新疆北疆豬偽狂犬病毒野毒的PCR檢測

竇立靜，齊向濤

（1.新疆石河子市獸醫(yī)衛(wèi)生檢疫所，新疆 石河子 832003；2.石河子大學動物科技學院 新疆 石河子 832003）

新疆北疆豬偽狂犬病毒野毒的PCR檢測

竇立靜1，齊向濤2

（1.新疆石河子市獸醫(yī)衛(wèi)生檢疫所，新疆 石河子 832003；2.石河子大學動物科技學院 新疆 石河子 832003）

根據豬偽狂犬病毒（PrV）非必需糖蛋白gE基因特異引物，建立了針對PrV野毒的PCR檢測方法。利用該方法對采自北疆地區(qū)部分規(guī)?；i場的92份疑似病料進行了檢測，PrV檢出率為40.2%(37/92)，表明該檢測方法敏感性、特異性較高，最低病毒檢出量約為0.25pg，可用于PrV野毒感染的快速診斷和流行病學調查。對陽性病料PrV gE基因的特異性序列進行對比分析發(fā)現有15個病料發(fā)生變異，經DNAMAN分析其同源性高達98.3%，初步判斷這些野毒株仍屬于同一個基因型。實驗結果為了解新疆北疆地區(qū)豬偽狂犬病病毒的流行情況提供了理論依據。

偽狂犬病毒；PCR；gE基因；豬

偽狂犬病是家畜和野生動物感染偽狂犬病毒（Pseudorabies virus,PrV）后引發(fā)的的一種以發(fā)熱、奇癢（豬除外）和腦脊髓炎為特征的急性傳染病[1]。該病對養(yǎng)豬業(yè)的危害十分嚴重，在豬群多呈爆發(fā)性流行，對妊娠母豬、初生仔豬、育肥豬和種豬均造成嚴重傷害[4,5]。該病目前已成為我國集約化豬場母豬繁殖障礙、仔豬死亡率高的主要病因之一[4,5]，嚴重影響了生產和良種繁育，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經濟損失。但是由于PrV存在潛伏感染和不定期散毒等特點，處于PrV潛伏感染期的豬沒有臨床表現，但可終身帶毒并排毒[2,3]，給該病的有效防治帶來一定困難，因此加強對PrV潛伏感染豬的篩查至關重要[6]。

gE基因是PrV的主要毒力基因，同時也是PrV體外感染和復制的非必需糖蛋白基因[1，7]。研究發(fā)現gE基因的缺失能夠降低病毒的嗜神經毒性，但不影響免疫原性，是研制和開發(fā)PrV基因缺失疫苗的理想靶基因。目前，gE基因缺失弱毒苗的免疫接種已成為偽狂犬病有效防控的重要手段，英國、丹麥、荷蘭、比利時和美國等歐美等發(fā)達國家通過使用該疫苗并結合相應的監(jiān)測技術和管理措施，已基本實現了豬偽狂犬病的凈化[8]。我國自上世紀70年代中期開始廣泛使用gE基因缺失弱毒疫苗，有效減少了偽狂犬病給養(yǎng)豬業(yè)帶來的經濟損失，但該疫苗的使用也給PrV的野毒監(jiān)測帶來一定干擾，迫切需要建立一套敏感特異的能夠鑒別野毒和疫苗株的診斷方法，以保證及時發(fā)現和減少PrV的潛伏感染[9]。

通過對1200多個偽狂犬病野毒株的研究發(fā)現，gE基因普遍存在于這些野毒株中并穩(wěn)定表達，所以gE基因也是鑒別和診斷偽狂犬病毒野毒株和疫苗株的理想基因。目前國內外已經建立了針對gE基因的PCR和核酸探針等分子診斷方法[10]。本文基于gE基因序列特異引物，建立了針對PrV野毒的PCR檢測方法，并對北疆地區(qū)部分規(guī)?；i場的偽狂犬病疑似病料進行了檢測，實現了PrV野毒感染的快速鑒別診斷；在此基礎上對陽性病料的gE基因序列進行了測序分析，為了解目前流行于北疆地區(qū)的偽狂犬病毒基因型，有效預防和控制豬偽狂犬病流行提供了科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料

分別采自新疆石河子(21份)、烏魯木齊（17份）、哈密（15份）、克拉瑪依（15份）、奎屯（12份）和昌吉（12份）等北疆地區(qū)規(guī)?；i場疑似豬偽狂犬病樣組織共96份。豬偽狂犬病毒（PrV）、豬瘟病毒（CSFV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）、豬細小病毒(PPV)陽性病料由石河子大學動物科技學院預防獸醫(yī)實驗室提供。

1.1.2 主要試劑

組織基因組DNA提取試劑盒購自上海捷瑞生物技術有限公司；反轉錄試劑盒、TRIZOL、PGEM-T Easy Vector購自Promega公司；DNA凝膠回收試劑盒、質粒小提試劑盒、Taq DNA聚合酶、10×PCR Buffer、dNTPs、100 bp Ladder Marker購自天根生物公司。

1.2 方法

1.2.1 引物的設計（見表1）

豬偽狂犬病毒gE基因序列特異引物參考文獻[12]設計合成。根據GenBank公布的豬瘟病毒（CSFV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）和豬細小病毒(PPV)基因序列，利用Primer 5.0設計特異性引物并由上海生工合成。

表1 引物序列

1.2.2 病毒DNA和cDNA模板的制備

病毒基因組DNA提?。豪媒M織基因組DNA提取試劑盒分別提取豬偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬細小病毒病料DNA，用微量分光光度計（NanoDrop 2000）測定DNA濃度。

病毒總RNA提取及cDNA合成：利用TRIZOL法分別提取豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒病料RNA，通過1%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。用微量分光光度計（NanoDrop 2000）測定總RNA的OD260和OD280值，計算OD260/OD280比值以鑒定其純度，并進行濃度測算。利用Promega反轉錄試劑盒分別合成cDNA第一鏈。

1.2.3 豬偽狂犬病病毒PCR擴增條件優(yōu)化

在PCR反應體系中，選取DNA模板濃度和引物濃度為變化常量，其他因素不變進行體系的優(yōu)化。PCR反應條件的優(yōu)化主要是通過梯度PCR篩選最適退火溫度。

1.2.4 PCR擴增及目的條帶的回收測序

PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，切膠回收，通過連接、轉化，克隆入pMD18-T載體。通過菌落PCR檢測，挑選陽性重組質粒送交送交北京六合華大基因公司測序，并將測序結果進行分析比對。

1.2.5 PCR敏感性測定

測定所提取病料DNA的含量，進行10-1～10-9的10倍系列稀釋，在擴增條件和擴增體系不變的情況下，分別以不同稀釋度的基因組DNA為模板進行PCR擴增。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物的檢出情況。

1.2.6 PCR特異性測定

利用PCV2、PPV、PRRSV和CSFV特異引物，分別以PCV2、PPV陽性病料基因組DNA和PRRSV、CSFV陽性病料的cDNA為模板，進行PCR擴增，驗證模板DNA特異性。在此基礎上，利用設計的PrV gE基因引物分別對PrV、PCV2、PPV陽性病料的DNA和PRRSV、CSFV陽性病料的cDNA進行PCR擴增，檢測引物的特異性。

2 結 果

2.1 豬偽狂犬病毒PCR擴增條件優(yōu)化

經PCR反應體系和反應條件的摸索和瓊脂糖凝膠電泳檢測，確定最適反應體系為：DNA模板2 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，上下游引物（10 μM）各1 μl，Taq DNA聚合酶（2.5 U/μL）1 μL，滅菌蒸餾水補充至25 μL。最佳反應條件為：95℃預變性5 min；94℃30 s，61℃40 s，72℃30 s，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR擴增得到一條大小為298 bp（圖1）的特異性條帶，與預期大小相符。

圖1 豬偽狂犬病毒gE基因片段的PCR結果

2.2 PCR檢測的敏感性

分別取不同稀釋度的PrV DNA 2 uL，按2.1所述最適反應體系和反應條件進行PCR擴增，結果顯示，以10-1～10-9稀釋的核酸產物作為模板進行PCR,均能擴增出目的條帶（298 bp）,但亮度隨著稀釋倍數的增加而遞減。經測算，gE基因的DNA最低檢出量為0.25 pg(圖2)。

圖2 豬偽狂犬病毒gE基因PCR的敏感性檢測

2.3 PCR檢測的特異性

使用PCV2、PPV、PRRSV和CSFV基因特異引物分別對PCV2、PPV感染病料DNA和PRRSV、CSFV感染病料cDNA進行PCR和測序，結果分別擴增出與預期一致的特異性條帶 （圖3）,其大小分別為424bp、250bp、460bp和325bp，表明這些模板具有特異性。隨后，利用PrV gE基因特異引物分別對PrV、PCV2、PPV陽性病料DNA和PRRSV、CSFV陽性病料的cDNA進行PCR，電泳結果表明除PrV陽性病料DNA中擴增出特異條帶外（圖4），其他均無條帶，引物特異性強。

圖3 PCV2、PPV的DNA和PRRSV、CSF擴增

圖4 PrV、PCV2、PPV的DNA和PRRSV、CSF引物特異性檢驗

2.4 92份疑似豬偽狂犬病樣PCR擴增

利用豬偽狂犬病毒gE基因特異引物對92份疑似豬偽狂犬病樣進行PCR檢測，結果顯示37份為陽性的病料，病料的陽性率分別為40.2%（圖5）。

圖5 疑似豬偽狂犬病樣的PCR檢測

2.5 測序結果與分析

將37份PCR檢測陽性病樣的gE序列的測序結果與NCBI登陸的PrV gE基因序列進行對比，發(fā)現有15份病樣序列存在堿基突變，用DNAMAN軟件對這15個突變序列進行同源性比對，同源性高達98.3%(圖6)，說明從這些來自北疆不同地區(qū)病料中檢測到的PrV仍屬于一個基因型。

圖6 基因序列對比

3 討 論

豬偽狂犬在我國近年來感染趨勢日益嚴重，該病在我國自1947年初次報道以來，在全國常有散發(fā)性的爆發(fā)，給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來了很大的危害，有的地區(qū)出現了豬偽狂犬病毒的變異，給該病的防控帶來了很大的威脅。偽狂犬病病毒的毒力是多基因控制的，目前已經發(fā)現的PrV糖蛋白有gM、gH、gE、gK、gL、gl、gC、gB、gD、gG和gN共11種[11]，不同的蛋白在病毒侵染過程中扮演了不同的角色，其中對病毒增殖來說非必需的糖蛋白有gM、gE、gl、gC和gG蛋白。 gE基因是PrV的主要毒力基因，對PrV在神經系統的侵襲和傳播起重要作用，其編碼的蛋白是病毒復制非必需糖蛋白[7]。由于gE基因在野毒株中能穩(wěn)定表達，其本身變異性不大，不同毒株的gE基因同源性很好，同時目前使用的基因缺失苗中基本不含該基因，因此普遍將gE基因作為PrV野毒鑒別診斷的標記基因。本實驗基于gE基因的PCR方法，用于偽狂犬病野毒的診斷經臨床使用，效果較好。

PCR擴增的特異性與引物密切相關，通常影響擴增效率和目的條帶的擴增。本研究以gE基因的保守序列設計特異性引物，對PCR條件進行優(yōu)化，通過對北疆地區(qū)92份疑似病料組織基因組DNA進行擴增，得到37份陽性病料，同時對PCV2、PPV、PRRSV、CSF進行PCR擴增，結果均為陰性。證明了引物的特異性，同時保證了PCR擴增豬偽狂犬病病毒的可靠性。敏感性高，特異性好、快速簡便的優(yōu)點為PCR檢測技術在病毒疾病的診斷奠定了基礎。在 PrV模板 DNA的制備過程中，傳統的核酸提取方法，操作復雜、周期較長，本試驗應用組織基因DNA提取試劑盒制備的PrV模板DNA，擴增出預期298bp特異性片段。而且在進行敏感性測定時，PCR的最低病毒檢出量約為0.25 pg。

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PCR Detection of Porcine Pseudorabies Virus Wild Strain in the Northern Xinjiang

DOU Li-jing,QI Xiang-tao
(1.Shihezi Veterinary Hygiene Quarantine Office,Shihezi 832003,China; 2.College of Animal Science&Technology,Shihezi University,Shihezi 832003,China.)

In present study,The PCR method focus on Pseudorabies Virus (PrV)wild virus was established based on the specific primers of PrV gE gene sequence.Using this method,92 suspected disease tissue collected from some large scale pig farms in the Northern Xinjiang were detected and the positive rate was 40.2% (37/92).The results show that this method is sensitive and specific,the lowest percentage of detection of PrV is 0.25pg,and can be used for rapid diagnosis and epidemiological investigation of PrV wild virus infection.Furtherly,the gE gene sequences of the PrV positive samples were blasted and analyzed,and the mutations were found in 15 samples.But the homology among the 15 sequences is higher up to 98.3%,which suggest that these wild virus strains still belong to a genetype.The study provide a theoretical basis to understand the epidemic status of the Porcine PrV in the Northern Xinjiang.

pseudorabies virus;PCR;gE gene;pig

S858.26

：A

：1003－6377（2015）05－0049-03

科技部公益性行業(yè)（農業(yè)）科研專項“邊境地區(qū)動物疫病防控技術體系研究”（201103008）

竇立靜（1975-），女，漢族，大學本科，獸醫(yī)師，從事獸醫(yī)臨床檢驗工作。E-mail:dljww1170@sina.com

2015-07-13，

2015-07-20