益氣養(yǎng)陰通絡(luò)法對兔血管內(nèi)膜剝脫術(shù)后VEGF、bFGF、TGFβ1mRNA表達(dá)的影響*

楊 鶯，李文杰

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院心內(nèi)科，沈陽 110032)

益氣養(yǎng)陰通絡(luò)法對兔血管內(nèi)膜剝脫術(shù)后VEGF、bFGF、TGFβ1mRNA表達(dá)的影響*

楊 鶯，李文杰△

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院心內(nèi)科，沈陽 110032)

目的:觀察具有益氣養(yǎng)陰通絡(luò)功效的中藥欣舒注射液對兔血管內(nèi)膜剝脫術(shù)后VEGF、bFGF、TGFβ1mRNA表達(dá)的影響，探討欣舒注射液防治PCI術(shù)后再狹窄的機制。方法:將48只新西蘭大耳白兔按隨機數(shù)字表法分為A正常組、B模型組、C欣舒注射液組、D阿托伐他汀組每組各12只。2周后采集兔腹主動脈標(biāo)本光鏡觀察腹主動脈，RT-PCR法檢測腹主動脈VEGF、bFGF、TGFβ1mRNA表達(dá)。結(jié)論:欣舒注射液可通過增加VEGFmRNA表達(dá)，降低bFGF、TGF-β1mRNA表達(dá)，起到防治PCI術(shù)后再狹窄的作用。

益氣養(yǎng)陰通絡(luò);血管內(nèi)膜剝脫術(shù);VEGF;bFGF;TGFβ1;mRNA

經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀動脈介入術(shù)(PCI)已成為治療冠心病的主要手段之一，但術(shù)后再狹窄嚴(yán)重影響其遠(yuǎn)期的治療效果。經(jīng)皮冠狀動脈腔內(nèi)成形術(shù)(PTCA)術(shù)后再狹窄率可高達(dá)40%～50%，金屬裸支架植入術(shù)后約15%～30%，盡管藥物洗脫支架(DES)的問世使再狹窄率降低到10%以內(nèi)，但遠(yuǎn)期DES的安全問題如遲發(fā)性血栓事件、支架貼壁不良等問題值得擔(dān)憂，故再狹窄已成為影響冠心病介入術(shù)后遠(yuǎn)期療效的主要障礙。

中醫(yī)認(rèn)為，冠脈介入治療注重局部干預(yù)，整體關(guān)注不足是其缺點，而整體治療、整體調(diào)節(jié)是中醫(yī)藥的優(yōu)勢之一。PCI術(shù)后用中藥調(diào)整陰陽、調(diào)暢氣血，使陰平陽秘、氣血調(diào)和，恰好可彌補介入治療的不足。實驗研究也表明，某些中藥單體或復(fù)方制劑可作用于再狹窄的多個病理環(huán)節(jié)，臨床觀察亦證明有較好的療效，因此中醫(yī)藥在預(yù)防和治療冠脈介入術(shù)后再狹窄有良好的應(yīng)用前景。本研究通過觀察具有益氣養(yǎng)陰、活血通絡(luò)功效的中藥制劑欣舒注射液對兔腹主動脈球囊損傷術(shù)后內(nèi)皮生長因子(VEGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1 (TGFβ1)mRNA表達(dá)的影響，探討中藥欣舒注射液防治冠脈介入術(shù)后再狹窄的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

新西蘭大耳白兔48只，體質(zhì)量(2.5±0.5)kg，由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。

1.2 實驗藥物

1.2.1 欣舒注射液 由人參、麥冬、川芎組成，每1ml含總皂甙以人參皂甙Re(C48H82O18)計，不得少于0.80 mg。

1.2.2 阿托伐他汀 北京嘉林藥業(yè)股份有限公司(批準(zhǔn)文號國藥準(zhǔn)字H19990258)。

1.3 動物分組

按隨機數(shù)字表法分為A正常組、B模型組、C欣舒注射液組(簡稱中藥組)、D阿托伐他汀組(簡稱西藥組)。4組各12只，B、C、D組行手術(shù)造模。

1.4 動物造模

用20%烏拉坦溶液以5 mL/kg腹腔麻醉家兔，于右側(cè)腹股溝部進行脫毛消毒。切開皮膚分離右股動脈，穿刺右股動脈，逆行導(dǎo)入直徑2.5或3.0 mm的球囊導(dǎo)管(依血管直徑而定)至腎動脈下方，鹽水充盈球囊(壓力為4～6 kPa)，緩慢回拉導(dǎo)管至切口處，抽空球囊內(nèi)液體，使壓力降至零。重復(fù)上述過程反復(fù)3次，達(dá)到剝脫動脈內(nèi)皮的目的，然后撤出導(dǎo)管，結(jié)扎股動脈，縫合皮膚。

1.5 動物給藥方法

正常組未經(jīng)手術(shù)及用藥;模型組術(shù)前、術(shù)后未用藥;中藥組于術(shù)前1 d開始給予欣舒注射液(4 mL/ kg/d)，耳緣靜脈緩慢注射，連續(xù)用藥15 d;西藥組于術(shù)前1 d開始給予阿托伐他汀片(1 mg/kg/d)口服，連續(xù)用藥15 d。

1.6 標(biāo)本采取

造模2周，實驗動物麻醉后小心并迅速分離出腹主動脈，每只截取長約10 mm腹主動脈2段。一段用于光鏡檢測，生理鹽水沖洗后用4%甲醛液固定24 h，4℃冰箱保存;一段用于RT-PCR檢測，生理鹽水沖洗后立即置液氮內(nèi)凍存。

1.7 檢測指標(biāo)

光鏡觀察兔腹主動脈結(jié)構(gòu)，RT-PC R法檢測兔腹主動脈VEGF、bFGF、TGFβ1mRNA表達(dá)。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，先進行組間方差齊性檢驗，在方差齊的基礎(chǔ)上作方差分析，組間兩兩比較。

2 結(jié)果

2.1 光鏡結(jié)果

引物序列

圖1 光鏡正常組(4×10)

圖2 光鏡模型組(4×10)

圖3 光鏡中藥組(4×10)

圖4 光鏡西藥組(4×10)

正常腹主動脈血管壁分為內(nèi)膜、中膜和外膜，三者界限清楚。模型組可見內(nèi)膜不規(guī)則增厚，使管腔明顯狹窄。中藥組和西藥組也可見到內(nèi)膜增厚、管腔狹窄，但增生程度較模型組有不同程度的減輕，纖維排列與模型組比較相對整齊。

2.2 RT-PCR結(jié)果及分析

欣舒注射液對腹主動脈VEGF、bFGF、TGFβ1mRNA表達(dá)的影響(RT-PCR)(±s)

欣舒注射液對腹主動脈VEGF、bFGF、TGFβ1mRNA表達(dá)的影響(RT-PCR)(±s)

注:與模型組比較:▲▲P＜0.01;與正常組比較:＊＊P＜0.01

組 別 例數(shù) VEGF bFGF TGFβ1正常組 10 0.256±0.0234 0.343±0.0397 0.310±0.0281模型組 10 0.288±0.0459 0.686±0.0634＊＊ 0.607±0.0498＊＊中藥組 10 0.423±0.0592▲▲＊＊0.535±0.0480▲▲ 0.441±0.0339▲▲西藥組 10 0.388±0.0397▲▲＊＊0.519±0.0336▲▲ 0.381±0.0198▲▲

3 討論

兔腹主動脈球囊損傷后，腹主動脈VEGFmRNA表達(dá)雖較正常組高，但與正常組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P ＞0.05)，腹 主 動 脈 bFGFmRNA、TGFβ1mRNA表達(dá)明顯升高，與正常組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。中藥組、西藥組可明顯增加VEGFmRNA表達(dá)，與正常組、模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，中藥組、西藥組可明顯減少bFGFmRNA、TGFβ1mRNA表達(dá)與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。

圖1 VEGFmRNA瓊脂糖凝膠電泳條帶圖

圖2 bFGFmRNA瓊脂糖凝膠電泳條帶圖

圖3 TGFβ1mRNA瓊脂糖凝膠電泳條帶圖

圖4 β-actin瓊脂糖凝膠電泳條帶圖

欣舒注射液是在益氣養(yǎng)陰、活血通絡(luò)治療原則指導(dǎo)下組成的中藥復(fù)方制劑，由人參、麥冬、川芎組成。方中人參大補元氣、補脾益肺、生津安神。《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》曰:“方書謂人參不但補氣，若以補血藥輔之，亦善補血。愚則謂若輔以涼潤之藥，即能氣血雙補，蓋平其熱性不使耗陰，氣盛自能生血也。”麥冬具有養(yǎng)陰潤肺、益胃生津、清心除煩的功效。《本草正義》曰:“麥冬，其味大甘，膏脂濃郁，故專補胃陰，滋津液，本是甘藥補益之上品?！贝ㄜ壕哂谢钛袣?、祛風(fēng)止痛的功效?！侗静輩R言》:“味辛性陽，氣善走竄而無陰凝黏滯之態(tài)，雖入血分，又能去一切風(fēng)，調(diào)一切氣。”人參、麥冬、川芎合用，共奏益氣養(yǎng)陰﹑活血通絡(luò)之功，且補中有散、補而不滯，行血而不破血，為益氣養(yǎng)陰、活血通絡(luò)之基礎(chǔ)方。現(xiàn)代藥理研究表明，人參主要成分為人參皂甙，皂甙為人參生理活性的物質(zhì)基礎(chǔ)。人參、黃芪及其水提物可以通過增加血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)中的一氧化氮(NO)含量而防治動脈粥樣硬化(AS)的發(fā)生發(fā)展［1］。兔結(jié)扎冠狀動脈前降支，造成實驗性心肌梗死后，靜注麥冬注射液5 g(生藥)/kg，連續(xù)5 d，有縮小梗死范圍及壞死區(qū)域的作用［2］。川芎嗪［3］能有效抑制血小板衍生生長因子-BB(PDGF-BB)誘導(dǎo)的VSMC增殖，并使G0/G1期細(xì)胞數(shù)明顯增多，而S +G2/M期細(xì)胞數(shù)明顯減少，說明增殖周期停滯于G0/G1期。

本實驗中，兔腹主動脈球囊損傷后，血管內(nèi)膜增生明顯，腹主動脈VEGFmRNA表達(dá)無明顯變化，腹主動脈bFGF、TGFβ1mRNA表達(dá)明顯升高，提示球囊損傷造成血管內(nèi)皮不同程度地剝脫、損傷和功能紊亂，勢必在術(shù)后再狹窄的形成過程中起重要作用。內(nèi)皮損傷是再狹窄發(fā)生的啟動及促進因素，內(nèi)膜完整性的缺失是新生內(nèi)膜增厚的基礎(chǔ)。生理狀態(tài)下，各種收縮(促)生長因子與擴張(抑)生長因子處于平衡狀態(tài)，從而調(diào)節(jié)血管的張力和平滑肌細(xì)胞(SMC)生長。當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞受損、功能失調(diào)時，各種收縮(促)生長因子與擴張(抑)生長因子的生理平衡狀態(tài)被打破，舒血管物質(zhì)如NO等釋放減少，內(nèi)皮素(ET)等縮血管物質(zhì)生成增多，bFGF、TGFβ1等生長因子生成增多，導(dǎo)致白細(xì)胞、血小板黏附、血栓形成和SMC異常增生，是啟動和促進再狹窄的重要原因。VEGF是一種特異的內(nèi)皮細(xì)胞(EC)促分裂劑，它可以促進內(nèi)皮新生和血管生長。此外，VEGF還有促進纖溶酶活性、防止血栓形成、增加毛細(xì)血管通透性和舒張血管的作用，因此VEGF在血管損傷修復(fù)和防止再狹窄中具有十分重要的意義。本實驗中，中藥組和西藥組可抑制內(nèi)膜增生，治療后內(nèi)膜增生程度有不同程度的減輕，腹主動脈VEGFmRNA表達(dá)升高，腹主動脈bFGFmRNA、TGFβ1mRNA表達(dá)下降，說明中藥欣舒注射液可促進球囊損傷血管的內(nèi)皮修復(fù)，防止再狹窄的發(fā)展。

中藥欣舒注射液可通過增加VEGFmRNA表達(dá)，降低bFGF、TGF-β1mRNA表達(dá)，促進球囊損傷血管的內(nèi)皮修復(fù)，起到防治PCI術(shù)后再狹窄的作用。

［1］靳朝東.通過黃芪、人參和黃芩提取物的處理增加血管平滑肌中NO含量和環(huán)磷鳥苷含量［J］.中草藥，1996，27:316.

［2］趙國平，戴慎，陳仁壽.中藥大辭典［M］.上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2013:1429.

［3］張健，蔡生業(yè)，姚成芳，等.川芎嗪對PDGF-BB誘導(dǎo)的大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖和骨橋蛋白mRNA表達(dá)的影響［J］.山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2005，29(3):232.

Expression of VEGF，bFGF，TGFβ1mRNA of Rabbits after Intima Denudation，by the Influence of Supplementing Qi，Nourishing Yin and Removing Meridian Obstruction Method

YANG Ying，LI Wen-jie△
(Affiliated Hospital of Lianning University of TCM，Shenyang 110032，China)

Objective:To observe the expression of VEGF，bFGF，TGFβ1mRNA of rabbits after intima denudation，under the influence of Xinshu injection，which has effects of supplementing Qi，nourishing Yin and removing meridian obstruction.Also，to investigate the mechanism of Xinshu injection preventing and curing the restenosis after PCI operation.Method:The 48 new-zealand big ear white rabbits were randomly divided into 4 groups，A the normal group、B the model group、C Xinshu injection group、D the Atorvastatin group.After 2 weeks，these animals were collected the specimen of abdominal aorta.Besides observing the rabbits’abdominal aorta under the light microscope，and used the RT-PCR to detect the expression of VEGF、bFGF、TGFβ1mRNA of the abdominal aorta.Conclusion:Xinshu injection can prevent and cure the restenosis after PCI operation，its effect is related to the mechanisms that elevate the VEGF expression，while degrade the expression of bFGF、TGF-β1.

Supplement qi nourishing Yin and removing merdian obstruction;Intima Denudation;VEGF;bFGF; TGFβ1;mRNA

R285.5

B

1006-3250(2015)01-0053-03

2014-09-17

遼寧省教育廳資助項目-益氣養(yǎng)陰通絡(luò)法防治PCI術(shù)后再狹窄的實驗研究(L2012347)

楊 鶯(1976-)，女，沈陽人，副主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，從事動脈粥樣硬化及其相關(guān)心血管疾病的中西醫(yī)結(jié)合防治與研究。

△通訊作者:李文杰(1964-)，男，丹東人，主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，從事中西醫(yī)結(jié)合防治心血管系統(tǒng)疾病的臨床與研究，Tel:18102456128。