番茄毛狀根誘導(dǎo)影響因素研究進(jìn)展

摘 要 毛狀根培養(yǎng)技術(shù)是在植物基因工程和植物細(xì)胞工程相互融合基礎(chǔ)上發(fā)展的一種新的培養(yǎng)技術(shù)。毛狀根培養(yǎng)系統(tǒng)與常規(guī)植物組織培養(yǎng)技術(shù)相比，具有生長(zhǎng)快、易于培養(yǎng)、有效物質(zhì)產(chǎn)量高的優(yōu)點(diǎn)。綜述了發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)番茄產(chǎn)生毛狀根的影響因素，包括發(fā)根農(nóng)桿菌的菌株類(lèi)型、外植體類(lèi)型、預(yù)培養(yǎng)和共培養(yǎng)時(shí)間、侵染時(shí)間、菌液濃度、抗生素、外源生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和化學(xué)因子，并對(duì)番茄毛狀根誘導(dǎo)存在的問(wèn)題進(jìn)行展望。

關(guān)鍵詞 發(fā)根農(nóng)桿菌；番茄；毛狀根；誘導(dǎo)因素

中圖分類(lèi)號(hào)：Q812 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1673-890X（2015）34-053-05

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毛狀根培養(yǎng)技術(shù)是在植物基因工程和植物細(xì)胞工程相互融合基礎(chǔ)上發(fā)展的一種新的培養(yǎng)技術(shù)[1]。毛狀根發(fā)根是由發(fā)根農(nóng)桿菌（Agrobacterium rhizogenes）侵染雙子葉植物、裸子植物或少數(shù)單子葉植物，在植物侵染部位或周?chē)a(chǎn)生大量不定根，而獲得的毛狀根所再生的植株，不僅表現(xiàn)出抗逆境能力強(qiáng)、葉片皺縮、節(jié)間縮短等現(xiàn)象，而且還能提高產(chǎn)量，次生代謝含量很大程度上高于原品種。國(guó)外已利用發(fā)根農(nóng)桿菌獲得次生代謝產(chǎn)物，在這方面有深入的研究，其中許多植物（如紫草、甜菜、蘿卜、長(zhǎng)春花等）的發(fā)根已進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)；國(guó)內(nèi)在利用發(fā)根農(nóng)桿菌獲得轉(zhuǎn)基因植物和生產(chǎn)次生代謝方面也取得了可喜的成績(jī)，獲得了油菜、甘草、甘藍(lán)、決明、西洋參、番茄等植物的發(fā)根，有的還得到了轉(zhuǎn)基因植物，有的在發(fā)根中檢測(cè)到了次生代謝[2]。

番茄紅素（Lycopene）是一種天然類(lèi)胡蘿卜素，而類(lèi)胡蘿卜素也是三大次生代謝產(chǎn)物之一（萜烯類(lèi)化合物），其猝滅單線態(tài)氧和清除自由基能力是最強(qiáng)的[3]。番茄紅素具有抗氧化能力，能有效降低癌癥、心血管病、血脂病、血糖病等多種疾病的發(fā)病率，能增強(qiáng)免疫細(xì)胞活性，預(yù)防骨質(zhì)疏松，抗炎癥、抗凝血，降低總膽固醇含量等[4-11]。番茄紅素主要存在于番茄、西瓜、葡萄柚和番石榴等植物中，其中以番茄相對(duì)含量最高，達(dá)到0.2～20 mg/100 g，但絕對(duì)含量依然很低，且不同品種及不同成熟程度含量也明顯不同[12]。毛狀根培養(yǎng)技術(shù)是提高番茄中番茄紅素最有效的途徑之一，而發(fā)根農(nóng)桿菌的菌株類(lèi)型、外植體的類(lèi)型、預(yù)培養(yǎng)和共培養(yǎng)時(shí)間、侵染時(shí)間和菌液濃度、抗生素及外源生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和化學(xué)因子均是發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)番茄產(chǎn)生毛狀根的影響因素。本文就近些年番茄毛狀根研究進(jìn)展進(jìn)行系統(tǒng)闡述，并對(duì)番茄毛狀根誘導(dǎo)問(wèn)題作展望。

1發(fā)根農(nóng)桿菌的生物學(xué)特征及分類(lèi)

發(fā)根農(nóng)桿菌是一種寄生非常廣泛的土壤細(xì)菌[13]，為根瘤科（Rhizobiaceae）農(nóng)桿菌屬（Agrobacterium）的一種革蘭氏陰性菌，外形呈桿狀，具鞭毛，其內(nèi)具有誘導(dǎo)毛狀根產(chǎn)生的Ri質(zhì)粒[2]，Ri質(zhì)粒是發(fā)根農(nóng)桿菌染色體外一個(gè)巨大的侵入性根誘導(dǎo)質(zhì)粒，為共價(jià)閉合環(huán)狀DNA，大小為200～800 kb，具有獨(dú)立的遺傳復(fù)制能力，按其功能的不同主要有T-DNA區(qū)（Transfer-DNA region）、Vir區(qū)（Virulence region）、Ori區(qū)（Origin of replication）、冠癭堿代謝功能區(qū)（OPCA， Opine catabolism region）[14]。T-DNA區(qū)意為“轉(zhuǎn)移進(jìn)入植物細(xì)胞核的轉(zhuǎn)移區(qū)”，Vir意為“致瘤區(qū)”。

發(fā)根農(nóng)桿菌侵染植物后，T-DNA在Vir區(qū)的脅迫下能夠轉(zhuǎn)移并整合到植物基因組中，利用植物的營(yíng)養(yǎng)成分編碼合成冠癭堿，根據(jù)侵染產(chǎn)生冠癭堿種類(lèi)的不同，Ri質(zhì)粒可以分為農(nóng)桿堿（agropine）型、黃瓜堿（cucronpine）型、甘露堿（mannopine）型和異黃瓜堿（mikimonpine）型，其中含農(nóng)桿堿型Ri質(zhì)粒上的菌株具更廣泛的宿主范圍和發(fā)根性[15]。

2發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)毛狀根的影響因素

2.1菌株類(lèi)型

目前常用的發(fā)根農(nóng)桿菌菌株有ATCC15834、R1000、A4、R1601、C58C1等，在誘導(dǎo)植物產(chǎn)生毛狀根的菌株中，A4菌株使用率（27%）> ATCC15834（20%）> R1601（14%）；不同植物對(duì)于不同菌株的敏感性差異較大[16]，同種植物對(duì)于不同菌株的敏感性也有一定的差異。胡霄等[17]以番茄子葉為外植體，選用R1000、A4和ATCC15834菌株對(duì)其進(jìn)行轉(zhuǎn)化，結(jié)果表明，當(dāng)番茄苗齡為12～16 d、菌液濃度OD600=0.4～0.6時(shí)，A4菌株（29.6%）的誘導(dǎo)率均大于R1000（7.4%）和ATCC15834（17.3%）。郝瑞文[18]利用A4、9402Bin19、ATCC15834這3個(gè)發(fā)根農(nóng)桿菌菌株感染懷牛膝的葉切片和莖段外植體，獲得毛狀根轉(zhuǎn)化體系，并篩選了優(yōu)質(zhì)株系，其中3個(gè)菌株誘導(dǎo)毛狀根的頻率明顯不同，ATCC15834的轉(zhuǎn)化頻率最高，為60%～80%，A4的轉(zhuǎn)化頻率為40%～55%，9402Bin19的轉(zhuǎn)化頻率最低，為30%～40%。因此，利用不同菌株轉(zhuǎn)化同一植株部位，或利用同種菌株轉(zhuǎn)化同一植株不同部位，或利用同種菌株轉(zhuǎn)化同一植株同一部位的不同生理期，毛狀根誘導(dǎo)率均存在差異。

2.2外植體類(lèi)型

發(fā)根農(nóng)桿菌已在許多植物（番茄、棉花、人參等）的外植體上誘導(dǎo)出毛狀根，不同外植體（葉片、莖、子葉、愈傷組織、下胚軸等）誘導(dǎo)植株產(chǎn)生毛狀根存在差異。黃彩紅等[19]利用發(fā)根農(nóng)桿菌對(duì)2個(gè)番茄品種（P26和組培大黃）的子葉、下胚軸（上、中、下部位）4種外植體進(jìn)行誘導(dǎo)，結(jié)果表明，P26番茄的誘導(dǎo)率，子葉（平均為36.7%）>下胚軸中部（28.8%）>下胚軸下部（26.6%）>下胚軸上部（9.5%）；而組培大黃的下胚軸上部（平均為24.5%）>下胚軸下部（22.4%）>子葉（21.2%）>下胚軸中部（18.3%）。胡霄等[17]利用發(fā)根農(nóng)桿菌ATTCC15834對(duì)番茄無(wú)菌苗的不同部位（子葉、下胚軸、葉片）進(jìn)行誘導(dǎo)并產(chǎn)生毛狀根，結(jié)果表明，只有子葉能長(zhǎng)出穩(wěn)定的毛狀根；下胚軸有少量毛狀根產(chǎn)生，但容易出現(xiàn)褐化，并且不易脫菌；葉片出現(xiàn)褐化且無(wú)毛狀根產(chǎn)生，這可能是因?yàn)樽尤~和下胚軸的再生能力強(qiáng)；葉片在處理過(guò)程中容易被風(fēng)干，傷口處的細(xì)胞容易死亡，從而影響其侵染；而下胚軸在侵染以后，很難將其多余菌液吸干，造成不易脫菌。一般認(rèn)為，幼嫩的、生長(zhǎng)旺盛的植物組織對(duì)發(fā)根農(nóng)桿菌更敏感，有利于菌株的侵染，適宜作為誘導(dǎo)植株產(chǎn)生毛狀根的外植體。

2.3預(yù)培養(yǎng)和共培養(yǎng)時(shí)間

2.3.1 預(yù)培養(yǎng)時(shí)間

外植體經(jīng)過(guò)預(yù)培養(yǎng)后能促進(jìn)細(xì)胞分裂，分裂的細(xì)胞更容易整合外源DNA，從而提高外源基因的轉(zhuǎn)化效率；同時(shí)，通過(guò)預(yù)培養(yǎng)還能提高外植體的適應(yīng)能力，使其能夠適應(yīng)離體培養(yǎng)的條件，保持活躍的生長(zhǎng)狀態(tài)[20]。任永霞等[21]研究表明，不經(jīng)預(yù)培養(yǎng)直接侵染的3個(gè)番茄品種（‘東農(nóng)709’、‘東農(nóng)708’和‘東農(nóng)704’）的子葉均變白、變褐、萎蔫，無(wú)產(chǎn)生抗性愈傷組織的能力，而經(jīng)過(guò)預(yù)培養(yǎng)2或5 d后抗性愈傷誘導(dǎo)率均較高，且不同品種間也有差別，東農(nóng)704誘導(dǎo)率最高（42.2%），東農(nóng)708其次（28.9%），東農(nóng)709最低（27.9%）；且隨著預(yù)培養(yǎng)時(shí)間的不同，抗性誘導(dǎo)率也不同，子葉（東農(nóng)709品種外植體）預(yù)培養(yǎng)2和5 d，而后侵染10、15和20 min，其5 d預(yù)培養(yǎng)且侵染10、15和20 min的抗性愈傷誘導(dǎo)率（37.0%、27.9.5%和26.3%）均大于2 d預(yù)培養(yǎng)且侵染10、15和20 min的抗性愈傷誘導(dǎo)率（32.1%、21.6和11.6%）。

2.3.2 共培養(yǎng)時(shí)間

共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)誘導(dǎo)植株產(chǎn)生毛狀根的頻率也有影響，這是因?yàn)榘l(fā)根農(nóng)桿菌的T-DNA轉(zhuǎn)移與整合需要一定的時(shí)間，所以為了能夠保證充分轉(zhuǎn)化，一般都將外植體放在不含抗生素的培養(yǎng)基上共培養(yǎng)2 d左右，進(jìn)行除菌[20]。陳雙臣等[22]、劉晶等[23]和王婷婷[24]研究均表明，共培養(yǎng)2 d對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)番茄轉(zhuǎn)化是最優(yōu)的。

2.4侵染時(shí)間和菌液濃度

2.4.1 侵染時(shí)間

侵染時(shí)間是影響發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)植物外植體產(chǎn)生毛狀根的關(guān)鍵因素。侵染時(shí)間過(guò)短，發(fā)根農(nóng)桿菌不能對(duì)植物細(xì)胞進(jìn)行充分附著；侵染時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，發(fā)根農(nóng)桿菌則容易對(duì)植物細(xì)胞造成傷害[15]。不同的學(xué)者采用了不同的侵染時(shí)間來(lái)誘導(dǎo)番茄產(chǎn)生毛狀根，梁超[25]用OD600為0.3的菌液侵染預(yù)培養(yǎng)2 d的番茄子葉，結(jié)果表明，當(dāng)侵染3、6和10 min時(shí)，抗性芽的生成率分別是8.6%、24.8%和1.4%。王金華等[26]對(duì)預(yù)培養(yǎng)的天數(shù)（1、2和3 d）、農(nóng)桿菌液的倍數(shù)（10、20和30倍）、侵染時(shí)間（10、20和30 min）、共培養(yǎng)天數(shù)（1、2和3 d）這四因素，采用L9（34）正交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，預(yù)培養(yǎng)3 d、農(nóng)桿菌的稀釋倍數(shù)30倍、侵染時(shí)間20 min和共培養(yǎng)天數(shù)2 d，可達(dá)到最佳的遺傳轉(zhuǎn)化效果。

2.4.2 菌液濃度

菌液濃度對(duì)毛狀根的誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化也存在差異，不同植物、不同外植體誘導(dǎo)毛狀根所需菌液濃度不同，菌液濃度的高低直接影響著農(nóng)桿菌侵染效率[15]。番茄遺傳轉(zhuǎn)化所用農(nóng)桿菌菌液濃度多為OD600=0.2～0.6。胡霄等[17]以番茄子葉為外植體，在8～12 d的苗齡時(shí)，ATCC15834菌株的誘導(dǎo)率在侵染菌液濃度OD600=0.4～0.6時(shí)誘導(dǎo)率最高，可以達(dá)到58.8%；在8～12 d的苗齡時(shí)，R1000菌株誘導(dǎo)率隨侵染濃度增加而增加，OD600=0.2～0.4、0.4～0.6和0.6～0.8，誘導(dǎo)率分別為13.0%、17.0%和25.5%。

2.5抗生素及外源生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑

在遺傳轉(zhuǎn)化中，頭孢霉素、卡那霉素和潮霉素是使用較廣泛的抗生素，抗生素種類(lèi)和濃度對(duì)植物轉(zhuǎn)化效率有不同的效果，合適的抗生素不僅能起到良好的抑菌效果，而且有利于植物產(chǎn)生毛狀根。陳珍和朱誠(chéng)[27]研究表明，以卡那霉素抗性基因作為篩選標(biāo)記的植物表達(dá)載體質(zhì)粒p2301和pBI121，其轉(zhuǎn)化頻率高于以潮霉素抗性基因?yàn)楹Y選標(biāo)記的植物表達(dá)載體pl301；其中在MB0誘導(dǎo)培養(yǎng)基添加不同梯度（200、400、600和800 mg/L）的頭孢霉素，番茄子葉外植體的再生頻率分別為73.33%、60%、66.7%。

毛狀根培養(yǎng)系統(tǒng)具有生長(zhǎng)快速、不需外源植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、合成次生代謝物質(zhì)能力強(qiáng)而且穩(wěn)定，并能向培養(yǎng)液釋放部分代謝產(chǎn)物等優(yōu)點(diǎn)，但加入適當(dāng)濃度外源生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，更能促進(jìn)毛狀根次級(jí)代謝產(chǎn)物的積累[28]。王婷婷[24]以不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑（ZT、IAA和GA）及濃度進(jìn)行組合，結(jié)果表明，番茄子葉誘導(dǎo)芽分化最佳的ZT與IAA組合是“MS+ZT2.0 mg/L+IAA0.1 mg/L”，不定芽分化效率達(dá)到了95.0%。趙明珠和張美萍[29]以‘大紅番茄’‘紅牛奶番茄’和‘粉冠888’這3種無(wú)菌番茄苗的子葉為外植體，對(duì)其分化培養(yǎng)基及生根培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，結(jié)果表明，‘粉冠888’可為遺傳轉(zhuǎn)化提供大量穩(wěn)定的外植體來(lái)源，適宜的分化培養(yǎng)基為“MS+6-BA 1.0～2.0 mg/L+IAA 0.2 mg/L”，生根培養(yǎng)基為“MS+IAA 0.5 mg/L”。

2.6化學(xué)因子

植物細(xì)胞能分泌某些酚類(lèi)化合物，可誘發(fā)農(nóng)桿菌內(nèi)Ti或Ri質(zhì)粒DNA上Vir區(qū)基因的活化和高效表達(dá)，促進(jìn)農(nóng)桿菌T-DNA向宿主細(xì)胞核轉(zhuǎn)移，從而提高遺傳轉(zhuǎn)化效率，其中誘導(dǎo)效果最佳的是乙酰丁香酮（AS），而AS因其較強(qiáng)的誘導(dǎo)性，已在許多植物如毛白楊、煙草、玉米、番茄等使用，大大提高了其轉(zhuǎn)化率[30]。有些研究表明，AS必須在誘導(dǎo)培養(yǎng)液中和共培養(yǎng)的培養(yǎng)基中同時(shí)使用，才能大大提高轉(zhuǎn)化效率[31]，目前，在大多數(shù)的研究中，無(wú)論是誘導(dǎo)培養(yǎng)基還是共培養(yǎng)基，AS的有效濃度一般為50～200 μmol/L[32-33]。另外，也有研究者認(rèn)為高濃度的乙酰丁香酮對(duì)葉片有毒害作用，但其毒害機(jī)制尚不清楚[34]。因此，在番茄遺傳轉(zhuǎn)化中，AS使用濃度有待進(jìn)一步探討。

此外，一些金屬離子（Cu2+和Ag+）能夠很好地誘導(dǎo)蕎麥[35]和駱駝刺[36]產(chǎn)生毛狀根。在今后番茄的遺傳轉(zhuǎn)化中，也可以嘗試使用一些金屬離子，以提高轉(zhuǎn)化效率。

3問(wèn)題及展望

毛狀根培養(yǎng)系統(tǒng)與常規(guī)植物組織培養(yǎng)技術(shù)相比，具有生長(zhǎng)快、易于培養(yǎng)、有效物質(zhì)產(chǎn)量高的優(yōu)點(diǎn)，具有巨大的發(fā)展?jié)摿蛷V闊的應(yīng)用前景。但毛狀根培養(yǎng)系統(tǒng)大多用于生產(chǎn)藥用植物的次生代謝產(chǎn)物上，在果蔬作物上應(yīng)用研究很少。隨著研究的不斷深入，還有一些問(wèn)題待解決，如目前發(fā)根農(nóng)桿菌不同菌株侵染相同番茄品種的能力或相同菌株侵染不同番茄品種的能力差異機(jī)制尚不明確；發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)番茄產(chǎn)生毛狀根的眾多因素，相互制約、相互促進(jìn)，在眾多因素尋找一個(gè)切合點(diǎn)（即番茄模式植物）至關(guān)重要；利用毛狀根體系適應(yīng)逆境（干旱）環(huán)境和生產(chǎn)番茄次生代謝大多處于實(shí)驗(yàn)研究階段，較少將其作為一種生物反應(yīng)器應(yīng)用于工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)，這些都需要研究者進(jìn)行更深入、更成熟的探究。

隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，對(duì)發(fā)根農(nóng)桿菌的功能及其應(yīng)用方面進(jìn)一步深化了解，未來(lái)期望對(duì)Ri質(zhì)粒上的rolB基因?qū)崿F(xiàn)準(zhǔn)確有效的轉(zhuǎn)化與調(diào)控，達(dá)到產(chǎn)生特定次生代謝產(chǎn)物、定性改良性狀的目的，從而為解決番茄生產(chǎn)上適應(yīng)逆境（干旱）環(huán)境和大量生產(chǎn)次生代謝物及優(yōu)良品種等培育體系提供一條全新的途徑。

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（責(zé)任編輯：丁志祥）