滑膜炎顆粒對Ⅱ型膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型改善作用的機制研究

孫麗華，李志剛，周艷華，崔海峰，朱宏偉，于友華，張志偉，王正品，孫明杰△

(1．北京市中醫(yī)藥防治重大疾病基礎(chǔ)研究重點實驗室，中國中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗中心，北京 100700;2．中藥注射劑新藥開發(fā)技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室，河北三河 065201; 3．神威藥業(yè)集團有限公司，石家莊 051430;4．中國中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院，北京 100102; 5．河北省中藥注射液工程技術(shù)研究中心，河北三河 065201)

滑膜炎顆粒對Ⅱ型膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型改善作用的機制研究

孫麗華1，李志剛2，3，周艷華1，崔海峰1，朱宏偉4，于友華1，張志偉2，3，王正品3，5，孫明杰1△

(1．北京市中醫(yī)藥防治重大疾病基礎(chǔ)研究重點實驗室，中國中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗中心，北京 100700;2．中藥注射劑新藥開發(fā)技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室，河北三河 065201; 3．神威藥業(yè)集團有限公司，石家莊 051430;4．中國中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院，北京 100102; 5．河北省中藥注射液工程技術(shù)研究中心，河北三河 065201)

目的:探討滑膜炎顆粒對Ⅱ型膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(CIA)模型改善作用機制。方法:牛Ⅱ型膠原乳劑大鼠尾根部皮下注射制備CIA模型，造模成功后按隨機數(shù)字表法分為對照組(Ⅰ)、模型組(Ⅱ)、不完全弗氏佐劑組(Ⅲ)、雷公藤多苷片組(Ⅳ)、醋酸潑尼松龍組(Ⅴ)、滑膜炎顆粒大劑量組(Ⅵ)、中劑量組(Ⅶ)、小劑量組(Ⅷ)，每組各10～11只大鼠。免疫組化方法觀察大鼠左膝關(guān)節(jié)滑膜組織IL-1、TNF-α、Erk、Jnk、Ras、Raf的表達，圖像分析軟件計算陽性面積比。結(jié)果:各造模組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織IL-1、Erk、Jnk、Ras、Raf表達量均較對照組增高;各給藥組Erk表達量均較模型組降低，其中Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ組Erk表達量與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論:IL-1、Erk、Jnk、Ras表達升高，參與CIA模型大鼠滑膜組織病理損傷過程;滑膜炎顆粒改善關(guān)節(jié)損傷癥狀可能與降低Erk的表達相關(guān)，而與IL-1、TNF、Jnk、Ras、Raf不相關(guān)。

滑膜炎顆粒;膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎模型;細胞因子;細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶

滑膜炎顆粒由夏枯草、女貞子、功勞葉、黃芪、防己、薏苡仁、土茯苓、絲瓜絡(luò)、澤蘭、丹參、當歸、川牛膝、豨薟草組成，具有清熱利濕、活血通絡(luò)作用，臨床用于急、慢性滑膜炎及膝關(guān)節(jié)術(shù)后的治療。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，滑膜炎顆粒對Ⅱ型膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(CIA)模型具有較好的改善作用，對關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分和足腫脹度均有不同程度的抑制作用，對CIA模型滑膜、軟骨、纖維組織及小血管增生和炎性細胞浸潤等病理損傷也有不同程度的改善作用。然而，滑膜炎顆粒對CIA模型改善作用的相關(guān)機制研究報道較少。有研究表明，活化的滑膜細胞產(chǎn)生的細胞因子(如IL-1、TNF-α)參與軟骨破壞的病理過程，其中IL-1是導(dǎo)致軟骨損傷的重要因素之一［1］;滑膜細胞MAPKs信號傳導(dǎo)通路異常也是骨關(guān)節(jié)損傷的重要發(fā)病機制之一。因此，本文應(yīng)用免疫組化方法對CIA模型滑膜組織IL-1、TNF-α及MAPKs信號通路中關(guān)鍵酶(Erk、Ras、Jnk等)進行觀察，以期闡明滑膜炎顆粒對CIA模型改善作用的相關(guān)機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級雄性SD大鼠，體質(zhì)量(160±10)g，購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心(合格證號SCXK-(軍)2007-004)。實驗在中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所實驗動物屏障環(huán)境中進行(許可證號 SYXK(京)2010-0032)，并按實驗動物使用的3R原則給予人道關(guān)懷。

1.1.2 藥品與試劑 滑膜炎顆粒，由神威藥業(yè)(張家口)有限公司提供;雷公藤多苷片(TGT)，黃石飛云制藥有限公司生產(chǎn)(批號20111201);醋酸潑尼松龍片，上海信誼藥廠有限公司生產(chǎn)(批號120402);牛Ⅱ型膠原(批號120287)、不完全弗氏佐劑(批號120326)，購自美國Chondrex公司。免疫組化抗體(IL-1、Erk、Jnk、TNF-α、Raf、Ras)均購自美國Abcam公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組 動物購進后適應(yīng)性喂養(yǎng)2 d，制備CIA模型，模型制備成功后按隨機數(shù)字表法分為8組，每組10～11只大鼠，分別為對照組(Ⅰ)、不完全弗氏佐劑組(Ⅱ)、模型組(Ⅲ)、雷公藤多苷組(Ⅳ)、醋酸潑尼松龍組(Ⅴ)、滑膜炎顆粒大劑量組(Ⅵ)、中劑量組(Ⅶ)、小劑量組(Ⅷ)。

1.2.2 CIA模型的制備 參照文獻［2］取Ⅱ型膠原乳劑注射于大鼠尾根部皮下0.2 mL/只，7 d后加強免疫1次，0.2 mL/只注射于大鼠尾根部皮下;對照組注射生理鹽水，佐劑組注射不完全弗氏佐劑。造模成功后，按足趾腫脹度調(diào)整各造模組動物，剔除未成模大鼠。

1.2.3 給藥方法 加強免疫6 d后開始給藥，對照組、不完全弗氏佐劑組及模型組給予等體積純水。雷公藤多苷片9.45 mg/kg，醋酸潑尼松龍2.70 mg/kg，滑膜炎顆粒分為大、中、小3個給藥劑量，分別為9.68 g生藥/kg、4.84 g生藥/kg，2.42 g生藥/ kg。給藥體積2 mL/100 g，每天1次，連續(xù)灌胃給藥36 d。

1.2.4 滑膜組織免疫組化方法 末次給藥后24 h，20%烏拉坦麻醉大鼠，取大鼠左膝關(guān)節(jié)固定于10%中性福爾馬林溶液中，常規(guī)酒精脫水，二甲苯處理，石蠟包埋，2 μm連續(xù)切片烤干備用。按照免疫組化標準操作流程操作。圖像分析采用病理組織實時攝像顯微鏡系統(tǒng)攝像，胞漿內(nèi)棕色顆粒為陽性標記，圖像分析軟件(MIAS)計算陽性面積比(陽性染色面積/斑塊總面積)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 滑膜炎顆粒對CIA大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織IL-1表達的影響

圖1表1顯示，對照組滑膜組織結(jié)構(gòu)大致正常;模型組滑膜組織上皮1～2層，滑膜下小血管明顯增生，可見血管翳形成，并見少許炎細胞浸潤;不完全佐劑組滑膜組織及軟骨組織、結(jié)構(gòu)大致正常;雷公藤組滑膜組織上皮1～2層，偶見3層，有少許小血管增生，滑膜下未見明確炎細胞浸潤;醋酸潑尼松龍組可見滑膜組織及少許軟骨組織，滑膜上皮1～2層，滑膜下未見小血管增生及明確炎細胞浸潤;滑膜炎顆粒大劑量組滑膜組織上皮2層，輕度增生，顆粒層輕度增生肥厚，滑膜下見少許小血管增生及少許慢性炎細胞浸潤;滑膜炎顆粒中劑量組滑膜組織上皮2層，顆粒層輕度增生肥厚，滑膜下見小血管中度增生及少許慢性炎細胞浸潤;滑膜炎顆粒小劑量組滑膜組織上皮1`2層，顆粒層輕度增生肥厚，滑膜下見少許小血管增生及少許慢性炎細胞浸潤。軟件分析圖片結(jié)果顯示，各組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織IL-1表達量均較對照組增高，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。中劑量組IL-1表達增高顯著，與模型組及不完全佐劑組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 滑膜炎顆粒對CIA大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織IL-1表達的影響(±s)

表1 滑膜炎顆粒對CIA大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織IL-1表達的影響(±s)

注:與對照組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與模型組比較:▼P ＜0.05，▼▼P＜0.01;與不完全佐劑組比較:△P＜0.05，△△P＜0.01

組別 劑量g/kg 平均灰度對 照 組 —107.77±16.87 模 型 組 — 130.25±18.32＊＊不完全佐劑組 — 129.93±14.10＊＊雷 公 藤 組 0.0095 136.38±9.62＊＊醋酸潑尼松龍組 0.0027 125.50±14.20＊＊大 劑 量 組 9.6800 134.40±9.57＊＊中 劑 量 組 4.8400 146.71±12.53＊＊▼△△小 劑 量 組 2.4200 132.78±16.76＊＊

圖1 滑膜炎顆粒對大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織IL-1表達的影響(×400)

2.2 滑膜炎顆粒對CIA大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織TNF-α表達的影響

表2顯示，滑膜炎顆粒大劑量、小劑量組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織TNF-α表達量較對照組增高，其余各組TNF-α表達量較對照組降低，其中不完全佐劑組、醋酸潑尼松龍組與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);不完全佐劑組、醋酸潑尼松龍組與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);雷公藤組、滑膜炎顆粒各劑量組與不完全佐劑組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表2 滑膜炎顆粒對CIA大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織TNF-α表達的影響(±s)

表2 滑膜炎顆粒對CIA大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織TNF-α表達的影響(±s)

注:與對照組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與模型組比較:▼P＜0.05，▼▼P＜0.01;與不完全佐劑組比較:△P＜0.05，△△P＜0.01

組別 劑量g/kg 平均灰度對 照 組 —87.56±20.73 模 型 組 — 85.90±12.45不完全佐劑組 — 64.42±13.28＊＊▼▼雷 公 藤 組 0.0095 83.55±13.38△△醋酸潑尼松龍組 0.0027 68.04±12.54＊＊▼▼大 劑 量 組 9.6800 92.62±12.67△△中 劑 量 組 4.8400 86.30±11.99△△小 劑 量 組 2.4200 97.28±12.43△△

2.3 滑膜炎顆粒對CIA大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織Erk表達的影響

表3顯示，各組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織Erk表達量均較對照組增高，除不完全佐劑組，其余各組與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05或 P＜0.01)。各給藥組Erk表達量均較模型組降低，其中不完全佐劑組、雷公藤組、醋酸潑尼松龍組、大劑量組Erk表達量與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05或P＜0.01)。各給藥組Erk表達量較不完全佐劑組增高，與不完全佐劑組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表3 滑膜炎顆粒對CIA大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織Erk表達的影響(±s)

表3 滑膜炎顆粒對CIA大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織Erk表達的影響(±s)

注:與對照組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與模型組比較:▼P＜0.05，▼▼P＜0.01;與不完全佐劑組比較:△P＜0.05，△△P＜0.01

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2.4 滑膜炎顆粒對CIA大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織Jnk表達的影響

表4顯示，各組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織Jnk表達量均較對照組增高，其中模型組、中劑量組、小劑量組與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，中劑量、小劑量組與不完全佐劑組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表4 滑膜炎顆粒對CIA大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織Jnk表達的影響(±s)

表4 滑膜炎顆粒對CIA大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織Jnk表達的影響(±s)

注:與對照組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與不完全佐劑組比較:△P＜0.05，△△P＜0.01

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2.5 滑膜炎顆粒對CIA大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織Ras表達的影響

表5顯示，各組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織Ras表達量均較對照組增高，除不完全佐劑組，其余各組與對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)。

表5 滑膜炎顆粒對CIA大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織Ras表達的影響(±s)

表5 滑膜炎顆粒對CIA大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織Ras表達的影響(±s)

注:與對照組比較:*P＜0.05;與對照組比較:＊＊P＜0.01

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2.6 滑膜炎顆粒對CIA大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織Raf表達的影響

表6顯示，各組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織Raf表達量均較對照組增高，其中醋酸潑尼松龍組、滑膜炎顆粒各劑量組與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)。

表6 滑膜炎顆粒對CIA大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織Raf表達的影響(±s)

表6 滑膜炎顆粒對CIA大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織Raf表達的影響(±s)

注:與對照組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別 劑量g/kg 平均灰度對 照 組 —95.07±6.88 模 型 組 — 112.16±16.58不完全佐劑組 — 98.88±11.99 雷 公 藤 組 0.0095 102.40±12.44醋酸潑尼松龍組 0.0027 112.65±7.66＊＊大 劑 量 組 9.6800 111.32±9.74＊＊中 劑 量 組 4.8400 115.44±13.46＊＊小 劑 量 組 2.4200 112.16±11.93*

3 討論

我們前期實驗以CIA模型探討滑膜炎顆粒對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)改善作用，發(fā)現(xiàn)CIA模型大鼠滑膜增生、炎細胞浸潤、軟骨破壞與RA臨床特征相一致，滑膜炎顆粒各劑量組能夠改善足趾腫脹程度和關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分［3］。RA病理改變可能是多種因素共同作用的結(jié)果，其中炎性細胞因子在損傷病理過程中發(fā)揮著重要作用［4］。在炎性因子中，IL-1和TNF-α對軟骨破壞起著關(guān)鍵作用，它們能夠刺激軟骨細胞和滑膜細胞自分泌，并能誘導(dǎo)其產(chǎn)生其他細胞因子［5-6］。此外，IL-1能夠誘導(dǎo)成纖維細胞的增生，并可增加成纖維細胞產(chǎn)生膠原酶。本研究顯示，各組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織IL-1的表達量均較對照組升高，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。滑膜炎顆粒中劑量組IL-1的表達量較模型組增加，與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。雷公藤組IL-1、TNF-α表達情況與滑膜炎顆粒各劑量組變化趨勢相同。醋酸潑尼松組能夠降低滑膜組織TNF-α的表達，而滑膜炎顆粒各劑量組與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明滑膜炎顆粒、雷公藤對關(guān)節(jié)的改善作用可能與IL-1、TNF不相關(guān)。醋酸潑尼松改善模型大鼠病理損傷作用與降低滑膜組織TNF-α的表達相關(guān)。

滑膜細胞信號傳導(dǎo)異常是骨關(guān)節(jié)損傷的重要發(fā)病機制之一。在異常的信號傳導(dǎo)中，免疫細胞相互作用引起細胞活化、增殖、遷移能力和細胞存活的改變，最終引發(fā)炎癥［7］。MAPKs級聯(lián)信號通路異常參與滑膜炎癥和組織破壞的過程，表現(xiàn)為Erk高度活化，Jun氨基末端激酶(Jnk)異常表達［8］。本實驗顯示，除不完全佐劑組外，各組大鼠Erk表達均較對照組增強，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。各給藥組Erk表達量均較模型組降低，雷公藤組、醋酸潑尼松龍組、滑膜炎顆粒大劑量組與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。Jnk的表達，各組與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示Erk可能是滑膜炎顆粒改善關(guān)節(jié)癥狀的重要信號分子。

細胞外信號相關(guān)激酶(ERK)是一個廣泛表達在細胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)路徑，在ERKs的傳遞途徑中，Ras作為上游激活蛋白是單聚體GTP結(jié)合蛋白，它可通過Raf/MEK/ERK激酶級聯(lián)把絲裂原信號從細胞漿膜傳遞到細胞核。Raf作為MAPKKK，是一個絲氨酸-蘇氨酸激酶，它可磷酸化活化 MEK1/2，MEK1/2依次磷酸化ERK1/2，該路徑通過一系列磷酸化作用控制細胞的增殖、分化和凋亡等功能［9］。本研究顯示，各造模組Ras、Raf表達量較對照組增高，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義;滑膜炎顆粒各劑量組與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。提示CIA大鼠造模成功，Ras-Raf-ERK信號通路參與模型的病理損傷，滑膜炎顆粒改善模型大鼠關(guān)節(jié)損傷癥狀與Ras、Raf表達不相關(guān)。

綜上我們研究發(fā)現(xiàn)，CIA模型大鼠IL-1、Erk、Jnk、Ras表達升高，參與滑膜組織病理損傷過程;滑膜炎顆粒改善關(guān)節(jié)損傷癥狀與降低Erk的表達相關(guān)，而與IL-1、TNF、Jnk、Ras、Raf不相關(guān)。RA的病理過程復(fù)雜，滑膜炎顆粒對其改善作用機制仍需進一步深入探討。

［1］ 張志奇，廖威明，傅明．骨關(guān)節(jié)炎分子機制及作用靶點研究進展［J］．中國骨與關(guān)節(jié)外科，2008，1(1):61-66．

［2］ 趙宏艷，王燕，肖誠，等．不同品系、不同性別對大鼠CIA發(fā)病情況的比較研究［J］．中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2010，16(9): 761-764．

［3］ 孫麗華，張志偉，張華健，等．滑膜炎顆粒對Ⅱ型膠原關(guān)節(jié)炎模型的治療作用研究［J］．中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2014，20 (6):740-745．

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［6］ Brennan FM，Maini RN，F(xiàn)eldmann M．Role of pro-inflammatory cytokines in rheumatoid arthritis［J］． Springer Semin Immunopathol，1998，20(1-2):133-147．

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Study on the Mechanism of the Effects of Huamoyan Granule on the Arthritis Model Induced by to Type II Collagen

SUN Li-hua1，LI Zhi-gang2，3，ZHOU Yan-hua1，CUI Hai-feng1，ZHU Hong-wei4，YU You-hua1，ZHANG Zhi-wei2，3，WANG Zheng-pin3，5，SUN Ming-jie1△
(1．Beijing Key Laboratory of TCM Basic Research on Prevention and Treatment of Major Disease，Experimental Research Center，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China;2．State and Local Area Jointed Laboratory of Engineering for New Drug Development Technology of TCM Injection，Sanhe 065201，China;3．Shineway Pharmaceutical Group，Shijiazhuang 051430，China;4．Wangjing Hospital，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100102，China;5．Hebei Engineering Technology Research Center of TCM Injection，Sanhe 065201，China)

Objective:To investigate the potential mechanism of the ameliorated effect of Huamoyan Granule on the collagenⅡinduced arthritis(CIA)model．Methods:CIA models were established by the subcutaneous injection of type Ⅱbovine collagen on the extremital tail of the rats．Successful models of rats were randomly divided into 8 groups(10 to 11 rats each)，the normal group(I)，model group(Ⅱ)，incomplete Freund’s adjuvant group(Ⅲ)，tripterygium glycosides tablet group(Ⅳ)，prednisolone acetate group(Ⅴ)，Huamoyan Granule high dose group(Ⅵ)，Huamoyan Granule middle dose group(Ⅶ)，Huamoyan Granule low dose group(Ⅷ)．The expression of IL-1，TNF-α，Erk，Jnk，Ras，Raf were observed by immunohistochemisty methods．The rate of positive expression area was measured by image software(MIAS)．Results:Compared with control group，the expression of IL-1，Erk，Jnk，Ras，Raf in the synovial tissue of rats’left knee joint were increased in all model groups．Compared with model group，the expression of Erk in groupⅢ，Ⅳ，Ⅴ，Ⅵwere decreased，and there were statistical significance．Conclusion:The high expressions of IL-1，Erk，Jnk，Ras，Raf might contribute to the pathologic events of CIA model．The decreased expression of Erk might be the potential mechanism of therapeutic effect on the synovial injury of Huamoyan Granule．The expressions of IL-1，TNF，Jnk，Ras，Raf might not relate with the ameliorated effect of Huamoyan Granule．

Humoyan Granule;CIA model;Cytokines;Erk

R285．5

B

1006-3250(2015)10-1241-04

2015-03-23

孫麗華(1978-)，女，吉林撫松人，副研究員，醫(yī)學(xué)博士，從事中藥藥理的臨床與研究。

孫明杰(1962-)，研究員，從事中醫(yī)基礎(chǔ)理論與中藥藥理研究，Tel:010-64089512，E-mail:sunmj62@tom．com。