拐棗不同提取物的體外抗氧化作用

鄭朋朋，李 珊，楊正濤，戚麗蓉，敖新宇*

（西南林業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650224）

拐棗（Hovenia dulcis）屬鼠李科（Rhamnaceae）拐棗屬（Hovenia）植物，又名雞爪李、萬壽果、枳椇等，可食部分是果柄（花序軸）而非果實。我國食用藥用拐棗已有1 500多年，《本草綱目》中記述：枳木具性干、平、無毒。止渴除煩，去膈上熱，利大小便，功用同蜂蜜。拐棗果實含豐富的葡萄糖、蘋果酸鈣、蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)及黃酮類等活性物質(zhì)，具有一定的營養(yǎng)保健功能[1-3]。有報道稱拐棗能提高肝臟解毒酶活性，從而起到保護肝臟的功能；拐棗提取物對藍氏賈第鞭毛蟲起到抑制作用；以及拐棗多酚類物質(zhì)具有抗氧化性[4-7]。

測定提取物抗氧化性能力的方法很多，其中1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基和2,2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（2,2'-azinobis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid ammonium salt，ABTS）自由基清除試驗是應(yīng)用最廣泛，測定結(jié)果穩(wěn)定可靠，是國際承認的測定物質(zhì)抗氧化性的方法[8-10]。提取物抗氧化能力與多酚含量之間存在密切聯(lián)系，因此多酚含量也成為抗氧化能力的重要指標[11-13]。查閱相關(guān)文獻，國內(nèi)有關(guān)于拐棗提取物多酚含量與抗氧化性的研究極少，因此本研究對拐棗子、拐棗和拐棗枝乙醇浸提物抗氧化性進行比較，運用福林-酚法測定拐棗提取物浸膏不同極性提取物中多酚含量和清除DPPH、ABTS自由基法評價體外抗氧化性，確定抗氧化性最強的提取物，從而為拐棗資源的開發(fā)利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

拐棗子、拐棗、拐棗枝：產(chǎn)于云南省昆明市（經(jīng)過烘干、粉碎、過篩等預(yù)處理備用）。

茶多酚標準品（純度＞98%）：上海時代生物科技有限公司；福林-酚（Folin-Ciocalteu）、DPPH自由基、ABTS自由基：美國Sigma公司；過硫酸鉀、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、正丁醇、石油醚、碳酸鈉、維生素C均為分析純：國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DHG-9240A型電熱恒溫鼓風干燥箱、DZF-6030A型真空干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；BS224S電子天平：德國SARTORIUS公司；M20型粉碎機：德國KIKAWERKE公司；80目篩子：北京祥宇偉業(yè)儀器設(shè)備有限公司；B490真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：瑞士BUCHI公司；TU-1901型紫外分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司。

1.3 方法

1.3.1 拐棗不同部分乙醇浸提物的提取

分別稱取100 g拐棗子、拐棗和拐棗枝置于500 mL燒杯中，加入500 mL體積分數(shù)為80%的乙醇溶液，浸提1 d，抽濾，濾渣再用體積分數(shù)為80%乙醇溶液重復(fù)浸提2次，合并3次浸提液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮到一定體積，放入真空干燥箱中，45 ℃干燥1 d，得到拐棗子、拐棗和拐棗枝體積分數(shù)為80%的乙醇浸提物，各提取物用蒸餾水配制成所需質(zhì)量濃度的待測液進行抗氧性研究。

1.3.2 拐棗不同極性萃取物的萃取

稱取1 kg拐棗，用5 L 體積分數(shù)為80%的乙醇溶液浸泡48 h，分離出浸提液，重復(fù)浸提3～4次，合并提取液減壓濃縮得浸膏300 g。加入適量水混懸，依次用沸程60～90 ℃石油醚、乙酸乙酯、甲醇進行萃取，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮萃取溶液，再置于真空干燥箱進行干燥，得石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物、甲醇萃取物和萃取剩余物，各萃取物用相應(yīng)溶劑配制成所需質(zhì)量濃度的待測液，測定其多酚含量和抗氧活性。

1.3.3 拐棗不同極性部位多酚含量的測定

茶多酚標準曲線繪制：準確稱取茶多酚標準品40.0 mg，溶解后定容至100 mL，配制成400 μg/mL的茶多酚標準溶液；精確量取400 μg/mL的茶多酚標準溶液0、0.125 mL、0.250 mL、0.500 mL、0.750 mL、1.000 mL于25 mL容量瓶中，再分別加入1.0 mL 福林-酚試劑，搖勻后靜置5 min，再分別加入10%碳酸鈉2 mL，最后定容至刻度，搖勻，避光反應(yīng)1 h后，在波長760 nm下測定吸光度值。多酚含量的測定：取1.0 mL不同提取物所配制的待測液，加入1.0 mL福林-酚試劑，搖勻后靜置5 min，再加入10%碳酸鈉2 mL，定容至刻度，搖勻，避光反應(yīng)1 h后，在波長760 nm處測定吸光度值。以茶多酚標準曲線回歸方程計算樣品中多酚含量。

1.3.4 抗氧化性試驗[14-17]

DPPH自由基清除率的測定：取1.0 mL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液（陽性對照為不同質(zhì)量濃度的維生素C（vitamin C，VC）溶液）于試管中，分別加入2.0 mL用無水乙醇配制6×10-5mol/LDPPH溶液，振搖混勻后置于暗室中反應(yīng)30min，于波長518 nm處測定吸光度值，以1.0 mL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液與2.0 mL無水乙醇混合液為本底溶液測定樣品本底吸光度值，以2.0 mL DPPH溶液與1.0 mL無水乙醇混合液測定空白對照溶液吸光度值，DPPH自由基清除率的計算公式如下：

式中：Ax為不同樣品溶液+DPPH溶液的吸光度值；Ax0為樣品本底吸光度值；A0為空白對照溶液吸光度值。

ABTS自由基清除率的測定：用去離子水將ABTS溶解，配制ABTS濃度為7 mmol/L，加入過硫酸鉀使過硫酸鉀的濃度為2.45 mmol/L，然后將該溶液在室溫下避光反應(yīng)12～16 h。再將生成的ABTS+·溶液用pH 7.4磷酸緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）稀釋至適當濃度，使其在波長734 nm條件下的吸光度值為，得到ABTS自由基工作液。在試管中加入1.0 mL不同質(zhì)量濃度樣品溶液（以不同質(zhì)量濃度的VC溶液作為陽性對照），再加入2.0 mL的ABTS自由基工作液，混合、搖勻，在室溫下反應(yīng)6 min后，在波長734 nm條件下測定其吸光度值。用蒸餾水代替樣品溶液作為空白對照，ABTS自由基清除率的計算公式如下：

式中：Ax為不同樣品溶液吸光度值；Ax0為樣品本底吸光度值；A0為空白對照溶液吸光度值。

以DPPH和ABTS自由基清除率的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）來反映檢測物的抗氧化活性，即抗氧化性越強，該數(shù)值越低。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶多酚標準曲線的繪制

以茶多酚標準溶液質(zhì)量濃度（C）為橫坐標，吸光度值（A）為縱坐標，繪制標準曲線，結(jié)果見圖1。

圖1 茶多酚標準曲線Fig.1 Standard curve of tea polyphenols

由圖1可知，由Origin 8.0對實驗數(shù)據(jù)處理，得到標準曲線的線性回歸方程：A=8.358 95×10-4C+0.039 89，其中線性相關(guān)系數(shù)R2=0.998，表明茶多酚溶液的質(zhì)量濃度與吸光度值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.2 不同部分拐棗乙醇浸提物的抗氧化性

DPPH-乙醇溶液呈深紫色，抗氧化劑存在時與DPPH的孤對電子進行配對，溶液的紫色減弱，吸光度值減小，吸光度值減小的程度和抗氧化劑呈劑量關(guān)系，可借此來評價樣品的抗氧化性[17]。拐棗不同部分在體積分數(shù)80%的乙醇浸提物質(zhì)量濃度2 mg/mL時對DPPH和ABTS自由基清除率結(jié)果見表1。

表1 不同部分拐棗乙醇浸提物對DPPH和ABTS自由基的清除率Table 1 Scavenging effects of different parts of Hovenia dulcis on DPPH and ABTS radical

由表1可知，拐棗子、拐棗和拐棗枝在體積分數(shù)為80%的乙醇浸提物質(zhì)量濃度為2 mg/mL時均具有較強清除DPPH、ABTS自由基的能力。表1中標準偏差（standard deviation，SD）結(jié)果的說明試驗所測定的數(shù)據(jù)準確可靠。拐棗子、拐棗和拐棗枝對DPPH自由基清除效率分別為68.43%、87.07%和76.87%，對ABTS自由基的清除效率分別為82.03%、95.67%和89.57%。3個不同部位中，拐棗具有更強的抗氧化性，因此后續(xù)試驗選用拐棗進行不同極性浸提，和對不同極性浸提物的抗氧化性進行研究。

2.3 拐棗不同極性萃取物抗氧化性研究

2.3.1 拐棗不同極性萃取物對DPPH自由基清除作用

拐棗不同極性萃取物對DPPH自由基清除作用，結(jié)果見圖2。由圖2可知，各物質(zhì)對DPPH自由基清除率均隨著拐棗提取物質(zhì)量濃度的增加而增大，達到一定質(zhì)量濃度后，對DPPH自由基清除率維持在最高水平不再增大。甲醇萃取物和萃取剩余物的清除率要低于其他萃取物的清除率，這可能與其中的多酚含量低有關(guān)；正丁醇萃取物在樣品質(zhì)量濃度＜0.8 mg/mL的對DPPH自由基清除率要高于石油醚萃取物，但其最大清除率要略低于石油醚萃取物；乙酸乙酯萃取物在樣品質(zhì)量濃度＜1.4 mg/mL的對DPPH自由基的清除率大于其他4種物質(zhì)，＞1.4 mg/mL之后其清除率與石油醚萃取物清除效率相當，達到最高，為94.0%，VC在0.1mg/mL時就達到了最大水平，當樣品質(zhì)量濃度＞1.4mg/mL時，VC與乙酸乙酯、石油醚萃取物的DPPH自由基清除率沒有顯著性差異，從而說明，這兩個萃取物有很強的清除DPPH自由基的能力。清除DPPH自由基大小順序為石油醚萃取物＞乙酸乙酯萃取物＞VC＞正丁醇萃取物＞萃取剩余＞甲醇萃取物。因此，采用石油醚和乙酸乙酯進行萃取具有較強的清除DPPH自由基的能力。

圖2 拐棗不同極性萃取物對DPPH自由基的清除率Fig.2 Scavenging effects of Hovenia dulcis extract with different polarity on DPPH radical

2.3.2 拐棗不同極性萃取物對ABTS自由基清除作用

拐棗不同極性萃取物清除ABTS自由基試驗結(jié)果見圖3。由圖3可知，各物質(zhì)對ABTS自由基的清除效率差距較大，能清晰辨別各物質(zhì)清除率的大小，清除率的大小是乙酸乙酯萃取物＞正丁醇萃取物＞石油醚萃取物＞萃取剩余物＞甲醇萃取物，其中乙酸乙酯萃取物的最大清除率為98.57%，VC的最大清除率為99.80%，與VC相當，兩者沒有顯著差異。因此，采用乙酸乙酯進行萃取具有較強的清除ABTS自由基的能力。

圖3 拐棗不同極性萃取物對ABTS自由基的清除率Fig.3 Scavenging effects of Hovenia dulcis extract with different polarity on ABTS radical

2.4 不同極性萃取物多酚含量、IC50與最大清除率

拐棗不同極性萃取物多酚含量，以及清除自由基的IC50和最大清除率見表2。由表2可知，拐棗不同極性部位多酚含量大小為乙酸乙酯萃取物＞正丁醇萃取物＞萃取剩余物＞甲醇萃取物＞石油醚萃取物。對DPPH和ABTS自由基清除的IC50大小為VC＜乙酸乙酯萃取物＜正丁醇萃取物＜石油醚萃取物＜萃取剩余物＜甲醇萃取物。

對DPPH自由基的最大清除率大小為石油醚萃取物＞乙酸乙酯萃取物＞VC＞正丁醇萃取物＞萃取剩余＞甲醇萃取物，其中石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取物的DPPH自由基最大清除效率不存在明顯差異。對ABTS自由基的最大清除率大小為VC＞乙酸乙酯萃取物＞正丁醇萃取物＞石油醚萃取物＞萃取剩余＞甲醇萃取物，各物質(zhì)的ABTS自由基最大清除率差異顯著，此結(jié)果與對2種自由基清除IC50值大小結(jié)果相一致。綜合IC50和最大清除率可知，乙酸乙酯和正丁醇萃取物具有更穩(wěn)定的DPPH自由基及ABTS自由基清除率，說明拐棗不同極性萃取物中乙酸乙酯和正丁醇極性部位具有更強和更穩(wěn)定的抗氧化活性。

結(jié)合不同極性萃取物多酚含量可知，多酚含量與抗氧化性存在正相關(guān)性，乙酸乙酯萃取物的多酚含量最大，為202.8 mg/g，正丁醇萃取物的次之，多酚含量為173.7 mg/g，其中石油醚萃取物多酚含量僅為36.1 mg/g，但石油醚萃取物的抗氧化性要強于萃取剩余物和甲醇（對DPPH自由基清除作用最強），說明石油醚萃取物中除含有多酚類物質(zhì)，還存在其他具有抗氧化物質(zhì)。

表2 拐棗不同極性萃取物中多酚含量及對DPPH和ABTS自由基清除作用的IC50和最大清除率Table 2 Polyphenol content,IC50and maximum scavenging efficiency of different polarity of Hovenia dulcis on DPPH and ABTS radical

3 結(jié)論

通過對拐棗子、拐棗和拐棗枝體積分數(shù)為80%的乙醇溶液浸提物抗氧化性進行比較，得出拐棗體積分數(shù)為80%的乙醇溶液浸提物的抗氧化性最強；依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇萃取拐棗體積分數(shù)為80%的乙醇浸提浸膏分別得4個不同的極性萃取物，對不同極性萃取物進行體外抗氧化性試驗，拐棗不同極性萃取物中，乙酸乙酯萃取物的抗氧化能力最強，其多酚含量為202.8 mg/g，對DPPH和ABTS自由基清除作用的IC50分別為182 μg/mL和60 μg/mL，最大清除效率分別為94.0%和98.57%；與VC的抗氧化性無明顯差異。試驗表明，拐棗提取物有較好的抗氧化能力，其抗氧化活性除與多酚含量有關(guān)，還與其他物質(zhì)有關(guān)，具有開發(fā)利用的價值。

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