金欣口服液對RSV感染BALB/c小鼠RIG-I信號傳導通路的影響*

陳爭光，汪受傳，魏肖云，徐建亞

(南京中醫(yī)藥大學中醫(yī)兒科研究所，南京 210029)

金欣口服液對RSV感染BALB/c小鼠RIG-I信號傳導通路的影響*

陳爭光，汪受傳△，魏肖云，徐建亞

(南京中醫(yī)藥大學中醫(yī)兒科研究所，南京 210029)

目的:研究金欣口服液對呼吸道合胞病毒(RSV)感染的BALB/c小鼠肺組織中RIG-I信號傳導通路的影響，探討其可能的抗病毒機制。方法:RSV滴鼻感染BALB/c小鼠，不同劑量金欣口服液灌胃給藥進行干預，于首次滴鼻后24 h、72 h、144 h取各組小鼠肺組織，Real time RT-PCR分別檢測RSV-M、RIG-I、IPS-I和IFN-β在mRNA水平的表達情況，Western Blot檢測RIG-I和IPS-I在蛋白水平上的表達情況。結果:RSV感染24 h和72 h后，其肺組織中RIG-I、IPS-I和IFN-β的表達均較正常組顯著升高，金欣口服液不同劑量組RIG-I、IPS-I和IFN-β表達較RSV組明顯下調(diào);144 h后，RIG-I、IPS-I和IFN-β表達量顯著下調(diào)，金欣口服液不同劑量組能上調(diào)RIG-I、IPS-I和IFN-β的低表達。結論:RSV能誘導RIG-1信號傳導通路的激活從而促進IFN-β的表達，而金欣口服液能通過調(diào)控RIG-1信號通路從而調(diào)節(jié)IFN-β的表達。

金欣口服液;呼吸道合胞病毒;RIG-I;IFN-β

呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)屬于副黏液病毒科肺炎病毒屬，具有包膜非片段性的單股負鏈RNA病毒。RSV是引起嬰幼兒和老年人下呼吸道感染的主要病原，也是嬰幼兒住院的首要原因，臨床上主要表現(xiàn)為毛細支氣管炎和支氣管肺炎，并與哮喘密切相關［1-3］。

維甲酸誘導基因 I(Retinoic Acid-Inducible Gene I，RIG-I)是目前可以識別細胞質(zhì)內(nèi)病毒雙鏈RNA的模式識別受體之一［4］，是機體識別病毒抗原產(chǎn)生抗病毒反應的第一道防線，在抗病毒感染中發(fā)揮了重要的作用［5］。目前研究發(fā)現(xiàn)，RIG-I信號通路與RSV感染關系極為密切［6-7］。

金欣口服液是南京中醫(yī)藥大學汪受傳教授根據(jù)《傷寒論》“麻杏石甘湯”加減而成，通過長期臨床研究證實，該方治療RSV肺炎具有顯著療效［8］。本課題組前期實驗研究也表明，該方能多途徑發(fā)揮抗病毒作用［9-12］。

本實驗從金欣口服液對RIG-I信號通路相關接頭蛋白調(diào)控入手，進一步闡釋金欣口服液的抗病毒機制。

1 材料與方法

1.1 動物與病毒

BALB/c小鼠(雌性，6～8周齡，體質(zhì)量18～22 g，SPF級)75只，揚州醫(yī)學院比較實驗研究中心提供(許可證號SCXK(蘇)2012-0004)，RSV A型Long株由武漢大學國家典型培養(yǎng)物保藏中心提供。

1.2 藥物與試劑

利巴韋林顆粒50 mg/包，四川百利藥業(yè)有限責任公司(批號080335)。金欣口服液由炙麻黃、虎杖、苦杏仁、桑白皮、生石膏、前胡、黃芩、葶藶子組成，經(jīng)江蘇省植物藥深加工工程中心制備和質(zhì)控，含生藥1.351 g/ml。RNA iso plus試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒:TAKARA大連寶生物公司;兔抗RIG-1多克隆抗體、兔抗IPS-1多克隆抗體:美國CST公司;抗β-actin抗體、羊抗兔熒光二抗:美國Abcam公司;引物由上海生工生物技術有限公司合成。

1.3 儀器

實時熒光定量PCR儀，ABI7500熒光定量PCR儀:美國AB公司;蛋白核酸分析儀:BioPhotometer，德國Eppendorf公司;imageQuant LAS4000 mini超靈敏化學發(fā)光成像儀:美國GE公司。

1.4 實驗分組及干預方法

1.4.1 模型制備和分組 根據(jù)文獻報道［13］制作RSV肺炎的動物模型:取乙醚10 ml倒入墊有脫脂棉的廣口瓶中，將小鼠放入廣口瓶30～60 s，觀察小鼠無明顯活動時將其快速取出，吸取100TCID50的RSV懸液鼻腔滴注，每側(cè)鼻腔25 μL，每日1次;正常組采用同種方法給予等量的DMEM培養(yǎng)基。每日給予小鼠稱重、測體溫，觀察小鼠進食、活動和精神狀況。造模成功標志為RSV滴鼻后24 h即出現(xiàn)體溫增高、進食減少、活動減少、精神萎靡等。

實驗分為A組(24 h)、B組(72 h)和C組(144 h)各25只。A組、B組和C組分別在RSV首次滴鼻后24 h、72 h、144 h處死取肺組織。每大組分為5小組，每小組5只，包括正常組、模型組、利巴韋林組、金欣高劑量組和金欣等效劑量組。實驗檢測時每小組隨機選取3個樣本用來檢測。

1.4.2 干預方法 A組:提前給藥2 d，末次給藥2 h后RSV滴鼻;B組:RSV滴鼻2 d，每次滴鼻后2 h給予相應藥物，共給藥3d;C組:RSV滴鼻2 d，每次滴鼻后2 h給予相應藥物，共給藥5 d。

據(jù)參照文獻報道［14］換算小鼠給藥劑量，金欣等效劑量組為27.6 g/(kg·d)(相當于2歲兒童臨床等效劑量);金欣高劑量組為138 g/kg·d(相當于2歲兒童臨床等效劑量5倍);利巴韋林組為27.6 mg/kg·d(相當于2歲兒童臨床等效劑量)，每只小鼠每天灌胃給藥2次，每次0.2 mL/10 g，根據(jù)給藥量制備相應濃度的藥物，正常組和模型組給予同體積的生理鹽水。

1.5 Real-time RT-PCR法

將肺組織放入液氮預冷的研缽內(nèi)研末，按照肺組織100 mg加入RNA iso plus lmL，并按照試劑盒說明書提取總RNA，蛋白核酸分析儀對RNA進行質(zhì)量分析，按照RT-PCR試劑盒說明書將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，SYBR GreenⅡ?qū)崟r熒光定量PCR法檢測肺組織中RSV-M、RIG-I、IPS-I和IFN-β mRNA的轉(zhuǎn)錄水平。表1顯示，實時熒光定量PCR反應條件(采用兩步法):95℃預變性15 s，95℃變性5 s，60℃退火34 s，設置40個循環(huán)，同時做熔解曲線。以上實驗獨立重復3次。

表1 RSV病毒M基因和小鼠RIG-I、IPS-I、IFN-β、GAPDH基因引物

1.6 Western-blot法

將肺組織放入液氮預冷的研缽內(nèi)研末，按肺組織每100 mg加入500 μL RIPA+5 μL PMSF，冰浴中超聲勻漿至澄清，4℃15000 rpm離心30 min，取上清即為總蛋白，使用BCA法蛋白定量試劑盒測定總蛋白濃度。根據(jù)總蛋白濃度，加入相應體積的上樣緩沖液，97℃變性5 min。SDS-PAGE凝膠電泳(80 V30 min，100 V 1 h);半干轉(zhuǎn)膜(25 V 30 min);洗膜，5%脫脂奶粉封閉2 h;洗膜，1∶1000一抗孵育，4℃過夜;洗膜，1∶5000二抗孵育，室溫，2 h;洗膜，ECL Western Blotting Substrate顯色;imageQuant LAS4000 mini超靈敏化學發(fā)光成像儀成像。

1.7 統(tǒng)計學方法

Real timeRT-PCR實驗數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt方法［15］進行計算，ΔΔCt=(Ct樣本-Ct內(nèi)參)實驗組-(Ct樣本-Ct內(nèi)參)對照組。Western blot實驗結果采用Image-Pro Plus軟件進行光密度計算。采用 SPSS 17.0統(tǒng)計軟件統(tǒng)計分析，結果以均數(shù)±標準差(珋x± s)表示，2組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 金欣口服液對RSV感染BALB/c小鼠肺組織內(nèi)RSV-M mRNA的影響

表2顯示，RSV感染后24 h，利巴韋林和不同劑量金欣口服液均能抑制RSV-M mRNA的表達(P＜0.01);金欣口服液高劑量對RSV-M mRNA表達抑制作用低于利巴韋林組(P＜0.01);金欣口服液等效劑量組與利巴韋林組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

72 h和144 h后，利巴韋林和不同劑量金欣口服液均可顯著抑制 RSV-M mRNA的表達(P＜0.01)，但利巴韋林組的抑制作用顯著高于金欣口服液不同劑量組(P＜0.01)。

表2 金欣口服液對RSV感染BALB/c小鼠肺組織內(nèi)RSV-M mRNA的影響(±s)

表2 金欣口服液對RSV感染BALB/c小鼠肺組織內(nèi)RSV-M mRNA的影響(±s)

注:與模型組比較:△△P＜0.01;與利巴韋林組比較:▲▲P＜0.01

組)別RSV-M mRNA相對表達量(2-ΔΔCt24 h 72 h 144 h正 常 組 — — —模 型 組 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00利 巴 韋 林 組 0.72±0.03△△ 0.16±0.01△△ 0.83±0.04△△金欣高劑量組 0.89±0.04△△▲▲0.45±0.01△△▲▲ 0.48±0.05△△▲▲金欣等效劑量組 0.74±0.01△△ 0.26±0.01△△▲▲ 0.55±0.04△△▲▲

2.2 金欣口服液對RSV感染的BALB/c小鼠肺組織內(nèi)RIG-I mRNA和IPS-I mRNA表達的影響

表3顯示，RSV感染后24 h和72 h，RIG-I mRNA表達均升高(P＜0.01)。利巴韋林和不同劑量金欣口服液對RIG-I mRNA高表達均有明顯下調(diào)作用(P＜0.01，P＜0.05)，但金欣口服液高劑量組的下調(diào)作用均低于利巴韋林組(P＜0.01)。在感染后24 h，金欣口服液等效劑量組的下調(diào)作用高于利巴韋林組(P＜0.01)，但在感染后72 h，金欣口服液等效劑量組與利巴韋林組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

144 h后，RIG-I mRNA表達顯著降低(P＜0.01);利巴韋林能下調(diào)RIG-I mRNA的低表達(P＜0.05)，金欣口服液高劑量組與RSV組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，但金欣口服液等效劑量組能上調(diào)RIG-I mRNA的低表達(P＜0.01)。

表3 金欣口服液對RSV感染BALB/c小鼠肺組織內(nèi)RIG-I mRNA的影響(±s)

表3 金欣口服液對RSV感染BALB/c小鼠肺組織內(nèi)RIG-I mRNA的影響(±s)

注:與正常組比較:＊＊P＜0.01;與模型組比較:△P＜0.05，△△P＜0.01;與利巴韋林組比較:▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

組RIG-I mRNA相對表達量(2-ΔΔCt) 24 h 72 h 144 h正 常 組別1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00模 型 組 2.40±0.06＊＊ 7.39±0.38＊＊ 0.64±0.04＊＊利 巴 韋 林 組 1.79±0.06△△ 3.04±0.11△△ 0.57±0.04△金欣高劑量組 2.26±0.07△▲▲ 3.71±0.20△△▲ 0.69±0.03金欣等效劑量組 1.26±0.08△△▲▲ 3.40±0.20△△ 0.86±0.01△△

表4 金欣口服液對RSV感染BALB/c小鼠肺組織內(nèi)IPS-I mRNA的影響(±s)

表4 金欣口服液對RSV感染BALB/c小鼠肺組織內(nèi)IPS-I mRNA的影響(±s)

注:與正常組比較:＊＊P＜0.01;與模型組比較:△△P＜0.01

組IPS-I mRNA相對表達量(2-ΔΔCt) 24 h 72 h 144 h正 常 組別1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00模 型 組 2.25±0.17＊＊ 2.14±0.08＊＊ 0.68±0.05＊＊利 巴 韋 林 組 1.56±0.14△△ 1.06±0.05△△ 0.73±0.07金欣高劑量組 1.40±0.06△△ 1.10±0.06△△ 0.98±0.07△△金欣等效劑量組 1.53±0.06△△ 0.95±0.09△△ 1.18±0.02△△

表4顯示，RSV感染后 24 h和 72 h，IPS-I mRNA表達均升高(P＜0.01)。利巴韋林和不同劑量金欣口服液對IPS-I mRNA高表達均有明顯下調(diào)作用(P＜0.01)，但利巴韋林和不同劑量金欣口服液對IPS-1 mRNA的調(diào)控作用之間比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

144 h后，IPS-I mRNA表達顯著降低(P＜0.01);利巴韋林對IPS-I mRNA的低表達無明顯調(diào)控作用(P＞0.05)，但金欣口服液不同劑量組均能上調(diào)RIG-I mRNA的低表達(P＜0.01)。

2.3 金欣口服液對RSV感染的BALB/c小鼠肺組織內(nèi)RIG-I蛋白和IPS-I蛋白表達的影響

圖1表5顯示，RSV感染后24 h，RIG-I蛋白表達量上調(diào)(P＜0.01)。利巴韋林組對RIG-I蛋白高表達具有顯著上調(diào)作用(P＜0.01);金欣等效劑量組對其高表達有顯著下調(diào)作用(P＜0.01);但金欣口服液高劑量組與模型組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

圖1 金欣口服液對RSV感染BALB/c小鼠肺組織RIG-I和IPS-I蛋白表達影響的顯影圖

表5 金欣口服液對RSV感染BALB/c小鼠肺組織內(nèi)RIG-I蛋白表達的影響(±s)

表5 金欣口服液對RSV感染BALB/c小鼠肺組織內(nèi)RIG-I蛋白表達的影響(±s)

注:與正常組比較:＊＊P＜0.01;與模型組比較:△P＜0.05，△△P＜0.01;與利巴韋林組比較:▲▲P＜0.01

組RIG-I/β-actin 24 h 72 h 144 h正 常 組別1.61±0.01 2.64±0.02 2.52±0.02模 型 組 1.96±0.00＊＊ 4.12±0.10＊＊ 1.70±0.02＊＊利 巴 韋 林 組 2.39±0.00△△ 2.40±0.02△△ 1.59±0.01△金欣高劑量組 1.92±0.02 3.70±0.03△△▲▲ 2.59±0.01△△金欣等效劑量組 1.03±0.01△△ 4.03±0.03△▲▲ 2.02±0.02△△

72 h后，RIG-I蛋白表達量明顯上調(diào)(P＜0.01)。利巴韋林組(P＜0.01)、金欣口服液高劑量(P＜0.01)和等效劑量組(P＜0.05)對其高表達均有顯著下調(diào)作用。利巴韋林的下調(diào)作用高于金欣口服液不同劑量組(P＜0.01)。

144 h后，RIG-I蛋白表達量顯著下調(diào)(P＜0.01)。利巴韋林組對其低表達具有下調(diào)作用(P＜0.05)，但金欣口服液不同劑量組對其低表達具有上調(diào)作用(P ＜0.01)。

表6 金欣口服液對RSV感染BALB/c小鼠肺組織內(nèi)IPS-I蛋白表達的影響(±s)

表6 金欣口服液對RSV感染BALB/c小鼠肺組織內(nèi)IPS-I蛋白表達的影響(±s)

注:與正常組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與模型組比較:△P＜0.05，△△P＜0.01;與利巴韋林組比較:▲▲P＜0.01

組IPS-I/β-actin 24 h 72 h 144 h正 常 組別0.52±0.02 1.24±0.01 1.45±0.02模 型 組 1.06±0.01＊＊ 1.38±0.03* 0.54±0.01＊＊利 巴 韋 林 組 1.13±0.00△ 0.91±0.01△△ 0.28±0.00△△金欣高劑量組 0.68±0.00△△ 0.53±0.01△△▲▲ 0.68±0.00△△金欣等效劑量組 0.33±0.00△△ 0.68±0.01△△▲▲ 0.39±0.01△△

圖1表6顯示，RSV感染后24 h，IPS-I蛋白表達量上調(diào)(P＜0.01)。利巴韋林組對其高表達具有上調(diào)作用(P＜0.05);金欣口服液不同劑量組對其高表達均有顯著下調(diào)作用(P＜0.01)。

72 h后，IPS-I蛋白表達量上調(diào)(P＜0.05)。利巴韋林組和不同劑量金欣口服液對其高表達均有顯著下調(diào)作用(P＜0.01)，金欣口服液不同劑量組的下調(diào)作用均高于利巴韋林組(P＜0.01)。

144 h后，IPS-I蛋白表達量顯著下調(diào)(P＜0.01)。利巴韋林和金欣口服液等效劑量組對其低表達具有下調(diào)作用(P＜0.01)。金欣口服液高劑量組對其低表達具有顯著上調(diào)作用(P＜0.01)。

2.4 金欣口服液對RSV感染BALB/c小鼠肺組織內(nèi)IFN-βmRNA的影響

表7 金欣口服液對RSV感染BALB/c小鼠肺組織內(nèi)IFN-β m RNA的影響(±s)

表7 金欣口服液對RSV感染BALB/c小鼠肺組織內(nèi)IFN-β m RNA的影響(±s)

注:與正常組比較:＊＊P＜0.01;與模型組比較:△△P＜0.01;與利巴韋林組比較:▲▲P＜0.01

組IFN-β mRNA相對表達量(2-ΔΔCt) 24 h 72 h 144 h正 常 組別1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00模 型 組 84.81±0.92＊＊ 1.57±0.12＊＊ 0.17±0.01＊＊利 巴 韋 林 組 35.18±0.73△△ 0.26±0.02△△ 0.22±0.01金欣高劑量組 58.42±0.40△△▲▲ 1.01±0.10△△▲▲ 0.45±0.04△△金欣等效劑量組 24.93±0.67△△▲▲ 1.44±0.08 0.52±0.06△△

表7顯示，RSV感染后24 h，IFN-β mRNA表達顯著升高(P＜0.01)。利巴韋林和不同劑量金欣口服液對其高表達有明顯下調(diào)作用(P＜0.01);利巴韋林的下調(diào)作用高于金欣口服液高劑量(P＜0.01)，但低于等效劑量組(P＜0.01)。

72 h后，IFN-β mRNA表達顯著升高(P＜0.01)。利巴韋林和金欣口服液高劑量對其高表達有明顯下調(diào)作用(P＜0.01);利巴韋林的下調(diào)作用高于金欣口服液不同劑量組(P＜0.01);金欣口服液等效劑量對其高表達無明顯下調(diào)作用(P＞0.05)。

144 h后，IFN-β mRNA表達顯著降低(P＜0.01)。利巴韋林組與模型組之間比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);金欣口服液不同劑量對其低表達有明顯的上調(diào)作用(P＜0.01)。

3 討論

RIG-I是含DExD/H盒的RNA解旋酶家族的成員之一，能夠識別病毒RNA［16］。當病毒RNA入侵宿主細胞后，RIG-I與病毒結合后，其構象發(fā)生變化，RIG-I被激活;RIG-I通過與IPS-I的相互作用，IPS-I被激活［17-18］。激活的IPS-I通過復雜的信號傳導從而促使IRF-3、IRF-7磷酸化，啟動Ⅰ型干擾素的表達。RSV感染后，機體經(jīng)RIG-I介導引起免疫細胞表達的炎癥因子、細胞因子，從而發(fā)揮抗病毒作用［19］。

該研究表明，通過測定RSV-M mRNA的表達情況，證實RSV感染的小鼠模型造模成功，并測定不同時間點RSV-M mRNA表達情況，證實金欣口服液具有抗病毒作用。RSV感染BALB/c小鼠后，其肺組織中RIG-I和IPS-I的表達均顯著上調(diào)，但隨著時間推移，其表達水平逐漸下降，呈現(xiàn)出先增高后降低的表達趨勢。RSV感染BALB/c小鼠后，其肺組織中IFN-βmRNA的表達隨著時間推移呈先增高后降低的趨勢，144 h后下降至正常水平以下。通過以上研究表明，RSV感染初期，病毒激活RIG-I信號通路導致IFN-β的高表達，金欣口服液能抑制RIG-I通路的過度激活，防止因IFN-β等細胞因子引起的炎癥損傷。在RSV感染后期，RIG-I信號通路表達呈現(xiàn)下調(diào)的趨勢，但金欣口服液可以維持RIG-I信號通路的持續(xù)表達，從而使IFN-β的表達維持在一定范圍內(nèi)，既能發(fā)揮有效的抗病毒作用，又可以防止炎癥因子的過度表達引起的炎癥損傷。

綜上所述，RSV感染可以誘導小鼠RIG-I信號通路的激活，而金欣口服液對激活的RIG-I信號通路具有調(diào)控作用，從而調(diào)節(jié)干擾素表達以發(fā)揮抗病毒效應。

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Effect of Jinxin Oral Liquid on RIG-I Signal Transduction Pathway in BALB/c Mice Infected with RSV

CHEN Zheng-guang，WANG Shou-chuan△，WEI Xiao-yun，XU Jian-ya
(Pediatric Institution of Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210029，China)

Objective:To study the effect of Jinxin Oral Liquid(JOL)on Retinoic Acid-Inducible Gene I(RIG-I) signaling transduction pathway in BALB/c mice infected by respiratory syncytial virus(RSV)，and to explore its antiviral mechanism.Method:BALB/c Mice were infected with RSV，and were administered with the different dosage of JOL.After 24，72 and 144 hours of the first inoculated with RSV，the mice were killed and the lung tissue was collected to detect the mRNA level of RSV-M，RIG-I，IPS-I，and IFN-β with Real time RT-PCR and to measure the level of the protein of RIG-I and IPS-I by Western blot.Result:After 24 and 72 hours of RSV infection，the expression of RIG-I，IPS-I and IFN-β in the model group all increased significantly compared with the normal group，while the expression of RIG-I，IPS-I and IFN-β in JOL group all decreased compared with the model group.However，after 144 hours of RSV infection，the expression of RIG-I，IPS-I and IFN-βin the model group all decreased significantly compared with the normal group.The JOL group all up-regulated the expression of RIG-I，IPS-I and IFN-β compared with the model group.Conclusion:The activation of RIG-I signaling transduction pathway was induced by RSV to promote the expression of IFN-β.JOL can regulate the RIG-I signaling transduction pathway to control the proper expression of IFN-β.

Jinxin Oral Liquid;Respiratory syncytial virus(RSV);Retinoic Acid-Inducible Gene I(RIG-I); Interferon-beta(IFN-β)

R285.5

:B

:1006-3250(2015)07-0819-05

2015-03-24

國家自然科學基金資助項目(81072840)-金欣口服液對RSV活化誘導的TLRs信號傳導通路作用機制研究

陳爭光(1985-)，男，河南澠池人，醫(yī)學博士，從事小兒肺系疾病的臨床與研究。

△通訊作者:汪受傳(1946-)，男，江蘇鹽城人，主任醫(yī)師，醫(yī)學碩士，教授，博士研究生導師，從事小兒肺系疾病研究。