補(bǔ)腎、健脾、活血方法對(duì)骨質(zhì)疏松癥小鼠骨及骨骼肌中Ca2+-Mg2+-ATP酶含量影響*

孫 鑫，楊 芳，鄧洋洋，鄭洪新△，王擁軍

(1．遼寧中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，沈陽 110847; 2．上海中醫(yī)藥大學(xué)脊柱病研究所、上海中醫(yī)藥大學(xué)龍華醫(yī)院，上海 200032)

補(bǔ)腎、健脾、活血方法對(duì)骨質(zhì)疏松癥小鼠骨及骨骼肌中Ca2+-Mg2+-ATP酶含量影響*

孫 鑫1，楊 芳1，鄧洋洋1，鄭洪新1△，王擁軍2

(1．遼寧中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，沈陽 110847; 2．上海中醫(yī)藥大學(xué)脊柱病研究所、上海中醫(yī)藥大學(xué)龍華醫(yī)院，上海 200032)

目的:觀察補(bǔ)腎、健脾、活血方法對(duì)骨質(zhì)疏松癥小鼠骨骼及骨骼肌中Ca2+-Mg2+-ATP酶含量的影響，探討中醫(yī)藥防治骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)制。方法:實(shí)驗(yàn)藥物灌胃8周后，ELISA法測(cè)定股骨及骨骼肌中Ca2+-Mg2+-ATP酶的含量。結(jié)果:補(bǔ)腎組、福善美組小鼠骨骼及骨骼肌的Ca2+-Mg2+-ATP酶較模型組明顯升高。結(jié)論:骨質(zhì)疏松癥的形成可能與骨及骨骼肌Ca2+-Mg2+-ATP酶含量異常有關(guān);補(bǔ)腎、健脾方法通過調(diào)控骨質(zhì)疏松癥小鼠的骨及骨骼肌Ca2+-Mg2+-ATP酶含量，起到防治骨質(zhì)疏松癥的作用。

骨質(zhì)疏松癥;骨骼肌;Ca2+-Mg2+-ATP酶

骨質(zhì)疏松癥(Osteoporosis OP)是以骨量減少、骨組織微細(xì)結(jié)構(gòu)破壞為特征，繼而導(dǎo)致骨脆性增加和骨折危險(xiǎn)性增高的一種全身性骨骼疾病［1］。本實(shí)驗(yàn)通過觀察其骨骼及骨骼肌中Ca2+-Mg2+-ATP酶的含量，探討骨質(zhì)疏松癥“骨肉不相親”的病理機(jī)制，即骨骼肌收縮與骨骼協(xié)調(diào)性對(duì)骨質(zhì)疏松癥形成的影響，并觀察補(bǔ)腎方法、健脾方法、活血化瘀方法對(duì)骨質(zhì)疏松癥的防治效果和作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物

骨保護(hù)素(Osteoprotegerin，OPG)基因敲除純合子小鼠36只，8周齡，品系C57BL/6J，來源于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院脊柱病研究所。野生型小鼠8只，品系C57BL/6J，來源于中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 藥物

補(bǔ)腎中藥由鹿茸凍干粉與淫羊藿提取物微粉及牡蠣納米鈣微?；旌霞吹?健脾中藥為補(bǔ)中益氣顆粒(北京漢典制藥有限公司，批號(hào)090101)，活血中藥為身痛逐瘀湯(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬一院)，陽性對(duì)照藥為福善美(杭州默沙東制藥有限公司，批號(hào)J20080073)，ELISA相關(guān)試劑(Ca2+-Mg2+-ATP酶試劑盒，美國ADL公司)。

2 方法

2.1 分組

野生型小鼠8只為正常組，OPG基因敲除小鼠36只按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組8只，補(bǔ)腎組、健脾組、活血組、福善美組各7只。

2.2 給藥

正常組及模型組小鼠正常飲食并給予純凈水灌胃，其他各組正常飲食并給予相應(yīng)藥物灌胃，每日1次共8周。藥物劑量:小鼠等效劑量按成人(60 kg體質(zhì)量)每日用藥量的9倍計(jì)算［2］，容積為1ml/100 g體質(zhì)量，補(bǔ)腎組給藥量為鹿茸的0.320 g·kg－1· d－1，牡蠣0.256 g·kg－1·d－1，淫羊藿0.126 g·kg－1· d－1;健脾組給藥量0.901 g·kg－1·d－1，活血組給藥量9.010 ml·kg－1·d－1，福善美給藥量1.5016 mg· kg－1·d－1。實(shí)驗(yàn)期間各組小鼠每周稱重1次，并根據(jù)體質(zhì)量變化調(diào)整給藥劑量。

2.3 取材

實(shí)驗(yàn)小鼠在最后1次灌胃后，禁食24 h后取材。本實(shí)驗(yàn)保留標(biāo)本包括右后肢腓腸肌的白肌部分和左后肢的全股骨(置塑料保鮮袋內(nèi)－70℃凍存)。

2.4 ELISA法檢測(cè)

將骨、骨骼肌分別放入約5倍于組織體積量的MSH緩沖液中清洗，擦干稱重后，用剪刀剪碎置入勻漿瓶中，以500 rpm勻漿充分;將勻漿后的組織放入離心管中離心，2000 g×10 min;提取上清液放入1 mlEP管中，按試劑盒說明書步驟進(jìn)行檢測(cè)。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。

3 結(jié)果

3.1 模型評(píng)價(jià)

表1顯示，運(yùn)用雙能X線吸收法對(duì)小鼠離體股骨上1/3進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組小鼠離體股骨上1/3骨密度極顯著降低(P＜0.01);與模型組比較，各治療組大鼠股骨上1/3骨密度均有不同程度升高，其中以補(bǔ)腎中藥組升高最為顯著(P＜0.01)，其次為健脾組(P＜0.01)，說明OPG基因敲除小鼠出現(xiàn)骨質(zhì)疏松，故模型成功。

3.2 骨保護(hù)素基因敲除小鼠骨骼、骨骼肌Ca2+-Mg2+-ATP酶檢測(cè)結(jié)果

表2顯示，與正常組比較模型組、健脾組和活血組小鼠骨骼的 Ca2+-Mg2+-ATP酶顯著降低(P＜0.01);與模型組比較，補(bǔ)腎組、福善美組小鼠骨骼Ca2+-Mg2+-ATP酶明顯升高(P＜0.01)，健脾組和活血組亦升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 各組小鼠股骨上1/3骨密度比較

表2顯示，與正常組比較，模型組、健脾組和活血組小鼠骨骼肌的Ca2+-Mg2+-ATP酶顯著降低(P＜0.01)，補(bǔ)腎組和福善美組小鼠骨骼肌的Ca2+-Mg2+-ATP酶顯著升高(P＜0.01);與模型組比較，補(bǔ)腎組、福善美組小鼠骨骼肌的Ca2+-Mg2+-ATP酶明顯升高(P＜0.01)，健脾組和活血組亦升高但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 各組小鼠骨骼及骨骼肌中Ca2+-Mg2+-ATP酶(mg/L)比較(±s)

表2 各組小鼠骨骼及骨骼肌中Ca2+-Mg2+-ATP酶(mg/L)比較(±s)

注:同表1

組 別 小鼠數(shù) 骨骼 骨骼肌正 常 組8 11.071±1.03 4.512±0.38模 型 組 8 2.121±0.14* 1.851±0.11*補(bǔ) 腎 組 7 9.003±1.31＊▲ 5.871±0.48＊▲健 脾 組 7 2.436±0.22*# 2.053±0.04*#活 血 組 7 2.401±0.09*# 2.001±0.18*#福 善 美 組 7 9.076±0.69＊▲ 7.413±0.64＊▲

4 討論

骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，肌肉無力，骨骼與肌肉運(yùn)動(dòng)不相協(xié)調(diào)，可能是其發(fā)病機(jī)制之一，因此本實(shí)驗(yàn)以此為切入點(diǎn)進(jìn)行研究。Ca2+-Mg2+-ATP酶與肌肉收縮及能量代謝有著密切聯(lián)系。該酶活性下降導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣超載激惹出現(xiàn)一系列代謝紊亂，可致結(jié)構(gòu)退變甚至喪失生命力，出現(xiàn)整個(gè)肌細(xì)胞的損傷，最終導(dǎo)致骨骼肌損傷［3］，而骨的負(fù)荷主要來源于肌肉的主動(dòng)收縮。因此，增加肌肉的力量、彈性及身體的協(xié)調(diào)性和平衡性，可以加強(qiáng)骨形成和肌肉對(duì)骨骼的支持力量，進(jìn)而減少骨質(zhì)疏松癥患者骨折的發(fā)生，提高患者的生活質(zhì)量。楊芳等研究顯示，不同中醫(yī)治法對(duì)糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松癥大鼠的骨及骨骼肌中Ca2+-Mg2+-ATP酶存在相應(yīng)的影響［4］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，骨質(zhì)疏松癥小鼠骨及骨骼肌中Ca2+-Mg2+-ATP酶顯著降低，可能是骨質(zhì)疏松癥發(fā)生的機(jī)制之一，運(yùn)用不同的中藥進(jìn)行干預(yù)后，Ca2+-Mg2+-ATP酶有不同程度的升高，其中補(bǔ)腎中藥效果最好，其次為健脾中藥。先天生后天，后天養(yǎng)先天，腎藏精主骨生髓，脾主運(yùn)化主肌肉。若脾氣健運(yùn)則精微充足，肌肉得養(yǎng)，腎精亦能得到充養(yǎng)，先天充盛，精充髓足則骨骼強(qiáng)勁;反之，脾胃虛損則四肢百骸失養(yǎng)，肌肉無力，可發(fā)為骨痿。因此，通過補(bǔ)腎、健脾法改善骨及骨骼肌中Ca2+-Mg2+-ATP酶的含量，可能是補(bǔ)腎、健脾中藥防治骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)制之一。

［1］劉忠厚．骨質(zhì)疏松學(xué)［M］．北京:科學(xué)出版社，1998:142．

［2］施新猷．醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)［M］．陜西:科學(xué)技術(shù)出版社，1989．

［3］徐雷，楊磊，杜柳濤，等．靜態(tài)負(fù)荷對(duì)大鼠離體骨骼肌能量代謝的影響［J］．中國工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志，2005，18(1):14-15．

［4］楊芳，鄭洪新，王劍，等．中醫(yī)不同治法對(duì)骨質(zhì)疏松癥大鼠骨密度及骨骼肌Ca2+-Mg2+-ATP酶影響的比較研究［J］．中國骨質(zhì)疏松雜志，2011，17(1):56-59．

Effect of Bushen Jianpi Huoxue Method to the Ca2+-Mg2+-ATP，enzyme content of bone and skeletal muscle in osteoporosis mice

SUN Xin1，YANG Fang1，DENG Yang-yang1，ZHENG Hong-xin1△，WANG Yong-jun2

(1．Basic Medical College，Liaoning University of TCM，Shenyang 110847，China; 2．Longhua Hospital of Shanghai University of TCM，Shanghai 200032，China)

Objective:To observe the effects of tonifying kidney，tonifying spleen，promoting blood flow therapies on Ca2+-Mg2+-ATP enzyme content of bone and skeletal muscle in osteoporosis mice，so as to investigate the mechanism of traditional Chinese medicine in prevention and treatment of osteoporosis．Methods:Intragastric administration was the way of medication for 8 weeks，and then the bone and skeletal muscle were taken to detemermine the content of Ca2+-Mg2+-ATP enzyme by ELISA method．Results:the bone and the skeletal muscle Ca2+-Mg2+-ATP enzyme content increased significantly in the tonifying kidney medicine group and the Fosamax group．Conclusion:The formation of osteoporosis may be related to abnormal content of bone and skeletal muscle Ca2+-Mg2+-ATP enzyme．The tonifying kidney method，tonifying spleen method are of a preventive effect on osteoporosis through the regulation of content of osteoporosis mice bone and skeletal muscle Ca2+-Mg2+-ATP enzyme．

Osteoporosis;Skeletal muscle;Ca2+-Mg2+-ATP enzyme

R285．5

B

1006-3250(2015)04-0416-02

2015-01-11

國家自然科學(xué)基金青年基金(81001485);國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)(2010CB530401);遼寧省教育廳高校杰出青年學(xué)者成長(zhǎng)計(jì)劃(LJQ2012084)

孫 鑫(1981-)，女，遼寧鐵嶺人，講師，醫(yī)學(xué)碩士，從事中醫(yī)病因病機(jī)理論研究。

△通訊作者:鄭洪新，Tel:024-31207101，E-mail:zhenghx2002 @126．com。