環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)聯(lián)合結(jié)核分枝桿菌快速培養(yǎng)在涂陰肺結(jié)核中的診斷價值

陶峰　顧超　張齊

[摘要] 目的 探討環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification method，LAMP，新型的核酸擴(kuò)增技術(shù)）聯(lián)合結(jié)核分枝桿菌快速培養(yǎng)（BACTEC MGIT 960，結(jié)核分枝桿菌檢測儀）在痰涂片陰性肺結(jié)核中的診斷價值。 方法 收集疑似肺結(jié)核患者90例，隨機(jī)分成A、B、C組，A組通過指南推薦涂陰肺結(jié)核診斷，B組通過LAMP確診，C組通過LAMP聯(lián)合BACTEC MGIT 960確診，并給予抗結(jié)核治療2個月后隨訪所有入組患者胸部CT變化情況，分別比較涂陰肺結(jié)核診斷方法，LAMP及LAMP聯(lián)合BACTEC MGIT 960的診斷可靠性。 結(jié)果 涂陰肺結(jié)核指南推薦診斷陽性率40.0%，LAMP陽性率53.3%，聯(lián)合檢測陽性率60.0%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。聯(lián)合檢測敏感性88.9%，特異性91.7%均明顯升高。 結(jié)論 在實(shí)際臨床中，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)聯(lián)合結(jié)核分枝桿菌快速培養(yǎng)（BACTEC MGIT 960）在痰涂片陰性肺結(jié)核診斷中特異性及敏感性高。

[關(guān)鍵詞] 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)；BACTEC MGIT 960；涂陰肺結(jié)核；診斷

[中圖分類號] R446.5；R521 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2017）05-0019-04

目前每年結(jié)核病在全球的發(fā)病率仍以1%的速度增長，而結(jié)核分枝桿菌的耐藥性也在增加，中國作為結(jié)核病高發(fā)的國家，應(yīng)該提升結(jié)核病診治技術(shù)，才可提升診治結(jié)核病的效率[1]。然而，在2010年期間，經(jīng)第五次全國結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查，結(jié)果表明2010年15歲以及以上人群中，發(fā)生活動性肺結(jié)核發(fā)病率達(dá)到459/10萬比例，而其中涂陽肺結(jié)核患病發(fā)病率也達(dá)到66/10萬比例[2]。盡管活動性肺結(jié)核及涂陽肺結(jié)核的患病率逐年下降，但是總體下降幅度不大，其中一部分原因是菌陰肺結(jié)核，Singh M等[3]研究結(jié)果表明涂陰肺結(jié)核的接觸者被感染的幾率在7.3%～21.0%，其傳染性低于痰培養(yǎng)陽性的肺結(jié)核。

盡管肺結(jié)核的診斷方法日益增多，針對涂陰肺結(jié)核的診斷標(biāo)準(zhǔn)也越來越多，但是仍缺少特異性、敏感性高的有效診斷方法。目前結(jié)核病診斷研究比較多的主要是LAMP[4]和BACTEC MGIT 960[5]。本研究主要通過比較涂陰肺結(jié)核指南組、LAMP組及LAMP聯(lián)合BACTEC MGIT 960檢測組考慮肺結(jié)核患者抗結(jié)核治療2個月后，所有陽性及陰性疑似肺結(jié)核患者各30例隨訪胸部CT，觀察2個月后所有患者胸部CT病灶變化情況，評價環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)聯(lián)合結(jié)核分枝桿菌快速培養(yǎng)在涂陰肺結(jié)核中的診斷價值。

1 資料與方法

1.1一般資料

2015年1～12月于嘉興市第一醫(yī)院收集符合標(biāo)準(zhǔn)的影像學(xué)疑似肺結(jié)核疾病患者，隨機(jī)從中抽取90例疑似肺結(jié)核疾病患者入組研究。臨床疑似肺結(jié)核疾病患者癥狀包含：出現(xiàn)慢性咳嗽、連續(xù)3周咳痰以及咳痰伴咯血癥狀，胸部CT檢查可見陰影。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）肺部CT或X線檢查疑似肺結(jié)核者；（2）3次痰涂片未見抗酸桿菌者；（3）肺部影像學(xué)異常且有結(jié)核臨床癥狀者；（4）既往無結(jié)核病史者；（5）年齡>16歲；（6）意識清醒者；（7）知情同意者。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）排除肺部疾病已診斷明確者；（2）排除存在影響凝血機(jī)制疾病者，如血友病、尿毒癥、重癥肝炎、血小板<50×109/L等；（3）排除1周內(nèi)使用抗凝藥物者，如低分子肝素、華法令、阿司匹林、氯吡格雷等；（4）排除精神病及神智障礙患者；（5）年齡<16歲者；嚴(yán)重高血壓、3個月內(nèi)心梗患者、嚴(yán)重心肺功能不全者；（6）病情危重不能堅(jiān)持試驗(yàn)過程者。最終納入90例疑似肺結(jié)核患者。90例疑似肺結(jié)核患者隨機(jī)雙盲法分為A組、B組、C組，各30例。A組以指南推薦涂陰結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)診斷，B組通過LAMP診斷，C組通過LAMP聯(lián)合BACTEC MGIT 960診斷疾病。A組患者男15例，女15例，年齡>16歲，平均年齡（38.0±5.2）歲；B組患者男14例，女16例，年齡>16歲，平均年齡（35.0±7.1）歲；C組患者男15例，女15例，年齡>16歲，平均年齡（36.0±6.3）歲；三組患者資料對比不存在統(tǒng)計(jì)差異（P>0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 臨床診斷涂陰肺結(jié)核的標(biāo)準(zhǔn)[6] 臨床診斷中必須具備的診斷指標(biāo)：（1）臨床診斷中，至少在3份痰標(biāo)本的涂片鏡檢中，得出抗酸桿菌為陰性；（2）臨床經(jīng)胸部X線及胸部CT診斷，符合活動性肺結(jié)核病變；（3）在臨床中，排除患其他非結(jié)核性肺部疾??；（4）經(jīng)病理檢查，證實(shí)肺部出現(xiàn)結(jié)核性改變；（5）應(yīng)用支氣管肺泡灌洗液（BALF）檢驗(yàn)，檢出支氣管以及肺部組織含有抗酸桿菌。臨床診斷中的輔助診斷指標(biāo)：（1）對患者在臨床中進(jìn)行結(jié)核菌素（PPD 5TU）皮膚試驗(yàn)，結(jié)果為強(qiáng)陽性；（2）進(jìn)行血清抗結(jié)核抗體檢驗(yàn)，結(jié)果呈陽性；（3）應(yīng)用PCR加探針檢測痰結(jié)核分枝桿菌，結(jié)果呈陽性；（4）對患者進(jìn)行病理檢查，證實(shí)出現(xiàn)肺外組織結(jié)核病變。

1.2.2 LAMP 檢測肺結(jié)核疾病 制備DNA 模板：可以將獲取的患者痰標(biāo)本處理液，轉(zhuǎn)移到1.5 mL EP管內(nèi)。然后，設(shè)置12 000 r/min轉(zhuǎn)速高速離心5 min。之后去除上清液，洗滌2次得到的緩沖液，并加入適量的DNA提取液。最后，將液體混勻后，進(jìn)行沸水浴10 min，再瞬時離心，將得到的上清液轉(zhuǎn)移到另外一只準(zhǔn)備好的EP管中，作為檢驗(yàn)?zāi)０濉?/p>

進(jìn)行LAMP檢測操作：可以根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[7]中的方法，應(yīng)用gyrB基因進(jìn)行檢驗(yàn)，可以選用gyrB內(nèi)6個區(qū)段的4種引物作為本次檢驗(yàn)肺結(jié)核疾病的LAMP引物，主要如下所示：

外引物為：F3：5'-ACCACGGAATACGACTTCGA-3'，B3：5'-AGTGAAAGGTGCGGCTCT-3'；內(nèi)引物為： FIP：5'-GGTCACCCTCTCGTCGGTCAGCAAGAGATGGC-GTTCCTC-3'，BIP：5'-GAAGTGGTCAGCGACGTCGCTAACTTTGTGCGGTGCAGTG-3'。

而在具體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作中，需要嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行檢驗(yàn)。其實(shí)際反應(yīng)體系內(nèi)，可以將dNTP、（NH4）2SO4、MgSO4、KCl、Tris-HCl、甜菜堿、TritionX-100、FIP、BIP、F3以及聚合酶等放置到反應(yīng)管內(nèi)，并加水確?？傄后w為25 μL，在65℃環(huán)境內(nèi)使其反應(yīng)1 h。在反應(yīng)結(jié)束之后，觀察反應(yīng)管的顏色變化。若在實(shí)際中產(chǎn)生特異性片段，則擴(kuò)增產(chǎn)物將會和染料結(jié)合，從而形成綠色熒光，反之，反應(yīng)管顏色仍為橙色，并不會發(fā)生顏色變化。

1.2.3 BACTEC MGIT 960儀器 檢驗(yàn)中應(yīng)用BACTEC MGIT 960 全自動儀器（美國 BD 公司）。配套試劑：MGIT OADC營養(yǎng)添加劑、MGIT培養(yǎng)管、PANTA雜菌抑制劑。具體檢測方法：在無菌條件下，將MGITPANTA/OADC混合液（0.8 mL）加入MGIT培養(yǎng)管內(nèi)備用。送檢標(biāo)本進(jìn)行常規(guī)去污染濃縮處理之后，將送檢標(biāo)本接種到12B培養(yǎng)瓶與MGIT培養(yǎng)管中，并將MGIT培養(yǎng)管置入BACTEC MGIT 960儀器內(nèi)培育。若有陽性標(biāo)本，則儀器的紅色指示燈將會閃亮且伴有報(bào)警提示音。此時，可以按儀器的提示步驟，依次取出陽性標(biāo)本。將陽性標(biāo)本從培養(yǎng)管內(nèi)取出，直接對陽性標(biāo)本涂片進(jìn)行抗酸染色，培養(yǎng)6周，以確定陽性標(biāo)本是否是分枝桿菌。

1.2.4 診斷結(jié)果 針對最終的診斷結(jié)果，對肺結(jié)核患者治療2個月后，隨訪進(jìn)行胸部CT，從而考慮明確給出診斷結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SSPS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件計(jì)算，計(jì)數(shù)資料以率%表示，采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1不同方法臨床診斷結(jié)果比較

傳統(tǒng)涂陰肺結(jié)核診斷方法符合涂陰肺結(jié)核陽性率40.0%（12/30），1例經(jīng)BALF檢出抗酸分枝桿菌，1例肺穿刺病理符合，10例通過診斷標(biāo)準(zhǔn)符合涂陰肺結(jié)核診斷，12例患者均給予抗結(jié)核治療，所有患者2個月后隨訪胸部CT，胸部CT病灶吸收9例。LAMP檢測法檢測陽性率53.3%（16/30），最終胸部CT吸收13例。LAMP聯(lián)合BACTEC MGIT 960檢測陽性率60.0%（18/30），最終胸部吸收16例。

2.2三種方法陽性率比較

見表1。LAMP聯(lián)合BACTEC MGIT 960診斷涂陰肺結(jié)核檢測陽性率高于單獨(dú)LAMP檢測，高于涂陰肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)診斷的陽性率，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。考慮本研究收集病例數(shù)較少，因此差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，如果加大樣本量，統(tǒng)計(jì)學(xué)可能有差異。

2.3三種方法敏感性和特異性比較

見表2。LAMP聯(lián)合BACTEC MGIT 960診斷涂陰肺結(jié)核的敏感性和特異性均高于LAMP及涂陰肺結(jié)核診斷指南。聯(lián)合診斷減少了假陰性及假陽性的結(jié)果，有利于涂陰肺結(jié)核的診斷。

2.4 檢測及治療過程中不良反應(yīng)

三種方法檢測過程中未見明顯不良反應(yīng)，患者均能耐受。BACTEC MGIT 960在本研究未見污染標(biāo)本出現(xiàn)。抗結(jié)核治療患者5例出現(xiàn)肝功能損失，3例出現(xiàn)消化道癥狀，但給予對癥處理后癥狀均好轉(zhuǎn)，其余患者均能耐受。

3討論

在我國臨床疾病檢測中，一直都將結(jié)核病列為重大傳染病檢測范圍，并且也充分認(rèn)識到該病的危害，強(qiáng)化臨床疾病檢測工作，可早診斷、早治療呼吸道結(jié)核病。盡管近年來傳染性肺結(jié)核患病率下降明顯，但是涂陰肺結(jié)核發(fā)病率明顯升高。在Cowie等[8]研究中，針對隨機(jī)抽取的152例結(jié)核病患者研究發(fā)現(xiàn)，在患者肺尖部有活動性結(jié)核病變，對患者進(jìn)行結(jié)核菌素試驗(yàn)以及痰液涂片直接檢查，得出針對被觀察152例患者中，在未來的65個月內(nèi)將會有88例患者發(fā)展成陽性肺結(jié)核。因此如何有效診斷涂陰肺結(jié)核將對結(jié)核病的防治起到關(guān)鍵的作用。

目前涂陰肺結(jié)核傳統(tǒng)診斷方法存在敏感性、特異性低的缺陷，改良羅氏培養(yǎng)方法更加可靠，但臨床檢測疾病的陽性率低[9-13]。而在許家璉等[14]研究中指出，改良羅氏培養(yǎng)方法在檢測涂陰肺結(jié)核中，其陽性檢出率是12.86%，且耗時長，往往需2個月之久。BACTEC MGIT 960 檢測系統(tǒng)能將報(bào)告時間縮短。也有相關(guān)報(bào)道中指出，在BACTEC MGIT 960 檢測中，可將非結(jié)核桿菌陽性檢出率的時間縮短到7 d以內(nèi)，并且還可以使分離培養(yǎng)得出的陽性檢測結(jié)果比常規(guī)培養(yǎng)檢出率高出10%。彭亦平等[15]研究發(fā)現(xiàn)初治涂陰培陽率13.78%。而林健雄等[16]研究發(fā)現(xiàn)BACTEC MGIT 960檢測結(jié)核分枝桿菌痰標(biāo)本陽性率54.02%，而本研究陽性率60.0%，考慮本研究通過嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)納入疑似涂陰肺結(jié)核患者，故陽性率有差異。

在1989年期間，Hanee首次報(bào)道指出，臨床中可以應(yīng)用PCR檢測觀察結(jié)核分枝桿菌，從而Hanee開創(chuàng)應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)在臨床中診斷結(jié)核病的新起點(diǎn)，缺點(diǎn)是由于探針技術(shù)等操作程序比較復(fù)雜、費(fèi)用較貴。近年來因環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增LAMP診斷技術(shù)的出現(xiàn)，給疑似疾病患者早期診斷帶來新的曙光。這是一種新的基因診斷技術(shù)，它具有簡單、快速、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。江勇等[17]報(bào)道LAMP法的靈敏度為92.9%，特異性為98.0%，陽性預(yù)測值為94.5%。劉毅等[18]報(bào)道LAMP敏感性92.16%，特異性87.14%。而本研究LAMP敏感性為81.3%，特異性為78.6%，考慮本研究主要檢測涂陰患者，故其敏感性等指標(biāo)較江勇[17]及劉毅等[18]研究的指標(biāo)低。

同時本研究聯(lián)合LAMP及BACTEC MGIT 960方法檢測，其陽性率、敏感性及特異性均高于傳統(tǒng)指南方法診斷及單獨(dú)LAMP檢測[19-21]。因此兩者聯(lián)合有利于涂陰肺結(jié)核的檢測，同時指導(dǎo)抗結(jié)核用藥，有利于治療和預(yù)防。兩種方法聯(lián)合檢測對結(jié)核病的診斷和防治有著極其重要的意義，值得臨床推廣。目前本研究的樣本例數(shù)較少，三組陽性率比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，有待加大樣本量，提高數(shù)據(jù)可靠性。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 弭鳳玲，王黎霞，李亮.中國全球基金耐多藥結(jié)核病項(xiàng)日階段性實(shí)施結(jié)果分析[J].中國防癆雜志，2010，32（11）：700-740.

[2] 王黎霞，成詩明，陳明亭，等. 2010年全國第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報(bào)告[J].中國防癆雜志，2012，34（6）：7-30.

[3] Singh M，Mynak ML，Kumar L，et al.Prevalence and risk factors for transmission of infection among children in household contact with adults having pulmonary tuberculosis[J].Arch Dis Child，2005，90（15）：624-628.

[4] Notomi T，Okayama H，Masubuchi H，et al.Loop-mediated isothermal amplification of DNA[J].Nucleic Acids Res，2000，28（12）：E63.

[5] 郭新枝，陳裕，于永敏，等.痰液BACTEC-MGIT 960快速結(jié)核菌培養(yǎng)對菌陰肺結(jié)核的臨床診斷價值[J].中國藥物與臨床，2013，13（2）：201-202.

[6] 中華人民共和國衛(wèi)生部疾病控制司. 初治涂陰活動性肺結(jié)核病人免費(fèi)治療管理指南[J].中華結(jié)核和呼吸雜志，2005，28（10）： 667-669.

[7] IwamotoT，Sonobe T，Hayashi K.Loop-mediated isothermal amplification for direct detection of Mycobacterium tuberculosis complex，M.avium and M.int racel lulare in sputum samples[J].J Clin Microbiol，2003，41（6）：2616-2622.

[8] Cowie RL，Langton ME，Escreet BC. Diagnosis of sputum smear-and sputum culture-negative pulmonary tuberculosis[J]. S Afr Med J，1985，68（12）：878.

[9] Zar HJ，Workman LJ，Little F，et al.Diagnosis of pulmonary tuberculosis in children：Assessment of the 2012 National Institutes of Health Expert Consensus Criteria[J].Clinical Infectious Diseases，2015，61（suppl 3）：S173-S178.

[10] Huang JY，Jian ZH，Nfor ON，et al.The Impact of coexisting asthma，chronic obstructive pulmonary disease and tuberculosis on survival in patients with lung squamous cell carcinoma[J]. Plos One，2015，10（7）：e0133367.

[11] Kumar NP，Sridhar R，Hanna LE，et al.Decreased frequencies of circulating CD4+ T follicular helper cells associated with diminished plasma IL-21 in active pulmonary tuberculosis[J]. Plos One，2014，9（10）：e111098.

[12] Jindani Amina，Harrison Thomas S，Nunn Andrew J，et al.High-dose rifapentine with moxifloxacin for pulmonary tuberculosis[J]. New England Journal of Medicine，2014， 371（17）：1599-1608.

[13] Robson SC，White NW，Aronson I，et al.Acute-phase response and the hypercoagulable state in pulmonary tuberculosis[J]. British Journal of Haematology，2015，93（4）：943-949.

[14] 許家璉，梅琪.菌陰肺結(jié)核的臨床診斷探討[J].上海預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，1998，10：455-456.

[15] 彭亦平，譚彩萍，熊國亮.BACTEC MGIT 960快速培養(yǎng)及藥敏在肺結(jié)核診治中的應(yīng)用評價[J].江西醫(yī)藥，2016， 51（1）：21-30.

[16] 林健雄，王冬敏，陳秉熙，等.BACTECMGIT-960快速檢測分枝桿菌的臨床應(yīng)用研究[J]. 齊魯醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)，2005， 16（3）：6-8.

[17] 江勇，錢明.環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增對肺結(jié)核快速診斷的分析研究[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2013，29（12）：3818-3820.

[18] 劉毅，黃曙海，譚慧媚.環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測肺結(jié)核患者痰標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌[J]. 臨床檢驗(yàn)雜志，2012， 30（1）：24-26.

[19] 孫雯雯，肖和平.環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)早期診斷結(jié)核性腦膜炎的研究[J].中國防癆雜志，2016，38（12）：1102-1108.

[20] 李金莉，王峰，彭毅，等.環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測痰樣結(jié)核分枝桿菌臨床價值評價[J].中國防癆雜志，2015，37（2）：134-139.

[21] 歐喜超，夏輝，李強(qiáng)，等.快速核酸提取環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測技術(shù)在肺結(jié)核診斷中的應(yīng)用評價[J].中國防癆雜志，2016，38（5）：393-397.

（收稿日期：2016-12-17）