中國東北人群中轉(zhuǎn)化生長因子-α基因rs3771494單核苷酸多態(tài)性與非綜合征唇腭裂的關(guān)系*

胥威 盧永平 韓維田 宋方田

非綜合征唇腭裂（nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate，NSCL/P）是指不伴有其他先天畸形的唇腭裂，是人類最常見的先天性畸形之一，是一種遺傳、環(huán)境因素及兩者相互作用所致的多基因多因素遺傳疾病[1-5]。單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）是新一代遺傳標(biāo)記，由于其密度高、遺傳穩(wěn)定性好、具有代表性、分析易自動化等特性成為第3代基因遺傳標(biāo)記，被認(rèn)為是影響人類疾病易感性和藥物反應(yīng)的決定性因素[6]。在臨床工作中，可以利用單核苷酸多態(tài)性這種最新的遺傳標(biāo)記尋找疾病的致病基因，診斷及預(yù)測疾病發(fā)生風(fēng)險。其中，首次被提出的易感基因是轉(zhuǎn)化生長因子-α（transforming growth factor-α，TGF-α）基因（定位于2p13），有研究證實(shí)TGF-α基因Tag I的特定C2等位基因與非綜合征唇腭裂有關(guān)系，而隨后有部分學(xué)者則沒有得到類似的結(jié)論。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了TGF-α基因的356個SNP和20個插入/缺失與非綜合征唇腭裂的發(fā)病相關(guān)[7]。由于地區(qū)環(huán)境和種族差異的影響，該基因在不同文獻(xiàn)的結(jié)果也有所區(qū)別。本研究以東北地區(qū)236例非綜合征唇腭裂患者及400例正常人為研究對象，用基因芯片的方法檢測TGF-α基因rs3771494多態(tài)性，用以分析東北地區(qū)人群非綜合征唇腭裂與TGF-α基因多態(tài)性的相關(guān)性，現(xiàn)具體報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2008-2012年在中國醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院就診治療的非綜合征唇腭裂患者236例作為病例組，排除其他系統(tǒng)畸形及綜合征唇腭裂，包括先天性心臟病伴唇腭裂、范伍德綜合征、腭心面綜合征及歌舞伎面綜合征等。非綜合征唇腭裂患者年齡1~35歲，平均（9.96±6.84）歲。其中男127例，女109例，男女比例為1.17：1。正常對照400例，年齡3~36歲，平均（10.12±7.67）歲，其中男215例，女185例，男女比例為1.16∶1。病例組及對照組樣本均為東北地區(qū)人，均簽署了知情同意書。

1.2 儀器與試劑 點(diǎn)樣儀（Nano-Plotter 2.1，GeSiM，德國），GenePix 4000B共聚焦激光掃描儀（Axon Instruments，USA）；TIANamp血 液 DNA 提 取 試劑 盒（TIANGEN）；TGF-α 基 因 PCR擴(kuò) 增 引物： 上 游：TCACTTCCCCTTTTTCATCTG， 下 游：CGAGGAGGCTCCTGAGGTG（金斯瑞生物科技有限公司合成），產(chǎn)物長度為179 bp。DNA聚合酶采用NEB的vent DNA聚合酶。EXOI（Takara），堿性磷酸酶（Takara）。芯片的制備及基因型檢測所用探針和特異性延伸引物及陽性對照（南京生物科技有限公司合成）見表1。

表1 TGF-α基因rs3771494位點(diǎn)的探針和特異性延伸引物

1.3 方法 全基因組DNA提取、PCR擴(kuò)增、特異性引物延伸、雜交及基因芯片結(jié)果掃描。所有患者抽取靜脈血5 mL，EDTA抗凝，-20 ℃凍存?zhèn)溆?。所有患者均?00 μL外周血，利用TIANGEN全基因組核酸提取試劑盒提取白細(xì)胞全基因組DNA后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)在20 μL中進(jìn)行，其中包括基因組DNA 2.5 ng， 引 物 0.4 μM，dNTP 0.125 mM，1×buffer，ventDNA聚合酶0.05 U；PCR循環(huán)條件為94 ℃變性5 min，然后 94 ℃變性 30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)35次，72 ℃延伸10 min，最后4 ℃終止延伸。PCR產(chǎn)物進(jìn)行特異性引物延伸，體系為15 μL：5 μL PCR產(chǎn)物，0.02 U ventR（exo-）DNA聚合酶，0.375 μL dATP，0.375 μL dTTP，0.375 μL dGTP，0.375 μL Cy3-dCTP，0.025 μM特異性延伸引物。延伸產(chǎn)物與預(yù)先準(zhǔn)備好的芯片雜交，洗后用共聚焦激光掃描儀（GenePix 4000 B）掃描結(jié)果。GenePix 6.0讀取每條探針的熒光信號強(qiáng)度值?；蛐屯ㄟ^計算每個位點(diǎn)的等位基因分?jǐn)?shù)（AF）讀取，AF=等位基因B/（等位基因A+等位基因B）。AF<0.4，0.4≤AF≤0.6及AF>0.6分別為等位基因A純合子，雜合子AB及等位基因B純合子。通過計算結(jié)果讀取基因型。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 所得數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用 字2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

病例組基因型TC、CC及TC+CC的頻率均高于對照組，比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表2。

表2 TGF-α基因rs3771494位點(diǎn)的基因分布情況及其分析 例（%）

3 討論

唇腭裂是最為常見的顏面部畸形，其發(fā)病率約0.018%，位居圍產(chǎn)兒出生缺陷的第4位，屬多基因遺傳病，男多于女[8]。近年來，有關(guān)唇腭裂的基因定位研究是該領(lǐng)域的一個熱點(diǎn)，國內(nèi)外學(xué)者已做了大量的研究工作，提出了相關(guān)的染色體易感位點(diǎn)：3p21.2、6p23-p25、16p13.3（MMP25）、2p13 和 16q22-q24等；易感基因：TGF-α、TGF-β、MSX1、MTHFR、RARA、BCL3和IRF6等[9]。其中TGF-α基因是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最有價值的與非綜合征唇腭裂致病有關(guān)的基因之一[10-14]。

面部胚胎發(fā)育包括神經(jīng)嵴細(xì)胞的發(fā)育和遷移，腮弓的形成，幾個面突的出現(xiàn)、運(yùn)動和相互融合等幾個連續(xù)的過程，同時受生長因子（表皮生長因子和轉(zhuǎn)化生長因子等）和甾類/甲狀腺/視黃酸超家族的調(diào)控，其中任何一個過程和參與調(diào)控的因子的作用受到干擾，都可能導(dǎo)致唇腭裂的發(fā)生。TGF-α是一種多肽類生長因子，為人表皮生長因子（epidermal growth factor， EGF）家族的重要成員，具有多種生物學(xué)活性，它能激活受體上的酪氨酸激酶，激活MAPK信號系統(tǒng)（Raf-MEK-ERK），ERK通路激活后，信號傳導(dǎo)因子細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）進(jìn)入細(xì)胞核，引起轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化，導(dǎo)致細(xì)胞增殖。因此認(rèn)為可能是TGF-α基因多態(tài)性改變了TGF-α的空間結(jié)構(gòu)、組織表達(dá)及TGF-α在腭突組織中正常的表達(dá)，從而影響唇腭的正常發(fā)育。有研究表明在胚胎發(fā)育，特別是腭突的抬起和融合的關(guān)鍵時期，小鼠腭突組織廣泛表達(dá)TGF-α[15]。因此圍繞著TGF-α基因結(jié)構(gòu)、功能與非綜合征唇腭裂發(fā)生之間的關(guān)聯(lián)性的研究成為近些年來研究的熱點(diǎn)。TGF-α基因研究最多的是TaqI、RsaI、C3296T、Primer P、BamHI和PrimerK等位點(diǎn)[16]。本研究就rs3771494位點(diǎn)的多態(tài)性與中國東北人群非綜合征唇腭裂的關(guān)系進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)病例組基因型TC、CC及TC+CC的頻率均高于對照組，比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。說明在中國東北人群中TGF-α基因rs3771494位點(diǎn)基因型TC和CC與非綜合征唇腭裂的發(fā)病密切相關(guān)。有研究采用病例對照分析方法，只發(fā)現(xiàn)TGF-α基因rs3771494位點(diǎn)與中國部分地區(qū)人群非綜合征唇腭裂的發(fā)生有關(guān)。不同研究結(jié)果的差異可能與研究人群的種族及樣本量有關(guān)系。

環(huán)境因素在非綜合征唇腭裂的發(fā)病中也起著非常重要的作用[17]。Van Rooij等[18]證實(shí)母親為MTHFR 677TT基因型且孕期未服用葉酸或服用葉酸的劑量較低，其后代患唇腭裂的風(fēng)險較高；母親為MTHFR 1298CC且孕期未服用葉酸或服用葉酸的劑量較低，其后代患有唇腭裂的風(fēng)險較正常者高7倍。另外，國內(nèi)外大量學(xué)者做了大量的臨床和實(shí)驗(yàn)研究篩選了可能的易感性基因以及進(jìn)行基因定位，到目前為止大約有20多個候選基因被發(fā)現(xiàn)，主要集中在TGFA、TGFB3、FR-3、MTHFR、MSX-1、BCL-3、RARA、F13A、ARNT2、EPHX1等基因和基因位點(diǎn)上，但不同種族、不同地區(qū)甚至不同表型非綜合征唇腭裂的候選基因位點(diǎn)都有很大的差異性，多數(shù)結(jié)果重復(fù)性差，這些候選基因大部分仍有待于進(jìn)一步研究篩選。本研究中，證實(shí)TGF-α基因rs3771494位點(diǎn)與中國東北人群非綜合征唇腭裂的發(fā)病密切相關(guān)，將來，應(yīng)該進(jìn)一步同時結(jié)合多個基因和環(huán)境因素的相互作用對非綜合征唇腭裂的發(fā)病進(jìn)行更深入的分析，進(jìn)一步闡明唇腭裂的發(fā)病機(jī)制和因素，為預(yù)防唇腭裂的發(fā)生做準(zhǔn)備。

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