激光針灸對(duì)2型膠原蛋白誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(CIA)模型大鼠滑膜組織病理改變的影響機(jī)制

周 瑩，畢 群，劉 偉

(萊蕪市人民醫(yī)院，山東萊蕪 271199)

激光針灸對(duì)2型膠原蛋白誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(CIA)模型大鼠滑膜組織病理改變的影響機(jī)制

周 瑩，畢 群，劉 偉

(萊蕪市人民醫(yī)院，山東萊蕪 271199)

目的:探討激光針灸對(duì)2型膠原蛋白誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(CIA)模型大鼠滑膜組織病理改變的作用機(jī)制。方法:將40只大鼠進(jìn)行編號(hào)分為空白對(duì)照組、模型組、藥物治療組和激光針灸治療組。激光治療組采用足三里和腎俞穴位進(jìn)行針灸15次，觀察各組大鼠足腫脹程度并對(duì)各組大鼠的關(guān)節(jié)進(jìn)行評(píng)分。提取大鼠的踝關(guān)節(jié)滑膜組織行HE染色，光鏡下觀察滑膜組織增生、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、巨噬細(xì)胞增生及纖維組織增生的情況。結(jié)果:模型組的4種病理學(xué)組織評(píng)分和總評(píng)分均高于空白對(duì)照組和藥物、激光針灸治療組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;模型組足腫脹程度及關(guān)節(jié)評(píng)分高于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。藥物治療組和激光治療組各指標(biāo)之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論:激光針灸治療CIA大鼠能有效地抑制CIA大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織的增生，其療效與藥物治療相當(dāng)。

2型膠原蛋白誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎;激光針灸;滑膜組織

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種系統(tǒng)性自身免疫性疾病，其特點(diǎn)是在多個(gè)關(guān)節(jié)滑膜出現(xiàn)慢性炎癥、軟骨破壞、骨侵蝕，出現(xiàn)關(guān)節(jié)腫脹、僵硬、畸形并伴有嚴(yán)重疼痛［1］。不受控制的RA可引起肺癌和心血管系統(tǒng)等多種組織的全身炎癥，導(dǎo)致并發(fā)癥和死亡率增加［2］。雖然RA的病因和發(fā)病機(jī)制還未完全理解，但促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β水平升高與疾病的進(jìn)展和嚴(yán)重程度緊密聯(lián)系［3-4］。多項(xiàng)研究［5］顯示，激光針灸對(duì)RA的治療具有療效好、不良反應(yīng)少等優(yōu)點(diǎn)，但對(duì)其治療機(jī)制的研究仍然不甚明確。本研究報(bào)道了通過(guò)II型膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis，CIA)大鼠模型，探討激光針灸對(duì)其保護(hù)作用，為臨床治療提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 4周齡健康SD雄性大鼠40只，清潔級(jí)，體質(zhì)量(125±20)g，由安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.1.2 試劑與器材 連續(xù)半導(dǎo)體激光器(波長(zhǎng)635 nm)由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所激光醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室研制。Ⅱ型膠原蛋白購(gòu)自Chondrex公司，弗氏完全佐劑購(gòu)自Sigma公司，扶他林購(gòu)自北京諾華制藥有限公司，酶標(biāo)儀購(gòu)自MR公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 造模與分組 將所有動(dòng)物稱重后隨機(jī)編號(hào)為1-40號(hào)，1-10號(hào)為正常對(duì)照組，不做任何處理;將其余的90只大鼠采用II型膠原蛋白進(jìn)行CIA造模。首先將用0.1M的冰醋酸溶解至濃度為2 g/L的溶液，于4℃過(guò)夜，加入等體積的弗氏完全佐劑，將兩者在冰浴中混勻乳化制成乳劑，且終濃度為1g/L。每只大鼠注射1ml該溶液，在背部皮下、尾根部和右后足跖部多點(diǎn)注射，1周后再次注射0.5ml加強(qiáng)免疫1次，建造II型膠原蛋白誘導(dǎo)的大鼠實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎(CIA)模型［6］。模型建造后2周，將造模成功的大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為為模型組(CIA模型組)、藥物治療對(duì)照組(即大鼠每天用0.8 mg/100 g劑量的扶他林乳液灌胃)、激光針灸治療組(即每只大鼠每天采用激光照射針灸治療)3組。模型組、正常對(duì)照組和針灸治療組每天注射生理鹽水。

1.2.2 取穴和針灸方法 ①取穴:參照“十一五”國(guó)家級(jí)規(guī)劃教材《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》的定位方法，取大鼠的足三里穴、腎俞穴［7］，腎俞穴在第2腰椎下兩旁、左右各1穴，足三里在膝關(guān)節(jié)后外側(cè)、腓骨小頭下0.5 cm處。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，采用交替治療單側(cè)穴位、左右交叉選取，即在第1天選擇治療左側(cè)足三里穴和腎俞穴，第2天則用右側(cè)足三里穴和腎俞穴，第3天再用左側(cè)進(jìn)行交替治療。各組在激光針灸治療前對(duì)穴位區(qū)局部皮膚均進(jìn)行剃毛、清潔處理。②激光針灸:在建造CIA模型致炎后第3周，將針灸治療組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以同樣固定架固定，對(duì)足三里穴、腎俞穴進(jìn)行激光照射。激光輸出功率100 mW，功率密度1.42 W/cm2，光斑直徑均為0.3 cm，照射時(shí)間10 min，每日1次，共治療15次。

1.2.3 采集標(biāo)本和指標(biāo)檢測(cè) 1)大鼠關(guān)節(jié)評(píng)分和足腫脹觀察:在造模及藥物或針灸治療前后仔細(xì)觀察大鼠神志活動(dòng)及體毛色澤的改變，在給藥或激光針灸前1 d，給藥后或激光針灸后的7 d、14 d，用足趾容積測(cè)量?jī)x測(cè)量足趾的體積，測(cè)量3次取平均值，根據(jù)四肢的病變程度進(jìn)行累計(jì)積分。2)采用關(guān)節(jié)炎指數(shù)(Arthritis Index，AI)對(duì)關(guān)節(jié)紅腫程度進(jìn)行評(píng)定:關(guān)節(jié)無(wú)紅腫的為0分;個(gè)別足趾紅腫發(fā)脹為1分;大部分足趾及足底紅腫發(fā)脹為2分;踝關(guān)節(jié)以下全部腫脹為3分;累計(jì)踝關(guān)節(jié)以上腫脹及不能負(fù)重為4分。AI為四肢關(guān)節(jié)評(píng)分之和。3)提取滑膜組織與評(píng)分:實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，將大鼠浸泡在100 g/L的強(qiáng)力消毒水中泡10 min，在超凈工作臺(tái)上固定后剪取左踝關(guān)節(jié)，切開(kāi)皮膚后剝離滑膜組織，并用刀片完整切下。用甲醛溶液固定后石蠟包埋、切片，用蘇木精-伊紅染色液(HE)染色后在顯微鏡下觀察滑膜組織的病理學(xué)改變。參照文獻(xiàn)，根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)對(duì)滑膜組織病理變化進(jìn)行評(píng)分。①滑膜細(xì)胞增生:無(wú)明顯(0)為0分;單層密集、腫脹(+)為1分;增生成2層(++)為2分;增生成3層及以上(+++)為3分;②炎性細(xì)胞浸潤(rùn):未見(jiàn)或偶見(jiàn)(0)為0分;稀疏散在少量(+)為1分，較密集中等量(++)為2分，密集大量(+++)為3分;③纖維組織增生:無(wú)增生(0)為0分，少量增生(+)為1分，中等量增生(++)為2分，大量增生(+++)為3分;④巨噬細(xì)胞增生:未見(jiàn)(0)為0分，稀疏散在少量(+)為1分，中等量(++)為2分，大量(+++)為3分。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，2組樣本間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組樣本間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 激光針灸對(duì)大鼠身體及關(guān)節(jié)腫脹的作用

模型組與空白對(duì)照組比較，大鼠的活動(dòng)有所減少，精神狀況萎靡，后肢關(guān)節(jié)部位在造模后第8天時(shí)出現(xiàn)紅腫且日益加重。采用藥物治療和針灸治療后，大鼠后肢的腫脹程度減輕，精神狀態(tài)良好，飲食正常。表1顯示，與模型組比較，給藥或激光針灸后14 d，左后肢的足容積明顯減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但均大于空白對(duì)照組和給藥前的足容積。表2顯示，經(jīng)過(guò)藥物和激光針灸后，與模型組比較，關(guān)節(jié)炎指數(shù)AI明顯降低，且隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng)，腫脹程度逐漸減輕。

表1 激光針灸對(duì)CIA大鼠左后肢足容積的影響(±s，mL)

表1 激光針灸對(duì)CIA大鼠左后肢足容積的影響(±s，mL)

與空白對(duì)照組比較:##P＜0.01;與模型組比較:＊＊P＜0.01;與給藥前比較:△P＜0.05

組給藥后7 d 14 d空白對(duì)照組別例數(shù) 給藥前1 d 10 0.511±0.189 0.532±0.078 0.575±0.113模 型 組 10 0.732±0.218## 0.913±0.218## 1.123±0.345##藥 物 治 療 組 10 0.744±0.111## 0.879±0.098##△ 0.846±0.077##＊＊△激光針灸治療組 10 0.779±0.056## 0.887±0.075##△ 0.814±0.145##＊＊△

表2 激光針灸對(duì)CIA大鼠四肢AI比較(±s，分)

表2 激光針灸對(duì)CIA大鼠四肢AI比較(±s，分)

注:與空白對(duì)照組比較:##P＜0.01;與模型組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與給藥前比較:△P＜0.05

組別鼠數(shù) 給藥前1 d 給藥后7 d 14 d空 白 對(duì) 照 組10 0 0 0模 型 組 10 6.9±5.2## 11.7±2.7## 14.3±4.2##藥 物 治 療 組 10 7.1±4.9## 9.2±3.1##＊△ 10.1±3.8##＊＊△激光針灸治療組 10 7.5±5.8## 8.9±5.3##＊△ 11.3±6.1##＊＊△

2.2 激光針灸對(duì)滑膜組織的影響

組織學(xué)檢查結(jié)果顯示，與正常組大鼠比較，CIA大鼠的滑膜關(guān)節(jié)中出現(xiàn)大量細(xì)胞浸潤(rùn)、滑膜增生、關(guān)節(jié)狹窄(圖1B)，形成嚴(yán)重的血管。但在藥物治療組和激光針灸組，這些病理變化明顯減少(圖1C和1D)。表3顯示，與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠的滑膜增生、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、巨噬細(xì)胞增生及纖維組織增生評(píng)分和總評(píng)分均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，顯示造模成功，模型組大鼠的踝關(guān)節(jié)滑膜組織的病理學(xué)改變明顯。藥物治療和激光針灸組與模型組比較，滑膜增生、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、巨噬細(xì)胞增生及纖維組織增生評(píng)分與總評(píng)分出現(xiàn)不同程度的下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3 激光針灸對(duì)CIA大鼠關(guān)節(jié)組織病理學(xué)評(píng)分影響(±s，分)

表3 激光針灸對(duì)CIA大鼠關(guān)節(jié)組織病理學(xué)評(píng)分影響(±s，分)

注:與空白對(duì)照組比較:##P＜0.01;與模型組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別 鼠數(shù) 滑膜細(xì)胞增生 炎性細(xì)胞浸潤(rùn) 巨噬細(xì)胞增生 纖維組織增生 總積分空 白 對(duì) 照 組10 0.22±0.13 0 0 0 0.22±0.13模 型 組 10 1.99±0.52## 1.97±0.28## 1.43±0.42## 2.61±0.43## 8.00±1.65##藥 物 治 療 組 10 1.67±0.49##* 1.29±0.31##＊＊ 1.01±0.38##＊＊ 1.45±0.22＊＊ 5.42±1.40＊＊激 光 針 灸 治 療 組 10 1.45±0.85##＊＊ 1.09±0.53##＊＊ 0.98±0.31##＊＊ 1.15±0.34＊＊ 4.68±2.03＊＊

圖1 激光針灸對(duì)CIA大鼠關(guān)節(jié)組織病理學(xué)影響空白對(duì)照組;B.模型組;C.藥物治療組;D.激光針灸治療組

3 討論

風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是一種復(fù)雜的難治性自身免疫性疾病，特點(diǎn)是關(guān)節(jié)疼痛、多發(fā)性關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)破壞，它是由不同致病因素造成的，包括全身和局部炎癥、細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)、廣泛的血管生成、基質(zhì)金屬蛋白酶和破骨細(xì)胞破壞骨骼和軟骨［8-10］，但其具體的發(fā)病機(jī)制尚不明確。表4顯示，激光針灸可以抑制滑膜細(xì)胞和纖維組織增生，減少炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，與對(duì)照藥物扶他林比較，療效相當(dāng)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。且激光治療可以緩解足腫脹，降低大鼠四肢的AI值，但激光針灸治療的作用機(jī)制尚待進(jìn)一步研究，可能是與加快血液循環(huán)有關(guān)。

對(duì)該病機(jī)制的研究，模型的選擇是至關(guān)重要的。與經(jīng)典的佐劑誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎 (agjuvant-induced arthritis，AIA)比較，CIA模型的臨床表現(xiàn)、發(fā)病機(jī)制和病例特點(diǎn)以及免疫學(xué)指標(biāo)與人的RA比較，具有更多的相似性和可比性，是目前國(guó)內(nèi)比較認(rèn)可的用于研究RA的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停?1-12］。在本研究中，采用CIA造模2周后，大鼠的踝關(guān)節(jié)出現(xiàn)滑膜增生、纖維組織和巨噬細(xì)胞增生、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，與正常組大鼠比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這些病理學(xué)表現(xiàn)表明，模型組的病理學(xué)改變與人的RA接近，說(shuō)明該模型對(duì)于后續(xù)的激光針灸治療結(jié)果具有更好的可靠性。

在該病的發(fā)病過(guò)程中，4種病理學(xué)改變反映了RA的發(fā)病程度，滑膜細(xì)胞增生是RA發(fā)病的早期反應(yīng)，隨著病程的延長(zhǎng)，會(huì)出現(xiàn)滑膜組織增厚、關(guān)節(jié)黏連等病理學(xué)改變，該反應(yīng)是該病發(fā)病過(guò)程中的最直接反應(yīng)［13-14］。炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)反映了免疫反應(yīng)的激烈程度。該研究結(jié)果顯示，藥物組和激光針灸組均有一定程度的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，但與模型組比較有所下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明藥物或者激光治療具有一定程度減輕炎性反應(yīng)的作用。巨噬細(xì)胞分為A型和B型，是滑膜襯里層的2種主要細(xì)胞，主要來(lái)源于血液中單核細(xì)胞的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移［10］。纖維組織增生則反映了炎癥破壞后纖維組織轉(zhuǎn)移后的修復(fù)情況，纖維組織增生越嚴(yán)重，說(shuō)明關(guān)節(jié)的軟骨破壞越大［15］。我們的研究結(jié)果顯示，藥物治療和激光治療均有一定程度抑制纖維組織增生的作用，且隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng)效果更明顯。

總之，激光針灸治療CIA大鼠，對(duì)大鼠踝關(guān)節(jié)的滑膜組織增生和纖維組織增生具有一定的抑制作用，其作用效果和藥物治療效果相當(dāng)，但其治療作用機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。該治療手段也許可以作為不愿服藥或者藥物治療效果差患者的主要或輔助治療手段。

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The Effects and Mechanisms of Laser Acupuncture and Moxibustion Treatment to in Synovial Tissue Pathological Changes Type II Collagen Induced Arthritis Model Rats

ZHOU Ying，BI Qun，LIU Wei
(Laiwu City People's Hospital，Shandong Laiwu 271199，China)

Objective To investigate the effects and the mechanism of laser acupuncture and moxibustion treatment to the in the type II collagen induced arthritis(CIA)model rats of synovial tissue pathological changes.Methods:40 rats were divided into control group，model group，treatment group and laser acupuncture and moxibustion treatment group.Laser treatment group with Zu Sanli and Sheshu point acupuncture for 15 times，observed each group rats foot swelling degree and rate of each group rats joints.Extracted rats joints and HE staining，ankle synovial tissue in rat were observed under light synovial tissue，inflammatory cell infiltration，macrophage proliferation and fibrous tissue hyperplasia.Results: Pathological tissues in the model group of 4 score and total score were higher than control group and laser acupuncture and moxibustion treatment group，the difference was statistically significant.In the Model group，the foot swelling degree and the joints of score higher than the blank control group，and the difference was statistically significant.Drug treatment group and laser therapy group have no statistical significance difference.Conclusion:Laser acupuncture and moxibustion treatment of CIA rats，can effectively inhibit the CIA rats ankle synovial tissue hyperplasia.

CIA;laser acupuncture and moxibustion;synovial tissue

R245.9+7

B

1006-3250(2015)06-0725-03

2015-04-17

周 瑩(1971-)，女，主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)本科，從事中醫(yī)針灸的臨床與研究。