發(fā)光細(xì)菌法在環(huán)渤海污水樣品遺傳毒性檢測(cè)中的應(yīng)用*

崔志松　欒　曉　高　偉　李　倩　楊官品　鄭　立①

(1. 中國(guó)海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院　青島　266003; 2. 國(guó)家海洋局第一海洋研究所海洋生態(tài)研究中心　青島　266061)

環(huán)渤海經(jīng)濟(jì)圈為中國(guó)經(jīng)濟(jì)的第三個(gè)隆起地帶(李立華, 2004), 在對(duì)環(huán)渤海經(jīng)濟(jì)開(kāi)發(fā)的同時(shí), 一些工業(yè)廢水、生活污水的排放造成環(huán)渤海的生態(tài)環(huán)境惡化,受污染的水質(zhì)嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康、漁業(yè)和生態(tài)系統(tǒng)安全。人類(lèi)向環(huán)渤海的海域中排放了大量具有遺傳毒性的“三致”(鄭相宇等, 2004)污染物, 危害人類(lèi)的健康,對(duì)渤海水質(zhì)的遺傳毒性進(jìn)行快速、有效的監(jiān)測(cè), 可為降低生態(tài)健康風(fēng)險(xiǎn)提供技術(shù)支撐。傳統(tǒng)的化學(xué)分析方法雖然數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠, 但是對(duì)于惡化的水質(zhì)中的有機(jī)混合物, 檢測(cè)過(guò)程費(fèi)力費(fèi)時(shí)而且昂貴, 對(duì)于一些突發(fā)意外事故, 例如蘭州飲用水苯超標(biāo)事件, 化學(xué)檢測(cè)法面臨著挑戰(zhàn)。生物傳感器在這方面是一個(gè)補(bǔ)充, 檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)便、成本低, 適于現(xiàn)場(chǎng)快速和高通量應(yīng)用, 且能反映樣品中毒性物質(zhì)間的拮抗、加合和協(xié)同作用(Sorensenet al, 2006)。

發(fā)光細(xì)菌法(luminescence bacteria test, LBT)常被用作早期預(yù)警系統(tǒng)。其中國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) GB/T 15411-1995提出了用明亮發(fā)光桿菌 T3小種作為水質(zhì)急性毒性的檢測(cè)方法。還有重金屬污染土壤的檢測(cè)方法(李彬等,2001), 那廣水等(2010)采用發(fā)光細(xì)菌檢測(cè)排污口的總有機(jī)污染物的急性毒性等, 都是使用 T3作為供試菌種。ADPWH_ALK發(fā)光細(xì)菌被應(yīng)用于檢測(cè)大連溢油的生物毒性檢測(cè)(Zhanget al, 2013), 越來(lái)越多的發(fā)光細(xì)菌作為生物傳感器檢測(cè)水質(zhì)、土壤等受污染的狀況。

經(jīng)遺傳改造的不動(dòng)桿菌RecA菌株(Acinetobactersp. RecA)的染色體上具有recA基因(毛裕民等, 1989)與發(fā)光基因luxCDABE基因(茆婷等, 2009)的融合結(jié)構(gòu)。luxCDABE基因最初由土壤微生物Photorhabdus luminescens中發(fā)現(xiàn)并分離得到(何文杰等, 2007),luxCDABE不含啟動(dòng)子, 轉(zhuǎn)錄受其上游的 recA 基因控制,luxCDABE基因編碼熒光素酶, 在熒光素酶作用下, FMNH2和RCHO被O2氧化, 產(chǎn)生的能量并不被生物體儲(chǔ)存, 而是通過(guò)光的形式釋放出來(lái)。絲裂霉素C (Mitomycin C, 以下簡(jiǎn)稱(chēng)MMC)是一種常見(jiàn)的遺傳毒物。當(dāng)細(xì)胞暴露于遺傳毒物引起 DNA受損時(shí),recA基因與 DNA損傷修復(fù)相關(guān)。雖然不動(dòng)桿菌的recA基因的作用機(jī)制尚不清晰, 但有研究表明其具有與大腸桿菌中 recA基因類(lèi)似的功能(Greggjollyet al, 1994; Hareet al, 2006), 因此recA基因的表達(dá)將引起luxCDABE基因大量表達(dá)熒光素酶, 通過(guò)儀器測(cè)量其光強(qiáng), 即實(shí)現(xiàn)生物傳感功能。

環(huán)渤海受污染的水質(zhì)中, 重金屬、石油烴等污染物含量不盡相同, 所具有的總遺傳毒性也不相同, 本文采用經(jīng)過(guò)遺傳改造的不動(dòng)桿菌 RecA(宋一之等,2010)對(duì)環(huán)渤海的12個(gè)排污口污水樣品的遺傳毒性進(jìn)行快速檢測(cè)和評(píng)價(jià), 為今后近海海洋環(huán)境的監(jiān)測(cè)提供技術(shù)支撐。

1　材料與方法

1.1　實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1儀器設(shè)備單管式化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀(德國(guó)Berthold公司, Lumat LB9507), 超凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司, SW-CJ-1FD), 恒溫培養(yǎng)搖床(上海一恒科學(xué)儀器公司, THZ-100 biuepard), 分光光度計(jì)(尤尼柯上海儀器有限公司, Unico WFJ2000),自動(dòng)滅菌鍋(日本 Tomy SS-325), pH計(jì)(梅特勒-托利多儀器有限公司, FE20), 鹽度計(jì)(EUTECH instruments)。

1.1.2供試菌種采用經(jīng)遺傳改造的不動(dòng)桿菌RecA菌株(Acinetobactersp. RecA)作為發(fā)光細(xì)菌對(duì)環(huán)渤海污水樣品進(jìn)行生物毒性檢測(cè)。

1.1.3發(fā)光細(xì)菌培養(yǎng)基LB_K培養(yǎng)基, Tryptone(Oxoid LTD, Basingstoke, Hampsshire, England) 10g,Yeast (Oxoid LTD, Basingstoke, Hampsshire, England)5g, NaCl (滬試, AR) 10g, pH 7.0, 121°C滅菌后添加卡那霉素(北京方程, Sigma試劑)至終濃度10μg/mL。

1.1.4環(huán)渤海排污口樣品污水樣品采自環(huán)渤海排污口的12個(gè)站點(diǎn), 分別是受污染較為嚴(yán)重的河道、鋅廠(chǎng)、造紙廠(chǎng)等, 其地理位置見(jiàn)圖1。

圖1　采樣站位區(qū)域分布圖Fig.1　Distribution of the sampling sites in the Bohai Sea

1.2　實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1水樣的采集和前處理采用500mL棕色瓶采集污水樣品, 低溫運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室后立即進(jìn)行生物毒性測(cè)試。采用純凈水作為現(xiàn)場(chǎng)空白樣。

1.2.2發(fā)光細(xì)菌的準(zhǔn)備采用接種環(huán)將甘油凍存的發(fā)光細(xì)菌RecA在LB_K平板上劃線(xiàn), 經(jīng)培養(yǎng)后從平板上挑取RecA單菌落接種到50mL LB_K液體培養(yǎng)基中, 于恒溫?fù)u床中30°C、150r/min振蕩培養(yǎng)16h,所得菌液保存于4°C, 此液為種子液。

取1mL種子液接種到50mL LB_K中, 于恒溫?fù)u床中 30°C、150r/min振蕩培養(yǎng) 16h, 測(cè)定 OD600值, 以確定達(dá)到平臺(tái)期。所得菌液及時(shí)使用, 此為檢測(cè)污染物生物毒性實(shí)驗(yàn)用的菌液。

1.2.3遺傳毒性測(cè)試體系采用無(wú)菌水作為遺傳毒性檢測(cè)過(guò)程中的陰性對(duì)照樣品。分別采用0.02、0.1、0.2、1、2mg/L的MMC作為遺傳毒性檢測(cè)過(guò)程中的陽(yáng)性對(duì)照樣品。前期研究表明,RecA在稀釋100倍時(shí), 對(duì)MMC的響應(yīng)最明顯。

RecA進(jìn)行遺傳毒性檢測(cè)的體系為: 10μL重懸菌液 + 990μL污水樣品(或陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照)。

所有檢測(cè)污水樣品及對(duì)照樣品均設(shè)置3個(gè)平行。

1.2.4鹽度對(duì) RecA發(fā)光曲線(xiàn)的影響RecA發(fā)光細(xì)菌對(duì)鹽度敏感, 過(guò)大或者過(guò)小的鹽度對(duì)發(fā)光會(huì)造成明顯影響, 在污水樣品測(cè)試過(guò)程中, 不但需要維持陰性對(duì)照、陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)以及污水樣品的鹽度統(tǒng)一,還要選取適當(dāng)?shù)柠}度, 使得 RecA的發(fā)光變化表現(xiàn)最明顯。

鹽度的調(diào)整使用NaCl, 每個(gè)陰性、陽(yáng)性對(duì)照以及樣品的鹽度均調(diào)整為35。

1.2.5污水樣品遺傳毒性的檢測(cè)根據(jù)污水樣品對(duì)菌株RecA在3h后的發(fā)光誘導(dǎo)率。

平均相對(duì)發(fā)光率(LR) = 樣品或陽(yáng)性對(duì)照平均相對(duì)發(fā)光量(RLU) / 空白對(duì)照平均相對(duì)發(fā)光量(RLU)

相對(duì)發(fā)光誘導(dǎo)率(IR) = LR－1

得到回歸線(xiàn)性方程, 并查相關(guān)系數(shù)顯著水平P值表, 檢驗(yàn)所求r值的顯著水平P＜0.01, 所求的方程成立, 反之不成立。根據(jù)回歸方程計(jì)算污水樣品中有毒污染物等效應(yīng)的MMC濃度, 并根據(jù)其等效應(yīng)濃度值確定遺傳水平的大小。毒性分級(jí)情況詳見(jiàn)表1。

表1　水質(zhì)遺傳毒性的分級(jí)Tab.1　The genotoxicity classification of water quality

2　結(jié)果與討論

2.1　鹽度確定實(shí)驗(yàn)

2.1.1鹽度對(duì)RecA發(fā)光強(qiáng)度的影響RecA對(duì)于測(cè)試環(huán)境中的鹽度有比較大的反應(yīng), 每個(gè)樣品的鹽度不一樣, 勢(shì)必會(huì)造成發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光產(chǎn)生變化,應(yīng)維持陽(yáng)性對(duì)照以及樣品中鹽度的統(tǒng)一。如圖2所示, 鹽度越低, RecA隨時(shí)間的發(fā)光值就會(huì)變得越大,50、70的鹽度對(duì)RecA發(fā)光的影響雖然近似平穩(wěn), 但是數(shù)值太低, 實(shí)驗(yàn)中會(huì)出現(xiàn)較大的誤差, 0、5、10鹽度數(shù)值升高的幅度很大, 但是發(fā)光并不穩(wěn)定, 發(fā)光快速升高的情況有可能抵消RecA被污染物質(zhì)影響發(fā)光下降的情況。因此在遺傳毒性檢測(cè)的時(shí)候, 選取 30附近的鹽度, 發(fā)光趨于平穩(wěn), 并且數(shù)值較大, 可以反映遺傳毒性的大小。

圖2　不同鹽度下RecA發(fā)光細(xì)菌隨時(shí)間的發(fā)光變化Fig.2　Luminescence changes in RecA luminous bacteria in different salinities over time

2.1.2污水樣品的鹽度測(cè)定結(jié)果使用鹽度計(jì)測(cè)試污水樣品的鹽度, 發(fā)現(xiàn)大部分站點(diǎn)的鹽度偏低, 如表2所示, 僅有 BH5和 BH10兩個(gè)站點(diǎn)的鹽度接近10, 沒(méi)有達(dá)到發(fā)光細(xì)菌表現(xiàn)的最適鹽度, 所以需要通過(guò)添加NaCl將污水樣品組的鹽度調(diào)整到35, 陽(yáng)性對(duì)照組的鹽度也是 35, 從而實(shí)現(xiàn)相同鹽度條件下發(fā)光細(xì)菌對(duì)陽(yáng)性對(duì)照以及對(duì)樣品的測(cè)定。

表2　12個(gè)排污口的測(cè)定鹽度和調(diào)整后的鹽度Tab.2　The salinity measured and adjusted for all 12 outfalls

2.2　遺傳毒性評(píng)價(jià)

圖3　不同濃度下MMC的誘導(dǎo)率IRFig.3　The IR at different concentrations of MMC

2.2.1MMC的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)不同濃度MMC的IR如圖3所示。隨著MMC濃度的增加,RecA的發(fā)光增強(qiáng)呈現(xiàn)出明顯的正相關(guān)關(guān)系, 在 3h時(shí), 通過(guò)公式計(jì)算發(fā)光誘導(dǎo)率。y= 97.67x+ 17.052,R2= 0.9755,實(shí)驗(yàn)所求的r值的顯著水平P=0.0016＜0.01, 所求的方程成立?？梢圆捎么朔匠逃?jì)算樣品對(duì)發(fā)光細(xì)菌產(chǎn)生的發(fā)光誘導(dǎo)率, 并對(duì)遺傳毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

2.2.2實(shí)驗(yàn)樣品對(duì) RecA 的發(fā)光影響樣品中, 根據(jù)污染物化學(xué)檢測(cè)結(jié)果, 每個(gè)站點(diǎn)具有遺傳毒性的重金屬、VOCs、石油烴以及PAHs含量各不相同。對(duì)于發(fā)光細(xì)菌的影響也不相同, 根據(jù)1.2.5中的相對(duì)發(fā)光誘導(dǎo)率的公式, 計(jì)算陽(yáng)性對(duì)照以及樣品的相對(duì)發(fā)光誘導(dǎo)率, 具體的相對(duì)發(fā)光誘導(dǎo)率大小如圖4所示。

圖4　陽(yáng)性對(duì)照以及每個(gè)排污口站點(diǎn)的誘導(dǎo)率Fig.4　The IR of the positive control and every outfall site

實(shí)驗(yàn)中, BH1、BH2、BH3、BH4對(duì)于RecA的誘導(dǎo)作用十分明顯, 表現(xiàn)出明顯的遺傳毒性, 有的站點(diǎn)例如BH5、BH6、BH7、BH8對(duì)RecA的誘導(dǎo)作用不明顯, 相應(yīng)的遺傳毒性也不明顯, 剩余的一部分BH9、BH10、BH11、BH12對(duì)RecA的誘導(dǎo)屬于中等,表現(xiàn)出的遺傳毒性也是中等。

2.2.3遺傳毒性分析等效應(yīng)的 MMC濃度計(jì)算,根據(jù) 2.2.1的相對(duì)發(fā)光誘導(dǎo)率的公式, 根據(jù)相對(duì)發(fā)光誘導(dǎo)率的大小計(jì)算所對(duì)應(yīng)的x值即等效應(yīng)的MMC濃度, 如表3所示。

表3　每個(gè)排污口的相對(duì)發(fā)光誘導(dǎo)率、等效應(yīng)MMC濃度以及毒性分級(jí)Tab.3　The IR, equivalent MMC concentration, and toxicity evaluation at each outfall

從毒性分級(jí)的對(duì)比情況看, 每個(gè)站點(diǎn)的遺傳毒性具有顯著差異, 并且低毒、中毒、高毒、劇毒都有表現(xiàn), 如圖5所示, 排污口中的水受到不同污染物(例如重金屬、VOCs、PAHs和石油烴)的污染, 其遺傳毒性的總和在RecA發(fā)光細(xì)菌中得到了表現(xiàn), 一些大理石切割廠(chǎng)、造紙廠(chǎng)、化工廠(chǎng)以及鋅廠(chǎng)排放的污水中,遺傳毒性屬于高毒和劇毒, 此處站點(diǎn)水樣顏色發(fā)紅發(fā)黑, 水質(zhì)大多惡臭, 很難有生物生存。

圖5　不同毒性分級(jí)所占比例Fig.5　The proportion of different toxicity grades

從取水樣的地理位置看, 山東半島臨近環(huán)渤海地區(qū)取樣4個(gè)站點(diǎn)中, 毒性屬于高毒以上, BH4站點(diǎn)的遺傳毒性甚至居于劇毒, 此處站點(diǎn)化工廠(chǎng)較多, 排放的污染物質(zhì)也居多。遼東半島的4個(gè)站點(diǎn)毒性總體比山東半島低一些, 但也屬于高毒區(qū)域, 造成此站點(diǎn)遺傳毒性居高的原因中, 一些鋅廠(chǎng)、造紙廠(chǎng)排放的污水起到了很大作用。毒性最小的4個(gè)站點(diǎn)屬于京津冀地區(qū), 此地區(qū)的站點(diǎn)排污口臨近于河水, 以生活類(lèi)污水為主, 總的遺傳毒性明顯低于山東半島和遼東半島的排污口。

3　結(jié)論

本次實(shí)驗(yàn)是使用遺傳改造的不動(dòng)桿菌對(duì)環(huán)渤海的排污口水質(zhì)的遺傳毒性進(jìn)行的檢測(cè), 此發(fā)光細(xì)菌可以直接反應(yīng)總遺傳毒物的含量, 確定水質(zhì)對(duì)生物體的遺傳影響, 在一定范圍內(nèi), 遺傳毒物劑量越大、毒性越強(qiáng), 菌株的發(fā)光強(qiáng)度越高。通過(guò)儀器測(cè)量其光強(qiáng), 證明了RecA菌株作為一種生物傳感器可快速檢測(cè)環(huán)渤海排污口中受污染的水質(zhì), 實(shí)現(xiàn)遺傳毒性的檢測(cè)與評(píng)價(jià)。RecA喪失染色體進(jìn)一步同源重組的能力, 具有較高的遺傳穩(wěn)定性, 在環(huán)境樣品遺傳毒性的高靈敏度迅速檢測(cè)中具有廣闊的前景。而對(duì)于單獨(dú)檢測(cè)水體中重金屬、石油烴、PAHs甚至是富營(yíng)養(yǎng)化物質(zhì)來(lái)確定水質(zhì)毒性, 發(fā)光細(xì)菌具有更加直觀(guān)簡(jiǎn)便的特點(diǎn)。

隨著檢測(cè)體系的完善, 發(fā)光細(xì)菌法將和電子技術(shù)以及光電技術(shù)相結(jié)合(王兆群等, 2009), 逐步發(fā)展為在線(xiàn)監(jiān)測(cè)系統(tǒng), 為水質(zhì)分析提供更加快速的測(cè)試手段。另一發(fā)展方向就是與先進(jìn)的化學(xué)分析方法(方戰(zhàn)強(qiáng)等, 2003)相結(jié)合, 為環(huán)境監(jiān)測(cè)提供更加全面和細(xì)微的毒性分析。

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