粉被蟲草乙酸乙酯部化學(xué)成分研究

摘 " 要 " 用液體靜置發(fā)酵的方式培養(yǎng)粉被蟲草菌絲體，用75%酒精提取，利用萃取、柱層析、結(jié)晶、重結(jié)晶等方法，對(duì)粉被蟲草菌絲體的化學(xué)成分進(jìn)行了分離、純化，采用核磁等手段對(duì)分離到的物質(zhì)進(jìn)行鑒定。結(jié)果從粉被蟲草乙酸乙酯部分分離出6個(gè)物質(zhì)，將其中2個(gè)鑒定為腺嘌呤、尿苷，均為首次從粉被蟲草中分離得到。

關(guān)鍵詞 " 粉被蟲草;化學(xué)成分;乙酸乙酯;腺嘌呤;尿苷

中圖分類號(hào)：O656.2 " 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A " 文章編號(hào)：1673-890X（2015）25-050-03

知網(wǎng)出版網(wǎng)址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/50.1186.S.20150930.2333.040.html 網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015/9/30 23：33：00

粉被蟲草（Cordyceps pruinosa Petch）與冬蟲夏草同屬隸屬于真菌界（Fungi），子囊菌門（Asomycotsa），子囊菌綱（Ascomycetes），糞殼菌亞綱（Sordariomycetidae），肉座菌目（Hypocreales），麥角菌科（Clavicipitaceae），蟲草屬（Cordyceps），廣泛分布于世界各地[1]。粉被蟲草民間常作為藥物使用，以往研究表明其具有抗輻射[2-3]、抗真菌、抗細(xì)菌[4]、免疫調(diào)節(jié)[5]及調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)等作用[6];近期研究表明，其甲醇提取物通過(guò)抑制NF-κB依賴的炎癥基因的表達(dá)來(lái)抑制炎癥，暗示其有治療內(nèi)毒素性休克或敗血癥的潛在價(jià)值[7]，在食品、醫(yī)藥領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用前景[6]。但是目前關(guān)于粉被蟲草化學(xué)成分、活性成分的報(bào)道非常少，從粉被蟲草僅分離到幾個(gè)化合物：N6-（2-羥乙基）-腺苷[8]、多糖ps1、多糖ps2[9]、一種分子式為C26H32O9的天然色素[10]和蟲草素[11]。

粉被蟲草的很多藥理作用都是建立在其粗提物上，其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)還未弄清，其化學(xué)成分也不清楚，限制了這一資源蟲草的深度開發(fā)利用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

粉被蟲草GZUCC 8552菌株保藏于教育部西南藥用生物資源工程研究中心。

1.1.2 供試培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g切塊，水煮沸30 min，過(guò)濾取汁，加入葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水補(bǔ)足1000 mL，pH自然。

種子培養(yǎng)基：蔗糖10 g、葡萄糖5 g、甘油10 g、黃豆粉5 g、酵母膏1 g、磷酸二氫鉀1 g、硫酸鎂10 g、氯化鉀0.5 g、7水硫酸亞鐵0.01 g、水1000 mL。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、葡萄糖10 g、蔗糖10 g、硫酸鎂1 g、磷酸二氫鉀1 g、磷酸氫二鉀0.5 g、水1000 mL、pH值自然。

以上培養(yǎng)基均在0.1 MPa，121 ℃的條件下高壓蒸汽滅菌30 min。

1.1.3 試劑

試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.4 主要儀器與設(shè)備

XT-2型雙目顯微熔點(diǎn)測(cè)定儀（北京泰克儀器有限公司），溫度計(jì)未校正;EI-MS用HP-5973型質(zhì)譜儀（HP，美國(guó)）測(cè)定;ESI-MS由HP1100MSD型質(zhì)譜儀（HP，美國(guó)）測(cè)定;核磁共振譜用取OVA-400核磁共振儀（Varian，美國(guó)）測(cè)定，TMS為內(nèi)標(biāo)。柱層析用硅膠（40～80目、200～300目、300～400目，硅膠H），薄層層析用硅膠（GF254）及GF254薄層層析板均為青島海洋化工廠分廠產(chǎn)品;大孔樹脂AB-8，天津市津達(dá)正通環(huán)保科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 粉被蟲草菌絲體的發(fā)酵制備

按照前述培養(yǎng)方法，于室溫（約20℃）靜置培養(yǎng)120 d，菌絲體用蒸餾水洗滌后，60℃烘干，粉碎過(guò)60目篩，備用。

1.2.2 粉被蟲草次生代謝產(chǎn)物的提取和分離

3 kg粉被蟲草干粉─→75%乙醇，1∶8料液比，超聲30 min，提取3次─→濾液減壓濃縮合并成懸液─→上AB-8凝膠柱─→0%，10%，30%，50%，70%，100%乙醇梯度洗脫組分─→將除30%乙醇部分合并減壓濃縮，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃?。ㄝ腿≈禑o(wú)色），減壓濃縮得到4個(gè)萃取部分，對(duì)氯仿和乙酸乙酯部分進(jìn)行分離。

將乙酸乙酯部分，用適量硅膠拌勻，用石油醚、丙酮按100∶0， 50∶1， 20∶1， 5∶1，1∶1上硅膠柱（200～300目）梯度洗脫，每個(gè)濃度洗3個(gè)柱體積;各部分合并減壓濃縮，上小硅膠柱（300～400目），用石油醚、丙酮按70∶1， 30∶1， 15∶1， 8∶1， 3∶1進(jìn)行梯度洗脫，分段收集。

1.2.3 粉被蟲草化學(xué)成分的鑒定

對(duì)分離到的化合物，綜合運(yùn)用現(xiàn)代波譜技術(shù)（EI-MS、1H-NMR、13C-NMR、DEPT等）和熔點(diǎn)儀等傳統(tǒng)手段進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。

2 結(jié)果與分析

經(jīng)反復(fù)的柱層析，結(jié)晶與重結(jié)晶，分離純化化合物。乙酸乙酯部分：在大柱石油醚、丙酮（50∶1）部分，小柱石油醚、丙酮（30∶1）段分得物質(zhì)1，小柱石油醚、丙酮（15∶1）段分得物質(zhì)2;在大柱石油醚、丙酮（20∶1）部分，小柱石油醚、丙酮（1∶1）段分得物質(zhì)3;在大柱石油醚、丙酮（5∶1）部分，小柱石油醚、丙酮（8∶1）段分得物質(zhì)4，小柱石油醚、丙酮（15∶1）段分得物質(zhì)5;在大柱石油醚、丙酮（1∶1）部分，小柱石油醚、丙酮（3∶1）段分得物質(zhì)6。

從粉被蟲草菌粉中分離到6個(gè)物質(zhì)，對(duì)較純的物質(zhì)3， 6進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定，其理化特性和波譜數(shù)據(jù)依次如下。

化合物1：白色粉末。EI-MS m/z 136.1 [M + H]+。1H-NMR （400 MHz， DMSO-d6， δ） 8.12（2H， br.s， 2， 8-H）， 7.12（2H ， s， 6 -NH2）。13C-NMR（100 MHz， DMSO-d6， δ）： 155.8 （C-6）， 152.4 （C-2）， 150.3 （C-4）， 139.0 （C-8）， 118.5 （C-5）。以上數(shù)據(jù)與陳泉等（2002）[12]報(bào)道一致，鑒定其為腺嘌呤。

化合物2：白色粉末。EI-MS m/z 267.0 [M + Na]+。1H NMR （1 MHz， DMSO） δ： 7.9 （1H， d， J=8.5Hz， H-6）， 5.8 （1H， d，J=4.5Hz， H-1′）， 5.7 （1H， d， J=8.5Hz， H-5）， 3.8 （1H， m， J=12.0， 2.5Hz， H-5′a）。13C NMR （101 MHz， DMSO）δ： 163.3 （C-4）， 150.9 （C-2）， 140.9 （C-6）， 101.9 （C-5）， 87.8 （C-1′）， 84.8 （C-4′）， 73.6 （C-3′）， 70.0（C-2′）， 60.9 （C-5′）。以上數(shù)據(jù)與鄧雁如等（2005）[13]報(bào)道一致，鑒定其為尿苷。

3 結(jié)論與討論

采用液體靜置培養(yǎng)的方式發(fā)酵粉被蟲草菌絲體，用75%酒精對(duì)菌粉進(jìn)行超聲提取，經(jīng)萃取、反復(fù)柱層析進(jìn)行分離純化，從乙酸乙酯部分分離出6個(gè)物質(zhì)，其中2個(gè)經(jīng)核磁鑒定為腺嘌呤、尿苷，均為首次從粉被蟲草中分離得到。

腺嘌呤是核酸中發(fā)現(xiàn)的2個(gè)重要嘌呤之一，它是含有氮原子共軛體系的雜環(huán)化合物，在基因表達(dá)和基因復(fù)制中起著主要作用，具有誘導(dǎo)植物細(xì)胞伸長(zhǎng)生長(zhǎng)的功能[14]。

尿苷，參與糖原合成，有助于提高細(xì)胞的耐缺氧能力;它也是構(gòu)成動(dòng)物細(xì)胞核酸的成分，能提高機(jī)體抗體水平。尿苷和肌苷等合用能促進(jìn)心肌細(xì)胞代謝，加速蛋白質(zhì)、核酸生物合成和能量產(chǎn)生，可促進(jìn)和改善腦細(xì)胞代謝;還可以用來(lái)阻斷各種癌細(xì)胞和病毒的基因合成，治療癌癥和由病毒引起的疾病[15]。

目前關(guān)于粉被蟲草的化學(xué)成分、活性成分的報(bào)道非常少，在蟲草屬其他相近種中也有相似成分報(bào)道，比如冬蟲夏草中和蛹蟲草中也含有腺嘌呤、尿苷[16-17]。因此，粉被蟲草可以作為冬蟲夏草的替代品。

粉被蟲草作為藥物在民間長(zhǎng)期使用，本身有多種生理作用，但是其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)并不清楚。本研究將為這些化合物提供新的生物來(lái)源，同時(shí)為粉被蟲草的深度開發(fā)利用提供科學(xué)參考。

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（責(zé)任編輯：丁志祥）