、頭暈舌淡、脈象細等癥狀。該疾病主要以肝腎不足、精血虧損以及受風寒所引發(fā)。正如《素問·痹論》云:“風寒濕三氣雜至，合而為痹也?！蔽麽t(yī)認為，類風濕疾病為關(guān)節(jié)滑膜受損，使得關(guān)節(jié)損壞產(chǎn)生畸形，患者的日?；顒邮艿较拗疲?］。RANKL、TNF-α以及IL-17侵犯患者機體內(nèi)的關(guān)節(jié)滑膜引起滑膜炎，若患者病程時間過長，在晚期往往會導致患者關(guān)節(jié)異常變形，嚴重者會致殘，而其致殘的主要原因便是骨細胞遭到破壞［5］。有關(guān)文獻指出，類風濕關(guān)節(jié)炎主要是指骨侵蝕侵犯機體的各關(guān)節(jié)滑膜，在早期常常出現(xiàn)患者關(guān)節(jié)疼痛，并伴隨著早期骨細胞的丟失，若患者病程時間過長(≥2年)，在晚期往往會導致患者關(guān)節(jié)異常變形，這意味著其病理改變進入不可逆期進而致殘［6］。

圖2 RANKL表達情況(A為對照組，B、C、D分別對應為A、B、C組)

經(jīng)有關(guān)文獻記載，在大多數(shù)情況下，患者的體質(zhì)影響著機體對某些疾病的易患性和病變過程的傾向性，隨著人們生活水平的提高，大多數(shù)人的體質(zhì)正在逐漸改變，形盛體實、郁火內(nèi)生、濕熱蘊積已成為中醫(yī)常見的體質(zhì)癥狀［7］，而濕熱瘀阻證正是類風濕關(guān)節(jié)炎最主要的特征。清熱活血方藥可以有效地促進OPG含量的提升，其因子會以競爭方式與RANKL受體進行結(jié)合。還可以有效地抑制RANKL與RANK受體相結(jié)合，對破骨細胞的分化產(chǎn)生抑制作用，減弱破骨細胞活化，縮短破骨細胞存活的周期。對骨吸收也產(chǎn)生了抑制效果，OPG因子在骨代謝中起到了重要的調(diào)節(jié)作用［8］。該方中的黃芪具有較強的補氣作用，可有效改善患者貧血狀況，增加并調(diào)節(jié)患者機體內(nèi)的免疫功能，促進干擾素系統(tǒng)，提高抗體的抗病能力。黃芪還可以有效抑制細菌、病毒，降低血小板的黏附力，減少微血栓的形成，通絡(luò)止痛，消除類風濕患者關(guān)節(jié)腫痛;熟地黃可以有效地抗血液凝固，增強免疫力，提高淋巴細胞轉(zhuǎn)化，改善陰虛癥狀［9］;補骨脂具有補腎壯陽、通絡(luò)止痛、補脾健胃的作用;阿膠具有補陰血、益精填髓的效果，促進骨組織增長;炙甘草具有益氣作用，有效補充類風濕關(guān)節(jié)炎患者損失掉的能量，促進消化，提升患者食欲;大棗性溫，味道甘甜，具有補脾益氣與養(yǎng)血安神的效果，可以有效治療脾虛食少以及乏力等疾病;茯苓含有較多的糖分，具有抗菌、抗病毒的效果，促進患者細胞免疫與體液免疫，提高患者的抗病能力［10］。

實驗研究結(jié)果表明，RANKL屬于前體破骨細胞分化中的重要啟動因子。當該因子與RANK受體結(jié)合以后，會發(fā)揮刺激破骨細胞活化進而促進破骨細胞分化、提高破骨細胞存活的周期，從而抑制破骨細胞凋亡的作用［11］。清熱活血藥方成分中的黃芪、炙甘草、茯苓、丹參，可以刺激OPG含量的升高，從而達到清熱解毒、涼血散瘀、順暢關(guān)節(jié)的作用。有關(guān)文獻指出，類風濕關(guān)節(jié)炎骨破壞的重要細胞因子還包括IL-17和TNF-α，該因子誘導骨細胞破壞產(chǎn)生了刺激性。該因子屬于骨質(zhì)吸收與骨質(zhì)破壞中的重要細胞因子之一［12］。IL-17可以有效增加患者的成骨細胞，不斷提升間充質(zhì)細胞RANKL的表達?？梢杂行Т龠M患者破骨細胞的分化，對破骨細胞前體發(fā)育進行刺激，形成成熟的破骨細胞，對原有破骨細胞凋亡產(chǎn)生抑制作用。另外，IL-17還能誘導并協(xié)同TNF-α產(chǎn)生及發(fā)揮其作用［13］。而TNF-α正是導致關(guān)節(jié)骨破壞的重要因素，TNF-α對RNAKL產(chǎn)生誘導激活作用，對破骨細胞產(chǎn)生增殖與分化作用。該因子與TNF-β發(fā)生有效反應，刺激患者形成破骨細胞，從而參與骨細胞和骨關(guān)節(jié)的破壞［14］。本研究對患者不同劑量的清熱活血方藥治療，A、B、C 3組的TNF-α、IL-17水平均高于對照組(P＜0.05)，B、C 2組的TNF-α、IL-17水平低于A組(P＜0.05)，C組低于B組(P＜0.01)，且A、B、C 3組的OPG分泌均高于對照組(P＜0.05)，B、C 2組的OPG分泌高于A組(P＜0.05)，C組高于B組(P＜0.01);A、B、C 3組的RANKL表達均高于對照組(P＜0.05)，B、C 2組的OPG分泌低于A組(P＜0.05)，C組低于B組(P＜0.01)，說明清熱活血方藥的劑量越高可以有效抑制RA-HFLS中RANKL、TNF-α及IL-17OPG的表達，促進OPG的分泌［15］。

綜上所述，清熱活血方藥治療類風濕具有顯著的臨床療效，全面有效地控制病情進展，減少并發(fā)癥的發(fā)生。清熱活血方藥有效抑制RA-HFLS中RANKL、TNF-α及IL-17OPG的表達，促進OPG的分泌。該方藥減少西藥的副作用，安全性較高，值得在臨床中進一步推廣與使用。

［1］呂鷺萍，陳進春.中醫(yī)藥治療類風濕關(guān)節(jié)炎研究述評［J］.中醫(yī)學報，2012，6(8):757-758.

［2］Rooney T，Edwards CK 3rd，Gogarty M，et al.Synovial tissue rank ligand expression and radiographicprogression in rheumatoid arthritis:observations from a proof of concept randomized clinical trial of cytokineblockade［J］.Rheumatol Int，2010，30(12): 1571.

［3］蔣燕.濕熱體質(zhì)與疾病關(guān)系研究仁［J］.北京中醫(yī)藥大學學報，2012，28(4):16-18.

［4］姜泉，馮興華，王承德，等.清熱活血方治療類風濕關(guān)節(jié)炎患者71例臨床觀察［J］.中醫(yī)雜志，2012，53(6):488.

［5］姜泉，殷海波，羅成貴，等.清熱活血方藥治療類風濕關(guān)節(jié)炎骨破壞2年期放射學研究［J］.世界中西醫(yī)結(jié)合雜志，2012，7 (4):334.

［6］Singh P P，van der Kraan A G，Xu J，et al.Membrane-bound receptor activator of NF-κB ligand(RANKL)activity displayed by osteoblasts is differentially regulated by osteolytic factors［J］. Biochem Biophys ResCommun，2012，422(1):48.

［7］姜泉，蔣紅，曹煒，等.475例類風濕關(guān)節(jié)炎患者中醫(yī)臨床證候分析［J］.中醫(yī)雜志，2011，48(3):253-255.

［8］陳臘霞，王燕燕，中醫(yī)藥治療類風濕關(guān)節(jié)炎的研究進展［J］.中國藥房，2013，4(15):1420-1422.

［9］姜輝，高巍，尚偉，等.中藥有效成分防治類風濕關(guān)節(jié)炎研究進展［J］.中醫(yī)藥臨床雜志，2011，5(20):458-459.

［10］趙玲，胡耀華，柳潤輝，等.中藥治療類風濕關(guān)節(jié)炎及臨床應用的研究進展［J］.藥學實踐雜志，2011，11(25):416-425.

［11］董晶晶，劉春景.中醫(yī)藥治療類風濕關(guān)節(jié)炎研究概況［J］.實用中醫(yī)內(nèi)科雜志，2013，2(20):159-161.

［12］王亞媛，高薇，王燕，等，RNA干擾沉默信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子3對類風濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細胞增殖的影響［J］.中國全科醫(yī)學，2013，16(30):657-662.

［13］張利君.中醫(yī)治療類風濕關(guān)節(jié)炎的臨床療效分析［J］.中醫(yī)臨床研究，2011，9(25):28-29.

［14］張錦花，殷海波，石白.類風濕關(guān)節(jié)炎的病因病機與治療研究進展［J］.風濕病與關(guān)節(jié)炎，2013，7(28):62-66.

［15］董懷章.中醫(yī)聯(lián)合性治療類風濕關(guān)節(jié)炎的臨床效果分析［J］.中醫(yī)臨床研究，2011，12(25):22-23.

Analysis of Clearing Heat and Activating Blood Prescription Interfering on the OPG，RANKL，TNF-α and IL-17 Expression of Fibroblast Like Synovial Cells of Rheumatoid Arthritis Patients

LIU Yan-long，YANG Lin，LIU Juan-yun
(Sanmenxia central hospital affliated to henan university of science and technology，Sanmenxia 472000，China)

Objective:To analyze the Qing-re Huoxue Recipe on patients with rheumatoid arthritis fibroblast-like synovial cells(RA-HFLS)of OPG，RANKL，TNF-α，IL-17 expression.Methods:Different doses of heat and activating blood treating 85 cases of rheumatoid arthritis patients，detect fibroblast-like synovial cells OPG by ELISA，and IL-17 concentrations of TNF-α，the expression of RANKL protein detected by Western blot.Results:A，B，C three groups and the control group TNF-α，IL-17 levels，RANKL expression difference was statistically significant(F=13.872，P= 0.003;F=9.831，P=0.011;F=7.392，P=0.039)，A，B，C three groups higher，B，C groups lower in group A，group C than in group B;A，OPG secretion differences between B，C three groups and the control group was statistically significant(F=9.856，P=0.008)，A，B，C three groups higher，B，C in two high-group A，group C than in group B. Conclusion:Heat activating blood can inhibit RA-HFLS in RANKL，TNF-α expression and IL-17OPG and promote secretion of OPG.

Heat and activating blood;Rheumatoid arthritis;Fibroblast-like synovial cells

R285.5

:B

:1006-3250(2015)05-0549-04

2015-02-16

劉彥龍(1972-)，男，河南鄭州人，醫(yī)學本科，從事中西醫(yī)結(jié)合風濕免疫性疾病的臨床與研究。