雙補(bǔ)湯對(duì)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)弱精子癥小鼠精子運(yùn)動(dòng)障礙的影響及作用機(jī)制研究*

武宜婷，姜 淼，孫 潔，楊 進(jìn)

(南京中醫(yī)藥大學(xué)，南京 210029)

雙補(bǔ)湯對(duì)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)弱精子癥小鼠精子運(yùn)動(dòng)障礙的影響及作用機(jī)制研究*

武宜婷，姜 淼，孫 潔，楊 進(jìn)△

(南京中醫(yī)藥大學(xué)，南京 210029)

目的:研究雙補(bǔ)湯對(duì)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)弱精子癥小鼠精子運(yùn)動(dòng)障礙的改善作用并初步探討其作用機(jī)制。方法:將50只雄性昆明小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、模型組、氯米酚組、低劑量組及高劑量組。采用環(huán)磷酰胺腹腔注射制備弱精子癥小鼠模型，以計(jì)算機(jī)輔助精液分析儀進(jìn)行常規(guī)分析，分別以Western blot及Real time-PCR檢測(cè)精子中SEPT4的蛋白及mRNA表達(dá)。結(jié)果:環(huán)磷酰胺明顯下調(diào)小鼠精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)，而2種劑量均可提高運(yùn)動(dòng)參數(shù)，但高劑量組優(yōu)于低劑量組;另外環(huán)磷酰胺下調(diào)小鼠精子SEPT4蛋白及mRNA表達(dá)，而高劑量及低劑量組顯著升高，此外氯米酚組與高劑量組較低劑量組明顯上升。結(jié)論:雙補(bǔ)湯明顯改善環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)弱精子癥小鼠精子運(yùn)動(dòng)障礙，其作用可能與上調(diào)SEPT4有關(guān)。

雙補(bǔ)湯;環(huán)磷酰胺;SEPT4蛋白;弱精子癥

近年來(lái)不孕不育的發(fā)病率顯著上升，調(diào)查顯示約15%夫妻受到不孕不育的困擾，而男性因素已占50%以上［1］。隨著研究的深入，在造成男性不育的病因中，弱精子癥逐漸受到重視，且其病因病機(jī)尚未完全闡明，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)也缺乏可靠的治療手段，而臨床中以雙補(bǔ)湯為代表的中醫(yī)藥在治療該病中顯現(xiàn)出獨(dú)特的療效。本實(shí)驗(yàn)以小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺制備弱精子癥模型，研究雙補(bǔ)湯對(duì)弱精子癥的改善作用，并進(jìn)一步探討其可能機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物與分組

清潔級(jí)雄性昆明小鼠50只(南京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)，體質(zhì)量18 g～22 g，按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、模型組、氯米酚(陽(yáng)性藥物)組、雙補(bǔ)湯低劑量組及高劑量組5組各10只。

1.2 藥物與主要試劑

按顆粒劑與生藥等效劑量換算，雙補(bǔ)湯顆粒劑量:五味子0.83 g，山藥0.75 g，蓮子、覆盆子、茯苓及補(bǔ)骨脂各1 g，肉蓯蓉、巴戟天及黨參各3 g，山茱萸2.5 g，菟絲子及芡實(shí)各0.5 g(購(gòu)自江蘇省中醫(yī)院)，實(shí)驗(yàn)前配成水溶液。環(huán)磷酰胺(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)H32020856)，氯米酚(塞浦路斯高特制藥有限公司，批號(hào)Batch:E0105)，Bww高蛋白獲能液(南京醫(yī)科大學(xué)生殖中心提供)，Trizol reagent(美國(guó) Invitrogen公司)，PrimeScript RT reagent kit(大連Takara公司)，兔抗小鼠SEPT-4抗體及兔抗小鼠GAPDH抗體(美國(guó)Santa cruz公司)，HRP羊抗兔二抗(丹麥Dako公司)，1×PBS液、細(xì)胞裂解液及苯甲基磺酰氟(PMSF)購(gòu)自南京生興生物技術(shù)公司。

1.3 主要儀器

恒溫水浴箱(美國(guó)PolyScience公司)，Sorvall低溫離心機(jī)(美國(guó) Biofuge stratos公司)，Multiskan Spectrum Microplate酶標(biāo)儀(德國(guó)Thermo公司)，計(jì)算機(jī)輔助精液分析系統(tǒng) CASA(美國(guó) Hamilton Thorne Bioscience公司)，PCR儀(美國(guó)BIO-RAD公司)，Dolphin-Doc凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó) Wealtec公司)，ZF型紫外透射反射分析儀(上海嘉鵬有限公司)，電泳儀(美國(guó)BIO-RAD公司)。

2 方法

2.1 動(dòng)物模型制備

實(shí)驗(yàn)小鼠適應(yīng)性馴養(yǎng)5 d后，對(duì)照組按(0.06 g ·kg－1)腹腔注射生理鹽水，模型組、氯米酚組、低劑量組及高劑量組按0.06 g·kg－1腹腔注射環(huán)磷酰胺，每天1次，連續(xù)5 d，第6天起按體質(zhì)量給低劑量組及高劑量組灌服雙補(bǔ)湯，劑量分別為人常規(guī)用量的1倍和5倍，即2.35 g·kg－1及11.75 g·kg－1，氯米酚組小鼠按0.0065 g·kg－1灌服氯米酚溶液，模型組小鼠給予等體積雙蒸水灌胃，每天1次，連續(xù)灌服34 d，對(duì)照組常規(guī)飼養(yǎng)［2］。灌胃期間，每周小鼠稱重1次，灌胃第34天將實(shí)驗(yàn)小鼠脫頸處死。

2.2 小鼠精子的采集

小鼠斷頸處死后迅速剝離附睪、輸精管，去除周圍的脂肪、筋膜等組織，置于裝有500 μL Bww獲能液的離心管中，并用眼科剪剪碎，放入37℃水浴鍋中溫浴30 min，待精子充分游離后，濾紙過(guò)濾多余組織，保留上清。

2.3 計(jì)算機(jī)輔助精液分析

吸取10 μL上清液于精子計(jì)數(shù)板上，利用計(jì)算機(jī)輔助精液分析儀選取5個(gè)視野對(duì)精子進(jìn)行常規(guī)分析，相關(guān)運(yùn)動(dòng)參數(shù)為VAP(平均速度)、VSL(直線速度)、VCL(曲線速度)、ALH(側(cè)擺幅度)、BCF(鞭打頻率)、LIN(直線性)和STR(前向性)。

2.4 Real time-PCR法檢測(cè)小鼠精子中SEPT4 mRNA表達(dá)

每0.1 g精子加入1 ml Trizol，冰上裂解10 min，勻漿后加入1/5體積氯仿劇烈振蕩搖勻，冰上靜置10 min，4℃離心12000 g×15 min。取上清400 ul移至另一EP管，加入等體積異丙醇搖勻，冰上放置10 min，4℃離心12000 g×15 min棄上清，加1 ml 75%乙醇洗滌沉淀，4℃離心12000 g×5 min棄上清，將沉淀(即RNA)風(fēng)干后溶于DEPC水備用。將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，根據(jù)PCR反應(yīng)體系以PCR儀獲得PCR產(chǎn)物，引物序列如下:SEPT4上游:5’-CCAGACTGTGATTCCGATGA-3’， 下 游: 5’-TGTTGCGATTCCGTTCCT-3’;GAPDH上游:5’-TGAGGCCGGTGCTGAGTATGT-3’， 下 游 5’-CAGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3’。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳、溴化乙啶染色后，在凝膠影像分析儀上成像，并對(duì)條帶進(jìn)行分析。

2.5 Western blot法檢測(cè)小鼠精子中SEPT4蛋白表達(dá)

以1×PBS洗滌精子上清液3次，即4℃離心12000 g×5 min。將純化的精子重懸于細(xì)胞裂解液，按1∶100加入PMSF，勻漿置冰上30 min。再4℃離心12000 g×5 min，取上清即為精子總蛋白。蛋白定量并配制10%SDS-PAGE電泳凝膠，60 V恒壓40 min濃縮蛋白后120 V電泳90 min，恒壓100 V 120 min將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜(polyvinylidenedifluoride，PVDF)，5%脫脂牛奶37℃封閉1 h，TBS-T 洗10 min×3次;加以稀釋的一抗兔抗小鼠SEPT4抗體(1∶1000)或者兔抗小鼠 GAPDH抗體(1∶1000)，4℃過(guò)夜。用TBS-T洗膜10 min×3次，加入含5%脫脂牛奶1∶5000稀釋的HRP標(biāo)記二抗，37℃搖動(dòng)孵育2 h。TBS-T洗膜10 min×3次，加ECL發(fā)光顯色，以Image J軟件對(duì)條帶密度進(jìn)行處理并計(jì)算平均密度值。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，對(duì)正態(tài)分布數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05、P＜0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 環(huán)磷酰胺對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響

圖1顯示，注射環(huán)磷酰胺后，3 d內(nèi)小鼠體質(zhì)量未見明顯變化;第5天至第34天與對(duì)照組比較，模型組、氯米酚組、雙補(bǔ)湯低劑量組及高劑量組小鼠體質(zhì)量均明顯減輕(P＜0.01);第40天高劑量組與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其他各組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，說(shuō)明環(huán)磷酰胺可降低小鼠體質(zhì)量。

3.2 雙補(bǔ)湯對(duì)弱精子癥小鼠精子運(yùn)動(dòng)功能的影響

表1顯示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠精子VAP、VSL、VCL、ALH、BCF、LIN顯著降低(P＜0.01)，STR降低(P＜0.05);與模型組比較，低劑量組VAP、VSL顯著上升(P＜0.01)，而STR及LIN上升(P＜0.05)，高劑量組 VAP、VSL、VCL、ALH、BCF、STR及LIN均顯著升高(P＜0.01)，氯米酚組VAP、VSL、VCL顯著上升(P＜0.01)，ALH、BCF、STR及LIN均升高(P＜0.05);與低劑量組比較，高劑量組VAP、ALH顯著升高(P＜0.01)，VSL、VCL、BCF、STR及LIN升高(P＜0.05)，氯米酚組VAP、VCL顯著上升(P＜0.01)，ALH升高(P＜0.05);與高劑量組比較，氯米酚組STR降低(P＜0.05)，顯示高劑量雙補(bǔ)湯治療效果與氯米酚相當(dāng)，但優(yōu)于低劑量組。

表1 各組小鼠計(jì)算機(jī)輔助精液分析結(jié)果(±s)

注:與對(duì)照組比較:*P＜0．05，＊＊P＜0．01;與模型組比較:△P＜0．05，△△P＜0．01;與低劑量組比較:#P＜0．05;##P＜0．01;與高劑量組比較:▲P＜0．05

組 別 VAP/(um/s) VSL/(um/s) VCL/(um/s) ALH(um) BCF(Hz) STR(%) LIN(%)對(duì) 照 組 142．57±15．76 100．73±8．07 208．26±16．31 7．96±0．84 15．63±3．49 74．3±9．15 50．5±6．31模 型 組 70．14±17．55＊＊74．40±8．00＊＊150．64±26．34＊＊5．04±2．04＊＊9．50±2．44＊＊56．1±12．07*31．0±6．39＊＊低劑量組 105．09±16．49△△93．74±14．46△△171．31±22．44 5．40±1．33 11．16±3．77 72．1±14．29△38．1±7．98△高劑量組 125．37±14．54△△##106．99±9．99△△#191．79±16．57△△##7．57±1．04△△##15．62±3．68△△##85．9±8．44△△#48．1±11．52△△#氯米酚組 126．51±21．01△△##97．22±17．24△△189．11±27．11△△##7．04±1．45△#13．25±4．37△71．8±13．55△▲41．2±12．02△

圖1 各組小鼠體質(zhì)量變化趨勢(shì)圖

3.3 雙補(bǔ)湯對(duì)小鼠精子中SEPT4 mRNA表達(dá)的影響

圖2顯示，與對(duì)照組比較，模型組 SEPT4 mRNA水平顯著下降(P＜0.01)，而氯米酚組及高劑量組較模型組顯著升高(P＜0.01)，低劑量組亦明顯升高(P＜0.05)。此外，氯米酚組與高劑量組SEPT4 mRNA水平較低劑量組明顯上升(P＜0.01)，顯示雙補(bǔ)湯可上調(diào)小鼠精子中 SEPT4 mRNA表達(dá)。

3.4 雙補(bǔ)湯對(duì)小鼠精子中SEPT4蛋白表達(dá)的影響

圖3顯示，與對(duì)照組比較，模型組SEPT4蛋白水平顯著下降(P＜0.01)，而氯米酚組、低劑量組及高劑量組較模型組顯著升高(P＜0.01)。此外，氯米酚組與高劑量組SEPT4蛋白水平較低劑量組明顯上升(P＜0.01)，證實(shí)雙補(bǔ)湯可上調(diào)小鼠精子中SEPT4蛋白表達(dá)。

圖2 Real time-PCR檢測(cè)各組SEPT4mRNA表達(dá)水平

圖3 Western blot檢測(cè)各組SEPT4蛋白表達(dá)水平

4 討論

本實(shí)驗(yàn)首次證實(shí)，雙補(bǔ)湯可改善環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的弱精子癥模型小鼠精子的運(yùn)動(dòng)功能，并進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)其可能通過(guò)上調(diào)SEPT4而發(fā)揮保護(hù)作用。

弱精子癥定義為精液參數(shù)中前向運(yùn)動(dòng)的精子(a級(jí)和b級(jí))小于50%或a級(jí)運(yùn)動(dòng)的精子小于25%［3］。研究顯示，81%男性不育患者與精子運(yùn)動(dòng)障礙有關(guān)，而其中約20%與精子活力低下密切相關(guān)［4］，因此用藥物改善精子運(yùn)動(dòng)障礙逐漸成為研究的熱點(diǎn)。環(huán)磷酰胺為烷化劑類抗腫瘤藥物，具有顯著的免疫抑制作用［5］。研究顯示，雄性小鼠注射環(huán)磷酰胺后，體質(zhì)量明顯下降，并出現(xiàn)精子活力下降和數(shù)量減少［6］。另外有報(bào)道，男性癌癥患者經(jīng)環(huán)磷酰胺治療后，弱精子癥的發(fā)病率顯著上升［7］。本研究中，環(huán)磷酰胺處理后，小鼠精神萎靡、食欲減退，出現(xiàn)體質(zhì)量下降，顯示出明顯的毒副作用。同時(shí)造成生殖系統(tǒng)毒性，小鼠睪丸萎縮，精液分析各項(xiàng)指標(biāo)明顯下降，引起精子運(yùn)動(dòng)功能障礙，表現(xiàn)為弱精子癥。而經(jīng)不同劑量雙補(bǔ)湯治療后，精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)顯著上升，高劑量組效果明顯優(yōu)于低劑量組，進(jìn)一步提高精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)，顯示雙補(bǔ)湯可改善環(huán)磷酰胺造成的精子運(yùn)動(dòng)功能障礙，并提高精子活力，提示雙補(bǔ)湯對(duì)弱精子癥具有明顯的治療作用。

弱精子癥的發(fā)病機(jī)制目前仍未完全闡明。近來(lái)研究顯示，Septins蛋白家族異常與男性不育密切相關(guān)［8］。Septins為GTP結(jié)合蛋白，主要參與細(xì)胞分裂、細(xì)胞骨架形成和細(xì)胞膜重塑［9］?，F(xiàn)已明確，Septins家族成員中，SEPT1、SEPT4、SEPT6、SEPT7、SEPT12存在于人類及小鼠精子的環(huán)狀帶中［10］。研究認(rèn)為，SEPT4蛋白失活在弱精子癥的發(fā)病中發(fā)揮了重要作用。Ihara［11］等證實(shí)，敲除SEPT4基因的雄性小鼠發(fā)生不育，精子鞭毛出現(xiàn)結(jié)構(gòu)缺陷，表現(xiàn)為精子活力下降、精子環(huán)狀帶被脆弱且缺乏皮質(zhì)的組織取代。另有研究發(fā)現(xiàn)，在SEPT4基因突變的小鼠中，其精子的頂體和線粒體出現(xiàn)結(jié)構(gòu)異常［12］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，雙補(bǔ)湯治療后明顯上調(diào)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的SEPT4 mRNA和蛋白水平，且高劑量組高于低劑量組，與精液分析結(jié)果一致，說(shuō)明雙補(bǔ)湯的治療作用以SEPT4為靶點(diǎn)，高劑量效果更佳，SEPT4激活后提高精子活力，從而改善其運(yùn)動(dòng)障礙，但雙補(bǔ)湯通過(guò)上調(diào)SEPT4而發(fā)揮保護(hù)作用的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

弱精子癥屬于中醫(yī)學(xué)“精冷”、“無(wú)子”、“艱嗣”、“虛勞”等范疇。腎為先天之本，藏精主生殖，脾為后天之本，氣血生化之源。脾陽(yáng)受損，易生寒濕，損傷腎陽(yáng);腎陽(yáng)不足，溫煦失司，損傷脾陽(yáng)，而脾腎陽(yáng)虛可致男性不育，影響精子的活力及運(yùn)動(dòng)功能。雙補(bǔ)湯出自吳鞠通《溫病條辨》，以人參、山藥、茯苓、蓮子、芡實(shí)甘溫而淡者補(bǔ)脾滲濕，其中蓮子、芡實(shí)為水中之谷，補(bǔ)土而不克水，又以補(bǔ)骨脂、肉蓯蓉、巴戟天、菟絲子、覆盆子、山萸肉、五味子升補(bǔ)腎臟陰中之陽(yáng)，兼能益精氣安五臟，該方可雙補(bǔ)脾腎之陽(yáng)氣，用于弱精子癥，使脾陽(yáng)充足則氣血生化有源、精血同源，可填補(bǔ)真精，腎陽(yáng)充足則可促進(jìn)精子的生發(fā)，最終提高精子的活力并改善其運(yùn)動(dòng)功能，是治療不育的良方。

綜上所述，本研究證實(shí)低劑量和高劑量雙補(bǔ)湯均可通過(guò)上調(diào)SEPT4蛋白改善精子的運(yùn)動(dòng)功能障礙，其中以高劑量組最佳，顯示雙補(bǔ)湯可能成為臨床治療弱精子癥不育患者的潛在藥物，并為治療弱精子癥提供了新的思路和理論依據(jù)。

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Research on the Effect and Mechanism of Shuangbu Decoction on Sperm Motility Disorder of Cyclophosphamide induced Asthenospermia Mouse Model

WU Yi-ting，JIANG Miao，SUN Jie，YANG Jin△
(Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210029，China)

Objective:To investigate the improvement of Shuangbu Decoction on sperm motility disorder of cyclophosphamide(CTX)induced asthenospermia mouse model and to explore the underlying mechanism．Methods:Male Kunming mice(n=50)were randomly divided into the control group(CG)，model group(MG)，Clomphid group (CLG)，small-dose group(SG)and large-dose group(LG)．MG，CLG，SG and LG were given the intraperitoneal injection of CTX to make the asthenospermia mouse model．The seminal fluid was analyzed by computer assisted semen analysis(CASA)，the protein and mRNA levels of SEPT4 in the sperms were detected by western blot and Real time-PCR，respectively．Results:CTX treatment decreased the sperm movement parameters of MG．However，the sperm movement parameters of LG and SG were significantly increased，compared with SG，the sperm movement parameters of LG was increased．CTX treatment decreased the expression levels of SEPT4 protein and mRNA of MG．Compared with MG，the expression levels of SEPT4 protein and mRNA of SG and LG were significantly increased．The expression levels of SEPT4 protein and mRNA of CLG and LG were higher than SG．Conclusion:Shuangbu Decoction could improve sperm motility disorder of CTX-induced asthenospermia mouse model through increasing the expression level of SEPT4 protein．

Shuangbu Decoction;Cyclophosphamide;SEPT4 protein;Asthenospermia

R285.5

B

1006-3250(2015)03-0298-04

2014-12-16

江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目(蘇政辦發(fā)［2011］6號(hào))

武宜婷(1987-)，女，江蘇連云港人，醫(yī)學(xué)碩士，從事溫病治法的臨床應(yīng)用與研究。

△通訊作者:楊 進(jìn)(1944-)，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，從事溫病治法的臨床 應(yīng) 用，Tel:13951743550，E-mail: 13951743550@163．com。