逍遙丸對(duì)小鼠卵母細(xì)胞BMP-6/Smads通路表達(dá)的影響*

楊麗蕓，杜惠蘭，白 靜，孫曉換，范麗潔

(河北中醫(yī)學(xué)院，中西醫(yī)結(jié)合生殖疾病協(xié)同創(chuàng)新中心，石家莊 050091)

逍遙丸對(duì)小鼠卵母細(xì)胞BMP-6/Smads通路表達(dá)的影響*

楊麗蕓，杜惠蘭△，白 靜，孫曉換，范麗潔

(河北中醫(yī)學(xué)院，中西醫(yī)結(jié)合生殖疾病協(xié)同創(chuàng)新中心，石家莊 050091)

目的:觀察逍遙丸對(duì)小鼠卵母細(xì)胞BMP-6、BMPR II、ALK-2、ALK-6、Smad1、Smad5、Smad8和Smad4表達(dá)的影響。方法: 將200只雌性小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為疏肝高、低劑量組、COH組和空白對(duì)照組4組各50只。應(yīng)用免疫組化和real-time PCR方法分別測(cè)定卵母細(xì)胞中BMP-6、BMPR II、ALK-2、ALK-6、Smad1、Smad5、Smad8和Smad4蛋白和mRNA的表達(dá)。結(jié)果:與空白對(duì)照組比較，COH組BMP-6、BMPR II、ALK-2、ALK-6、Smad1、Smad5、Smad8和Smad4蛋白和mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，各治療組BMP-6、ALK-2、ALK-6、Smad1、Smad5、Smad8和Smad4蛋白和mRNA表達(dá)增加，疏肝高劑量組優(yōu)于低劑量組;疏肝高劑量組BMPR II蛋白和mRNA表達(dá)增加。結(jié)論:逍遙丸可使BMP-6表達(dá)上調(diào)，激活其Ⅱ型受體BMPRⅡ形成受體復(fù)合物，然后募集Ⅰ型受體ALK-2和ALK-6使其活化，活化的Ⅰ型受體進(jìn)一步磷酸化細(xì)胞內(nèi)信號(hào)Smad1/5/8，然后與Smad4結(jié)合，從而啟動(dòng)信號(hào)傳導(dǎo)干預(yù)卵泡發(fā)育和卵母細(xì)胞的質(zhì)量。

逍遙丸;卵母細(xì)胞;BMPR II;ALK-2;ALK-6;Smad1;Smad5;Smad8;Smad4

目前，不孕癥已經(jīng)成為嚴(yán)重影響育齡夫婦家庭和社會(huì)和諧的關(guān)鍵性因素，其發(fā)病率日益提高，而卵子質(zhì)量是影響妊娠結(jié)局的重要因素之一。卵泡發(fā)育及卵子質(zhì)量受卵母細(xì)胞分泌因子(Oocyte secreted factors，OSFs)的調(diào)控，其在調(diào)節(jié)卵泡的發(fā)育和衰退、影響優(yōu)勢(shì)卵泡的選擇以及閉鎖卵泡的形成方面發(fā)揮著重要作用。其中卵母細(xì)胞分泌的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factor-β，TGF-β)超家族成員GDF-9與BMP-6通過與Ⅱ型絲氨酸/蘇氨酸激酶受體結(jié)合，與Ⅰ型受體共同作用啟動(dòng)信號(hào)傳導(dǎo)［1］，而Smads是TGF-β超家族下游信號(hào)傳導(dǎo)分子，在其信號(hào)傳導(dǎo)過程中發(fā)揮著重要作用。GDF-9和BMP-6及其Smads信號(hào)途徑對(duì)體內(nèi)卵泡發(fā)生發(fā)育、卵丘擴(kuò)散、卵母細(xì)胞的成熟至關(guān)重要［2-3］。疏肝法治療不孕癥臨床療效顯著［4］，本課題前期以逍遙丸作為疏肝法的代表方，研究疏肝法對(duì)無排卵模型大鼠生殖功能的影響，證實(shí)疏肝法可以通過改善腺垂體、卵巢形態(tài)，調(diào)節(jié)下丘腦神經(jīng)遞質(zhì)水平以及生殖內(nèi)分泌激素FSH、LH、E2水平，促進(jìn)卵泡發(fā)育和成熟，并可促進(jìn)子宮發(fā)育、調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜環(huán)境，以有利于孕卵著床;并發(fā)現(xiàn)逍遙丸促進(jìn)卵泡發(fā)育并誘發(fā)排卵的機(jī)制可能與上調(diào)小鼠卵母細(xì)胞和體外受精-胚胎移植(IVF-ET)患者卵泡液中生長(zhǎng)分化因子-9(GDF-9)的含量有關(guān)［5-6］。但對(duì)小鼠卵母細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，逍遙丸并未引起GDF-9下游Smads通路的明顯變化。而逍遙丸是否同樣能調(diào)控小鼠卵母細(xì)胞中BMP-6的表達(dá)，并激活其下游受體及蛋白，啟動(dòng)Smads信號(hào)傳導(dǎo)，進(jìn)而影響卵子的發(fā)育及質(zhì)量值得研究。本研究以觀察逍遙丸對(duì)小鼠卵母細(xì)胞BMP-6、相關(guān)受體BMPRII、ALK-2、ALK-6及下游 Smads通路中Smad1、Smad5、Smad8和Smad4表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討逍遙丸在促卵母細(xì)胞發(fā)育中的機(jī)制，豐富和完善中醫(yī)生殖理論。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雌性清潔級(jí)昆明小鼠200只，6～7周齡，體質(zhì)量28～32 g，購(gòu)自河北實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(動(dòng)物合格證號(hào)1207019)。自由飲水和進(jìn)食，飼養(yǎng)室溫度保持在(20±1)℃，相對(duì)濕度約50%，自動(dòng)控制光照12 h，黑暗12 h。

1.2 藥物

逍遙丸由河南宛西制藥股份有限公司生產(chǎn)(批號(hào)120404);將200、100丸分別溶于125ml蒸餾水中制成混懸液，高劑量生藥0.6 g/ml，低劑量生藥0.3 g/ml，置4℃冰箱中備用。孕馬血清(PMSG)，上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所產(chǎn)品(批號(hào)20120410);人絨毛膜促性腺激素(HCG)，麗珠集團(tuán)麗珠制藥廠生產(chǎn)(批號(hào)120413)。

1.3 主要試劑及儀器

兔抗小鼠BMP-6(批號(hào)bs-3671R);BMPR II(批號(hào)bs-4237R);ALK-6(批號(hào)sc-25455);Smad1(批號(hào)bs-1619R);Smad5(批號(hào)bs-2973R);Smad8(批號(hào)bs-4253R);Smad4(批號(hào)bs-0585R)，以上抗體均購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司;ALK-2購(gòu)自Abnova公司(批號(hào)PAB3474);RNA提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)ABI公司(批號(hào)AM1560);M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司(批號(hào)M1701);SYBR Green I熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自加拿大Fementas公司(批號(hào)K0221)。ND2000型紫外分光光度計(jì)，美國(guó)Thermo公司;ABI 7300型熒光定量PCR System，美國(guó)ABI公司。

2 方法

2.1 模型制備［7］

第11天同時(shí)腹腔注射PMSG 10IU/只，48 h后腹腔注射HCG 10IU/只。正常組每日陰道涂片，觀察動(dòng)情周期。

2.2 動(dòng)物分組及給藥情況

將200只雌性小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法完全隨機(jī)化分為4組，即疏肝高、低劑量組及控制性超排卵(COH)組和空白對(duì)照組各50只。于模型制備前10 d開始每日8∶00灌胃給藥。疏肝高、低劑量組分別給予逍遙丸混懸液0.6 g/ml、0.3 g/ml，COH組和空白對(duì)照組用蒸餾水灌胃。各組小鼠均1 ml/100 g體質(zhì)量灌胃，連續(xù)10 d。

2.3 觀察指標(biāo)及方法

2.3.1 卵母細(xì)胞提取方法 空白對(duì)照組小鼠于陰道涂片見到大量角化上皮細(xì)胞的次日、其余各組小鼠于注射HCG 16 h后脫頸椎處死，在超凈工作臺(tái)上手術(shù)打開實(shí)驗(yàn)小鼠腹腔，分別取出雙側(cè)輸卵管，置于裝有PBS的培養(yǎng)皿中，在體視鏡下用1 ml注射器針頭針劃破輸卵管壺腹部，觀察到有絮狀物釋出，此即為卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)，然后用透明質(zhì)酸酶消化掉顆粒細(xì)胞，用PBS反復(fù)沖洗，獲得MⅡ期卵母細(xì)胞。

2.3.2 免疫組化染色 將35只小鼠所獲取的MⅡ期卵母細(xì)胞移到多聚賴氨酸玻片表面，風(fēng)干后用4%多聚甲醛固定120 min，30%過氧化氫混合純甲醇浸泡30 min，5%牛血清白蛋白20 min。加入1 ∶50稀釋的抗體2 h，按照SABC免疫組化方法分別加入兔抗山羊二抗、SABC各20 min。按照DAB顯色法顯色10 min，脫水后封片。結(jié)合陽性細(xì)胞百分比及陽性細(xì)胞染色強(qiáng)弱2方面采用IHS評(píng)分。評(píng)分方法為［8］:①陽性細(xì)胞數(shù)百分比(記為a):＜1%=0分，1%～10%=1分，11%～50%=2分，51%～80%=3分，81%～100%=4分;②陽性細(xì)胞顯色強(qiáng)度(記為b):0分(陰性)、1分(弱陽性)、2分(陽性)、3分(強(qiáng)陽性);③a與b乘積為IHS評(píng)分進(jìn)行半定量分析:0為(－)，1～4分為(+)，5～8分為(++)，9～12分為(+++)。

2.3.3 Real-Time RT-PCR檢測(cè)BMP-6、BMPR II、ALK-2、ALK-6、Smad1、Smad5、Smad8 和Smad4mRNA表達(dá) 將15只小鼠所分離的卵母細(xì)胞置于低溫離心機(jī)中，4℃3000 rpm離心10 min，棄上清液，加入300 μL Lysis/Binding Solution裂解細(xì)胞，然后加入30 μL miRNA Homogenate Additive，吹打混勻，冰浴 10 min，加入 300 μL Acid-Phenol: Chloroform，漩渦混合30～60 sec，10000 rpm，室溫離心5 min，吸取上清液轉(zhuǎn)入新的離心管中，加入100%乙醇375 μL顛倒混勻。將上述液體加入離心柱內(nèi)芯，10000 rpm離心約15 s，使液體濾過離心柱。棄掉下層濾過的液體，向離心柱芯中加入700 μL miRNA Wash Solution 1，10000 rpm離心約15 s，使液體濾過離心柱，棄掉下層濾過的液體，向離心柱芯中加入500 μL Wash Solution 2/3，10000 rpm離心約15 s，使液體濾過離心柱，棄掉下層濾過的液體，此步驟重復(fù)1次。離心柱10000 rpm離心2 min，將濾芯轉(zhuǎn)入新的收集管中，向柱芯中央加入100 μL的Elution Solution，室溫靜置3 min，然后10000 rpm離心3 min，收集RNA溶解液，紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA的純度。反轉(zhuǎn)錄于 PCR儀上42℃進(jìn)行50 min，95℃加熱5 min，滅火反轉(zhuǎn)錄酶，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)反應(yīng):94℃ 30 s，58℃30 s，72℃30 s，于每個(gè)循環(huán)的第三個(gè)步驟收集熒光信號(hào)，擴(kuò)增完畢進(jìn)入結(jié)果分析界面，根據(jù)CT數(shù)據(jù)方法，得到的目的基因表達(dá)的相對(duì)定量值(RQ值)，用于統(tǒng)計(jì)分析各指標(biāo)mRNA的表達(dá)量。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，若滿足正態(tài)性及方差齊性，多組之間比較用方差分析，否則用秩和檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 各組小鼠卵母細(xì)胞 BMP-6、BMPR II、ALK-2、ALK-6、Smad1、Smad5、Smad8和Smad4蛋白表達(dá)比較

免疫組化結(jié)果顯示，空白對(duì)照組與COH組表現(xiàn)為胞質(zhì)呈黃色，疏肝低劑量組表現(xiàn)為胞質(zhì)呈黃色，邊緣較深，呈棕黃色;疏肝高劑量組卵母細(xì)胞表現(xiàn)為胞質(zhì)呈棕黃色。

表1顯示，與空白對(duì)照組比較，COH組BMP-6、BMPR II、ALK-2、ALK-6、Smad1、Smad5、Smad8和Smad4蛋白表達(dá)IHS評(píng)分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，各治療組 BMP-6、ALK-2、ALK-6、Smad1、Smad5、Smad8和Smad4蛋白表達(dá)IHS評(píng)分均顯著高于空白對(duì)照組及COH組(P＜0.05)，其中，疏肝高劑量組蛋白表達(dá)評(píng)分較疏肝低劑量組升高(P＜0.05)，疏肝高劑量組BMPR II蛋白表達(dá)增加(P＜0.05)。

表1 各組小鼠卵母細(xì)胞BMP-6、BMPR II、ALK-2、ALK-6、Smad1、Smad5、Smad8和Smad4蛋白表達(dá)比較(±s)

表1 各組小鼠卵母細(xì)胞BMP-6、BMPR II、ALK-2、ALK-6、Smad1、Smad5、Smad8和Smad4蛋白表達(dá)比較(±s)

注:與空白對(duì)照組比較:*P＜0.05;與COH組比較:△P＜0.05;與疏肝低劑量組比較:□P＜0.05;與疏肝高劑量組比較:▽P＜0.05

指標(biāo)/組別 空白對(duì)照組 COH組 疏肝低劑量組 疏肝高劑量組BMP-6蛋白 0.67±0.58 1.00±1.00□▽3.67±0.58＊△▽6.67±1.15＊△□BMPR II蛋白 2.00±1.00 1.67±0.58 2.33±0.58▽6.67±1.15＊△□ALK-2蛋白 0.67±0.58 1.33±0.58□▽3.00±1.00＊△▽6.67±1.15＊△□ALK-6蛋白 0.33±0.58 0.67±0.58□▽2.67±0.58＊△▽4.67±1.15＊△□Smad 1蛋白 0.67±0.58 0.67±1.15□▽2.67±0.58＊△▽4.67±1.15＊△□Smad 5蛋白 1.00±1.00 0.33±0.58□▽3.00±1.00＊△▽8.67±0.58＊△□Smad 8蛋白 0.67±0.58 1.00±1.00□▽2.67±0.58＊△▽8.67±0.58＊△□Smad 4蛋白 1.00±1.00 1.67±0.58□▽4.33±1.53＊△▽8.67±0.58＊△□

3.2 各組小鼠卵母細(xì)胞 BMP-6、BMPR II、ALK-2、ALK-6、Smad1、Smad5、Smad8和 Smad4 mRNA的表達(dá)比較

表2顯示，與空白對(duì)照組比較，COH組BMP-6、BMPR II、ALK-2、ALK-6、Smad1、Smad5、Smad8和Smad4 mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，疏肝高劑量組 BMPR II mRNA表達(dá)增加(P＜0.05);各治療組 BMP-6、ALK-2、ALK-6、Smad1、Smad5、Smad8和Smad4 mRNA表達(dá)較空白對(duì)照組及COH組增加(P＜0.05);疏肝高劑量組表達(dá)高于疏肝低劑量組(P＜0.05)。

表2 各組小鼠卵母細(xì)胞BMP-6、BMPR II、ALK-2、ALK-6、Smad1、Smad5、Smad8和Smad4 mRNA表達(dá)比較(±s)

表2 各組小鼠卵母細(xì)胞BMP-6、BMPR II、ALK-2、ALK-6、Smad1、Smad5、Smad8和Smad4 mRNA表達(dá)比較(±s)

注:與空白對(duì)照組比較:*P＜0.05;與COH組比較:△P＜0.05;與疏肝低劑量組比較:□P＜0.05;與疏肝高劑量組比較:▽P＜0.05

指標(biāo)/分組 空白對(duì)照組 COH組 疏肝低劑量組 疏肝高劑量組BMP-6 mRNA 1.125±0.333 1.058±0.176□▽2.090±0.172＊△▽2.544±0.245＊△□BMPRIImRNA 0.922±0.138 0.981±0.085 0.870±0.146▽1.309±0.203﹡△□ALK-2 mRNA 0.884±0.095 0.944±0.049□▽2.107±0.225＊△▽2.577±0.189＊△□ALK-6 mRNA 0.942±0.041 1.015±0.036□▽3.165±0.061＊△▽3.448±0.175＊△□Smad 1 mRNA 1.063±0.055 1.084±0.073□▽2.393±0.160＊△▽2.734±0.270＊△□Smad 5 mRNA 1.116±0.127 1.048±0.115□▽2.120±0.162＊△▽3.329±0.161＊△□Smad 8 mRNA 1.159±0.139 1.088±0.134□▽1.512±0.137＊△▽3.780±0.167＊△□Smad 4 mRNA 1.045±0.053 1.063±0.094□▽2.450±0.113＊△▽▲3.428±0.046＊△□

4 討論

卵泡的發(fā)育是一個(gè)連續(xù)變化的動(dòng)態(tài)過程，需要多種因素的調(diào)節(jié)，除了各種垂體釋放的激素以外，卵泡發(fā)育還依賴于各種生長(zhǎng)因子的作用，這其中TGF-β超家族起關(guān)鍵性的作用［9］。目前認(rèn)為，TGFβ超家族的成員與Ⅱ型絲氨酸/蘇氨酸激酶受體結(jié)合，與Ⅰ型受體共同作用啟動(dòng)信號(hào)傳導(dǎo)［1］。Ⅰ型受體主要有3種，分別為BMPR-IA、BMPR-IB及ActR-I(又稱Alk-3、Alk-6及Alk-2)。Ⅱ型受體主要有3種，分別為BMPR-Ⅱ、ActR-ⅡA及ActR-ⅡB。Smads是TGF-β超家族下游信號(hào)傳導(dǎo)分子，可將胞外信號(hào)從細(xì)胞膜傳遞入細(xì)胞核，在TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)過程中發(fā)揮重要作用。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)是屬于TGF-β超家族的多肽蛋白，其主要功能是誘導(dǎo)骨的發(fā)育和形成，并調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物生長(zhǎng)、細(xì)胞分化與凋亡等。BMP-6是骨形態(tài)發(fā)生蛋白家族成員之一，其基因定位在小鼠的13號(hào)染色體上，定位在人的6p24-6p23［10］。在卵泡發(fā)育過程中，卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞是BMP-6的主要來源［11-15］，目前對(duì)BMP-6信號(hào)途徑的研究還不深入，ALK-2、ALK-3、ALK-6已被鑒定為BMP-6的潛在Ⅰ型受體，其中ALK-2、ALK-6與 BMP-6親和力最強(qiáng)，BMPRⅡ、ActR-ⅡA和ActR-ⅡB被鑒定為潛在的Ⅱ型受體，但尚未確定不同類型卵巢細(xì)胞中BMP-6受體的差異［16］。在信號(hào)傳導(dǎo)過程中，Ⅱ型受體首先與配體結(jié)合形成受體復(fù)合物，然后募集Ⅰ型受體使其發(fā)生磷酸化而活化，活化的BMPⅠ型受體進(jìn)而磷酸化細(xì)胞內(nèi)信號(hào)受體Smad1、Smad5和Smad8，然后與Smad4形成聚合體，轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)直接作用于下游靶基因，或與其他轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子一起作用于靶基因［17］。

中醫(yī)認(rèn)為，肝主藏血，女性正常生理功能的經(jīng)、孕、胎、產(chǎn)都以血為用，故葉天士在《臨證指南醫(yī)案》中提出“女子以肝為先天”。肝主疏泄，喜條達(dá)，情志失調(diào)可導(dǎo)致肝的疏泄功能失常，進(jìn)而影響女性的生殖功能。《濟(jì)陰綱目》記載:“情不宣暢，經(jīng)多不調(diào)，故難成孕?！北菊n題組前期研究提示，逍遙丸有調(diào)節(jié)卵巢功能的作用，可使無排卵大鼠優(yōu)勢(shì)卵泡內(nèi)見到卵母細(xì)胞［18］。逍遙丸是在宋·《太平惠民和劑局方》“逍遙散”的基礎(chǔ)上應(yīng)用現(xiàn)代生產(chǎn)工藝技術(shù)所制成的新型中藥制劑，可疏肝解郁、養(yǎng)血調(diào)經(jīng)。方中柴胡疏肝解郁、條達(dá)肝氣;當(dāng)歸、白芍補(bǔ)氣養(yǎng)血調(diào)經(jīng);白術(shù)、茯苓、甘草健脾益氣，助脾化氣以養(yǎng)肝陰，使?fàn)I血生化有源，以增加當(dāng)歸和白芍的養(yǎng)血之功。諸藥合用疏肝解郁、養(yǎng)血活血，佐以健脾使氣血調(diào)和、沖任二脈調(diào)暢，卵細(xì)胞正常發(fā)育及排出。

本研究結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組及COH組比較，各治療組小鼠卵母細(xì)胞BMP-6、ALK-2、ALK-6、Smad1、Smad5、Smad8和Smad4蛋白及基因的表達(dá)增強(qiáng)，其中疏肝高劑量組的表達(dá)優(yōu)于疏肝低劑量組，疏肝高劑量組BMPR II蛋白及mRNA表達(dá)增加，提示逍遙丸可能是通過調(diào)節(jié)小鼠卵母細(xì)胞BMP-6的表達(dá)，募集BMP-6Ⅱ型受體BMPRⅡ形成受體復(fù)合物，然后募集Ⅰ型受體ALK-2和ALK-6，使其發(fā)生磷酸化而活化，活化的Ⅰ型受體進(jìn)一步磷酸化細(xì)胞內(nèi)信號(hào)Smad1/5/8，然后與Smad4結(jié)合，從而啟動(dòng)信號(hào)傳導(dǎo)。在這一過程中，疏肝高劑量組的作用明顯優(yōu)于低劑量組。本實(shí)驗(yàn)從信號(hào)通路的角度證實(shí)，疏肝法在干預(yù)卵泡發(fā)育和卵母細(xì)胞質(zhì)量方面效果顯著，進(jìn)一步豐富了中醫(yī)學(xué)“肝腎同源”、“精血互化”以及“肝主藏血”、“女子以肝為先天”的理論基礎(chǔ)，也為在臨床干預(yù)不孕癥及作為IVF-ET的輔助治療方案提供了堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

［1］ 李春燕，陳子江．生長(zhǎng)分化因子-9及生長(zhǎng)分化因子-9B與卵巢功能調(diào)節(jié)［J］．生殖與避孕，2004，26(4):355-399．

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Effect of Xiaoyao Pill on the Expression of BMP-6/Smads Signal Pathway in Mouse Oocytes

YANG Li-yun，DU Hui-lan△，BAI Jing，SUN Xiao-huan，F(xiàn)AN Li-jie
(Hebei University of Traditional Chinese Medicine，Shijiazhuang 050091，China)

Objective:To investigate the effects of Xiaoyao Pill on the expression of BMP-6，BMPR II，ALK-2，ALK-6，Smad1，Smad5，Smad8 and Smad4 in mouse oocytes．Methods:200 mice were randomly divided into 4 groups:Shugan high dose group，Shugan low dose group，COH group and control group(N=50)，the expression of BMP-6，BMPR II，ALK-2，ALK-6，Smad1，Smad5，Smad8 and Smad4 in mouse oocytes were detected by immunohistochemistry and Real-time PCR．Results:Compared with the control group，the protein content and mRNA expression of BMP-6，BMPRII，ALK-2，ALK-6，Smad1，Smad5，Smad8 and Smad4 in the COH group have no statistical significance．the protein content and mRNA expression of BMP-6，ALK-2，ALK-6，Smad1，Smad5，Smad8 and Smad4 in the treatment groups increased．The protein and mRNA expression in Shugan high dose group were higher than the Shugan low group．The protein and mRNA expression of BMPR II in Shugan high dose group were increased．Conclusion:Xiaoyao Pill can improve the expression of BMP-6 in mouse oocytes，activate its second type of receptor BMPRⅡ，and then activate receptors ALK-2/6，the acitvation of type 1 receptors phosporylate intracellular signal Smad1/5/8，then combine with Smad4，and start the signal transduction of Smads pathway to intervene the development and quality of oocytes．．

Xiaoyao Pill;Oocyte;BMPRII;ALK-2;ALK-6;Smad1;Smad5;Smad8;Smad4

R285．5

B

1006-3250(2015)03-0294-04

2014-12-02

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81173294)

楊麗蕓(1979-)，女，河北香河人，講師，醫(yī)學(xué)博士，從事中醫(yī)藥防治生殖內(nèi)分泌的基礎(chǔ)與臨床研究。

△通訊作者:杜惠蘭(1950-)，女，河北石家莊人，教授，醫(yī)學(xué)博士，從事中醫(yī)藥防治生殖內(nèi)分泌的基礎(chǔ)與臨床研究，Tel: 13931150880，E-mail:duhuilan@163．com。