分子標(biāo)記在油茶研究中的應(yīng)用

董斌李榮喜黃永芳洪文泓譚莎

（1. 廣東農(nóng)工商職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣州 510507；2. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，廣州 510642）

分子標(biāo)記在油茶研究中的應(yīng)用

董斌1，2李榮喜1黃永芳2洪文泓2譚莎2

（1. 廣東農(nóng)工商職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣州 510507；2. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，廣州 510642）

近年來，分子標(biāo)記技術(shù)發(fā)展快速，其在油茶研究中的應(yīng)用也越來越廣泛。由于分子標(biāo)記具有高效、可靠等諸多優(yōu)點(diǎn)，它的快速發(fā)展為油茶開展遺傳多樣性分析、品種鑒定、優(yōu)良基因定位、分子輔助育種、遺傳圖譜構(gòu)建等方面研究提供了一條快速有效的途徑。綜述了RAPD、AFLP、SSR、ISSR和SRAP等幾種分子標(biāo)記在油茶研究中的應(yīng)用，并在此基礎(chǔ)上分析了分子標(biāo)記在油茶研究中存在的問題和今后研究工作的重點(diǎn)。

分子標(biāo)記；油茶；遺傳多樣性；基因定位；分子輔助育種

油茶（Camellia oleifera）為山茶科山茶屬植物，與油棕（Elaeis guineensis）、油橄欖（Olea europaea）、椰子（Cocos nucifera）并稱為世界“四大木本油料植物”，是我國(guó)南方主要的木本食用油料樹種。茶油脂肪酸主要由油酸、亞油酸和少量的飽和脂肪酸組成，并含有多種功能性成分，對(duì)于維持心血管系統(tǒng)功能，提高人體免疫力，降低膽固醇，預(yù)防和治療高血壓具有明顯功效［1］。此外，油茶全身都是寶，其副產(chǎn)品在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥等方面均具有較大經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

我國(guó)是油茶的原產(chǎn)地，栽培歷史悠久。廣義的油茶指山茶屬（Camellia）植物中含油率較高、且有一定栽培面積的樹種，我國(guó)主要栽培有油茶、小果油茶（Camellia meiocarpa）、攸縣油茶（Camellia yuhsienensis）、浙江紅花油茶（Camellia chekiangoleosa）和騰沖紅花油茶（Camellia reticulata）等［2］。據(jù)《三農(nóng)記》清張宗法（1700年）引證《山海經(jīng)》緒書：“員木，南方油食也”。“員木”即油茶，可見我國(guó)取油茶果榨油以供食用，已有2300多年的歷史［3］。油茶經(jīng)過了長(zhǎng)期的自然及人工選擇，形成了豐富的種質(zhì)資源。近年來，科研單位不斷加大對(duì)油茶優(yōu)良品種的選育力度，一些新品種、優(yōu)良無性系不斷出現(xiàn)，隨著各地區(qū)間的引種栽培，各地區(qū)各優(yōu)良無性系間的不斷雜交，導(dǎo)致形態(tài)學(xué)差異越來越小，給油茶種質(zhì)資源的分類研究帶來諸多不便，進(jìn)一步影響了油茶的良種選育。生物技術(shù)的快速發(fā)展，尤其是分子標(biāo)記的廣泛應(yīng)用為進(jìn)一步開展油茶種質(zhì)資源鑒定及良種選育提供了極大的幫助。分子標(biāo)記是利用限制性內(nèi)切酶酶切及凝膠電泳分離不同生物體的DNA分子，再經(jīng)過特異探針雜交，通過同位素顯色技術(shù)揭示生物多樣性的方法。自從1974年Grodzicker創(chuàng)立RFLP技術(shù)以來［4］，分子標(biāo)記發(fā)展迅速，包括：RAPD、RFLP、AFLP、SSR、ISSR、SRAP等技術(shù)不斷面世。本文對(duì)近幾年在油茶研究中使用較多的幾種分子標(biāo)記進(jìn)行綜述和討論，以期為該技術(shù)在油茶中的進(jìn)一步研究做一些歸納性的基礎(chǔ)工作。

1 分子標(biāo)記在油茶研究中的應(yīng)用

1.1 油茶RAPD標(biāo)記的應(yīng)用

1990年，Williams等和Welsh等對(duì)一種較為簡(jiǎn)便的檢測(cè)DNA多態(tài)性技術(shù)［5，6］做了報(bào)道，即隨機(jī)引物PCR（Random amplified polymorphic DNA，RAPD）技術(shù)，它能快速、簡(jiǎn)便而且準(zhǔn)確地檢測(cè)DNA 的多態(tài)性。RAPD 技術(shù)與其他分子標(biāo)記技術(shù)相比，其原理簡(jiǎn)單、操作容易、成本較低，直接揭示DNA水平上的差異。但隨著分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，其為顯性標(biāo)記、重復(fù)性較差、擴(kuò)增條帶有限、可靠性較差等缺點(diǎn)逐漸顯現(xiàn)［7］，更多的研究需要通過形態(tài)數(shù)據(jù)分析和其他檢測(cè)手段互相驗(yàn)證［8，9］。

黃永芳等［10，11］、張?jiān)频龋?2］、闕生全等［13］分別提出了油茶RAPD反應(yīng)體系優(yōu)化方案。陳永忠等［14］利用22個(gè)隨機(jī)引物對(duì)13個(gè)油茶優(yōu)良無性系進(jìn)行RAPD分析，確定了油茶品種間存在較大差異，并以此為基礎(chǔ)建立油茶優(yōu)良無性系的RAPD分子鑒別體系。張?jiān)频龋?5］對(duì)油茶32個(gè)品系及10個(gè)龍眼茶農(nóng)家品種開展遺傳多樣性分析及性狀比較發(fā)現(xiàn)，油茶果含油率可能與RAPD標(biāo)記的某些基因有連鎖關(guān)系，但各品系的單株結(jié)實(shí)量與RAPD標(biāo)記間無明顯相關(guān)。陳永忠等［16］在對(duì)油茶雄性不育優(yōu)良無性系選育研究中，通過RAPD技術(shù)證明了油茶雄性不育系與普通油茶的遺傳距離較遠(yuǎn)。譚曉風(fēng)等［17］利用RAPD分子技術(shù)對(duì)山茶屬油茶組植物進(jìn)行了分子分類發(fā)現(xiàn)，油茶、狹葉油茶（Camellia lanceoleosa）和越南油茶（Camellia vietnamensis）親緣關(guān)系最近，與高州油茶（Camellia gauchwensis）相對(duì)也較近，而茶梅（Camellia sasanqua）則與各種間的遺傳距離最大，結(jié)果與形態(tài)分類學(xué)一致。黃永芳等［18］利用RAPD標(biāo)記技術(shù)分析了90份油茶種質(zhì)的遺傳多樣性發(fā)現(xiàn)，無性系間存在豐富的遺傳多樣性的同時(shí)，還初步定位了與抗病性、果油率和產(chǎn)油量數(shù)量性狀相關(guān)的譜帶。

總體來說，RAPD標(biāo)記技術(shù)是在制作基因圖譜，植物種質(zhì)資源研究，分類學(xué)研究及系統(tǒng)發(fā)育與演化的強(qiáng)大技術(shù)［19］，也是20世紀(jì)90年代中后期至21世紀(jì)前5年在油茶遺傳多樣性研究中應(yīng)用較多的分子鑒定手段，但近年來逐步被其他分子標(biāo)記技術(shù)所取代。

1.2 油茶AFLP標(biāo)記的應(yīng)用

擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（Amplified fragment length polymorphism，AFLP），是1993年由荷蘭Keygene公司的科學(xué)家Zabeau和Vos創(chuàng)建發(fā)展的一種DNA分子標(biāo)記技術(shù)［21］。AFLP結(jié)合了RFLP技術(shù)和RAPD技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，具有DNA用量少，重復(fù)性好，精確度較高，多態(tài)性豐富，引物通用等優(yōu)點(diǎn)。同時(shí)，它屬于對(duì)基因組DNA進(jìn)行分析的高通量分子標(biāo)記，可以在全基因組范圍內(nèi)對(duì)多個(gè)不同的遺傳位點(diǎn)同時(shí)進(jìn)行變異分析［22］，廣泛應(yīng)用于遺傳變異及基因流動(dòng)方面的研究［23］。

張婷等［24］對(duì)湖北省5個(gè)地區(qū)油茶的遺傳多樣性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)、不同居群間遺傳多樣性水平相差較大，油茶遺傳分化主要存在于居群內(nèi)，油茶群體存在相對(duì)隔離的情況。金龍等［25］對(duì)安徽油茶基地23個(gè)健康植株進(jìn)行AFLP分析，再次印證了油茶具有較高遺傳多樣性的同時(shí)，也表明AFLP標(biāo)記技術(shù)在油茶遺傳多樣性研究的適用性。馮金玲等［26］探討油茶芽苗砧嫁接體愈合過程中嫁接口和接穗是否發(fā)生基因變化發(fā)現(xiàn)，在接穗母樹、接穗萌發(fā)芽和砧木中有DNA特異條帶的出現(xiàn)。

但是AFLP反應(yīng)步驟多、過程復(fù)雜、影響因素多，很多實(shí)驗(yàn)室因不同的原因難以得到理想的結(jié)果，導(dǎo)致該技術(shù)在油茶研究中較少見報(bào)。近年來，越來越多針對(duì)AFLP反應(yīng)體系構(gòu)建的研究突破，如：黃永芳等［27］用成熟葉片為材料成功提取了高質(zhì)量的DNA，打破了對(duì)僅能用幼嫩葉片作為提取材料的限制。張婷等［28］，金龍等［25］也分別構(gòu)建了適于油茶AFLP分析的反應(yīng)體系。隨著相關(guān)技術(shù)的進(jìn)一步成熟，AFLP標(biāo)記技術(shù)在油茶中的應(yīng)用將會(huì)增多。

1.3 油茶SSR標(biāo)記的應(yīng)用

簡(jiǎn)單重復(fù)序列（Simple sequence repeat，SSR），是于1991年由Moore等創(chuàng)立的分子標(biāo)記技術(shù)之一，該分子標(biāo)記是共顯性標(biāo)記，具有單基因座、等位基因變異多、多態(tài)性豐富、信息量大、操作簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性好、種族特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，當(dāng)前在植物育種、指紋數(shù)據(jù)庫構(gòu)建、品種鑒定等方面得到廣泛應(yīng)用。

SSR技術(shù)在油茶研究中應(yīng)用暫不多見。彭嬋等［29］利用SSR技術(shù)對(duì)湖北省油茶種質(zhì)資源進(jìn)行分析，結(jié)果證明同一地區(qū)的油茶品種相對(duì)外地品種具有較近的親緣關(guān)系，且各品種間存在一定的差異。黃勇［30］應(yīng)用SSR標(biāo)記技術(shù)對(duì)小果油茶和普通油茶的5個(gè)同域分布區(qū)的10個(gè)居群復(fù)合體進(jìn)行居群遺傳結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果顯示小果油茶和普通油茶之間的親緣關(guān)系非常接近，存在著因雜交而產(chǎn)生的基因漸滲。

傳統(tǒng)開發(fā)SSR標(biāo)記方法投入大，工作繁瑣，獲得SSR陽性克隆的機(jī)率很低，成功獲得引物的機(jī)率則更低［31］。雖然范小寧等和劉冰等［32，33］均對(duì)油茶SSR技術(shù)的反應(yīng)體系進(jìn)行了優(yōu)化，但總的來說，由于SSR標(biāo)記要預(yù)先獲得序列信息，導(dǎo)致該技術(shù)的應(yīng)用受到較大限制。在油茶的研究中，主要還是用SSR技術(shù)進(jìn)行隨機(jī)標(biāo)記，還未發(fā)現(xiàn)有相關(guān)研究利用油茶的特異SSR標(biāo)記進(jìn)行油茶種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析。

1.4 油茶ISSR標(biāo)記的應(yīng)用

簡(jiǎn)單重復(fù)間序列標(biāo)記（Inter-simple sequence repeat，ISSR），是由加拿大Zietkiewicz等［34］在1994年提出的一種利用PCR擴(kuò)增進(jìn)行檢測(cè)的分子標(biāo)記研究技術(shù)。ISSR具有簡(jiǎn)便、快捷、結(jié)果穩(wěn)定、DNA用量少和DNA多態(tài)性高等優(yōu)點(diǎn)［35］，不需要繁瑣地進(jìn)行基因文庫構(gòu)建、雜交和同位素顯示等步驟，重復(fù)序列和錨定堿基的選擇是隨機(jī)的，無需知道任何靶標(biāo)序列的SSR背景信息。但I(xiàn)SSR技術(shù)呈孟德爾式遺傳，即顯性遺傳標(biāo)記，不能區(qū)分顯性純合基因型和雜合基因型。

關(guān)于油茶ISSR技術(shù)還是集中在遺傳多樣性及親緣關(guān)系方面。張國(guó)武等［36］采用ISSR分子標(biāo)記，對(duì)我國(guó)南方10個(gè)油茶優(yōu)良無性系進(jìn)行了遺傳多樣性分析，結(jié)果顯示油茶品種間存在較大遺傳差異，并準(zhǔn)確地對(duì)各無性系進(jìn)行了分子鑒別。溫強(qiáng)等［37］采用ISSR分子標(biāo)記方法，對(duì)江西25個(gè)產(chǎn)量達(dá)到750 kg/hm2的油茶無性系進(jìn)行分子鑒別研究，顯示各無性系遺傳背景復(fù)雜。于小玉等［38］利用ISSR技術(shù)針對(duì)湖北湖南主要油茶品種，代惠萍等［39，40］針對(duì)秦巴山區(qū)的油茶品種，王保明等［41］針對(duì)湘林系列、岑軟系列等無性系，彭繼慶等［42］針對(duì)博白大果油茶（Camellia gigantocarpa）天然種群和人工種群的研究均能鑒定其親緣關(guān)系并得到品種、無性系間遺傳多樣性豐富的類似的結(jié)果。此外，應(yīng)用ISSR技術(shù)關(guān)于油茶分類及鑒定的研究也有見報(bào)，劉海龍等［43］對(duì)11份山茶屬植物進(jìn)行測(cè)定，成功區(qū)分了5個(gè)普通油茶無性系，同時(shí)為香花油茶（Camellia osmantha）分類地位的確認(rèn)提供一定的參考。

關(guān)于油茶ISSR分子標(biāo)記反應(yīng)體系的篩選及條件優(yōu)化也獲得一定突破［44-46］，相關(guān)研究將進(jìn)一步拓展ISSR技術(shù)在油茶中的應(yīng)用，為油茶的分子輔助育種奠定良好的基礎(chǔ)。

1.5 油茶SRAP標(biāo)記的應(yīng)用

相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性分子標(biāo)記（Sequence-related amplified polymorphism，SRAP），是由Li博士和Quiros博士［47］于2001年創(chuàng)立的一種利用PCR擴(kuò)增進(jìn)行檢測(cè)的分子標(biāo)記研究技術(shù)。SRAP具有多態(tài)性高、操作簡(jiǎn)便、中等產(chǎn)量、高共顯性、低成本、重復(fù)性高、易于分離條帶及測(cè)序等優(yōu)點(diǎn)［48］，可以同時(shí)對(duì)外顯子、內(nèi)含子和啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行特異性擴(kuò)增［49］?；谟筒鑃RAP分子反應(yīng)體系的研究成果不斷見報(bào)［50-54］，為該技術(shù)在油茶研究中的進(jìn)一步推廣奠定了基礎(chǔ)。

王鵬良等［55］利用SRAP技術(shù)對(duì)岑軟3號(hào)油茶組培苗進(jìn)行分子檢測(cè)，表明在以芽繁芽的組織培養(yǎng)體系中具有較好的遺傳穩(wěn)定性。范小寧等［56］對(duì)4個(gè)控制授粉家系的子代遺傳多樣性進(jìn)行分析，提出雜交育種培育油茶新品種時(shí)應(yīng)以雜交后代個(gè)體選擇為主，優(yōu)良家系選擇對(duì)油茶產(chǎn)量提升的潛力較小。黃勇、楊揚(yáng)等［57，58］利用SRAP技術(shù)對(duì)全國(guó)19個(gè)小果油茶居群進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)小果油茶的遺傳多樣性在居群和物種2個(gè)層次上均較為豐富，不同居群間存在較為頻繁的基因流動(dòng)，遺傳變異主要來自局群內(nèi)。此外，彭邵鋒等［59］對(duì)全國(guó)14個(gè)油茶高產(chǎn)良種進(jìn)行遺傳多樣性分析，林萍等［60］對(duì)油茶長(zhǎng)林系列的研究及韓欣等［61］對(duì)贛南油茶良種的研究更進(jìn)一步地建立了該類油茶良種的分子鑒別體系。

近年來，SRAP分子標(biāo)記雖在油茶研究中廣泛應(yīng)用，為油茶遺傳多樣性及遺傳穩(wěn)定性的鑒定提供了良好的分析手段，但可應(yīng)用于油茶優(yōu)良種質(zhì)分子鑒別研究的SRAP引物較少，且該技術(shù)的穩(wěn)定性仍需進(jìn)一步提高［61］。

2 存在的問題

油茶屬異花授粉植物，在我國(guó)分布范圍較廣泛，在長(zhǎng)期的自然生長(zhǎng)和人工選擇下，不同區(qū)域、不同品種、甚至不同近緣種之間不斷雜交，導(dǎo)致種內(nèi)變異極其豐富，遺傳背景非常復(fù)雜，多種分子標(biāo)記均驗(yàn)證了這種現(xiàn)象。雖然DNA分子標(biāo)記技術(shù)在油茶品種及近緣種鑒定、遺傳多樣性、親緣關(guān)系等研究中取得了不少成果，展現(xiàn)了廣闊的應(yīng)用前景，但是仍然存在一些不足：（1）當(dāng)前分子標(biāo)記主要開展針對(duì)油茶遺傳多樣性和遺傳距離的研究，與性狀連鎖開展的研究較少見報(bào)。（2）在已廣泛應(yīng)用的RAPD、ISSR等分子標(biāo)記技術(shù)只能作為診斷性的分子標(biāo)記初步定位出與部分性狀相關(guān)的譜帶，雖然越來越多的特異性譜片段被標(biāo)記出來，但幾種分子標(biāo)記技術(shù)均未能對(duì)目的基因精確定位和有效分離，難以直接應(yīng)用在實(shí)際生產(chǎn)中。（3）當(dāng)前分子標(biāo)記的研究并未能較好地參與到油茶遺傳圖譜的構(gòu)建，遺傳圖譜的不完善延緩了相關(guān)功能基因的發(fā)現(xiàn)。（4）現(xiàn)有的研究較少采取多種分子標(biāo)記綜合應(yīng)用，與形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)以及其他的一些生物技術(shù)手段綜合評(píng)價(jià)較少開展。（5）在油茶的遺傳育種中，分子標(biāo)記育種與常規(guī)育種還未能很好結(jié)合，大多數(shù)分子標(biāo)記仍停留在實(shí)驗(yàn)室階段，在實(shí)際育種過程中僅僅作為一種輔助育種的工具。

3 展望

未來的研究，應(yīng)進(jìn)一步加大對(duì)油茶豐產(chǎn)、高油、抗病蟲害、抗逆境脅迫等方面相關(guān)的功能基因挖掘和利用的力度。充分應(yīng)用分子標(biāo)記技術(shù)鑒別并分離與重要農(nóng)藝性狀相關(guān)的特殊基因，獲得與其緊密連鎖的分子標(biāo)記，加快在分子輔助育種上的應(yīng)用進(jìn)程［62］；同時(shí)，應(yīng)進(jìn)一步開發(fā)和利用永久性群體所構(gòu)建高密度遺傳圖譜，對(duì)其重要性狀進(jìn)行準(zhǔn)確QTL定位［63］，加強(qiáng)與實(shí)際生產(chǎn)的聯(lián)系。近年來，油茶cDNA文庫［64］、EST文庫［65，66］，轉(zhuǎn)錄組［67，68］，葉綠體基因組［69］等逐步構(gòu)建，這些標(biāo)志性成果將油茶分子生物學(xué)的研究推向新的高度?？梢灶A(yù)見在不久的將來，針對(duì)油茶基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)及蛋白組學(xué)的研究將是油茶分子生物學(xué)新的熱點(diǎn)。此外，油茶全基因組測(cè)序也必將被公布，隨著核酸序列數(shù)據(jù)庫等資源的公共化和各組學(xué)的深入研究，利用相關(guān)資源開發(fā)出更為直接有效的分子標(biāo)記技術(shù)，諸如已在相應(yīng)植物研究中陸續(xù)取得成功的cDNA-AFLP［70，71］、cDNA-SRAP［72］和EST-SSR［73］等，這類新型分子標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用必將極大推動(dòng)油茶各方面的研究。同時(shí)，還應(yīng)借助生物信息學(xué)等手段開展與茶（Camellia sinensis）、山茶（Camellia japonica）等近緣種核酸序列數(shù)據(jù)庫等資源的比對(duì)，此舉必將獲得大量與重要農(nóng)藝性狀相關(guān)的功能基因，定位也將越來越精確。屆時(shí)，油茶分子標(biāo)記輔助育種將會(huì)得到更快速發(fā)展，從而為選育綜合性狀優(yōu)良的油茶新品種提供更加有力的支持。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Application of Molecular Markers in Studies of Camellia oleifera

Dong Bin1，2Li Rongxi1Huang Yongfang2Hong Wenhong2Tan Sha2
（1. Guangdong Agriculture Industry Business Polytechnic College，Guangzhou 510507；2. South China Agricultural University，Guangzhou 510642）

Recently the molecular marker techniques develop rapidly and are widely used in studies of Camellia oleifera. Owing to advantages of high-efficiency and reliability with molecular marker technique， its rapid development offers fast and efficient measure in genetic diversity analysis， cultivar identification， valuable gene mapping， molecular marker-assisted selection and the construction of molecular gen etic maps. The applications of several molecular marker techniques， i.e.， RAPD， AFLP， SSR， ISSR and SRAP etc. in studying C. oleifera are reviewed. The current problems and the focuses in the future researches are also discussed while utilizing the molecular marker in studying C. oleifera.

molecular marker；Camellia oleifera；genetic diversity；gene mapping；molecular marker-assisted selection

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.06.011

2014-09-29

廣東省林業(yè)科技創(chuàng)新專項(xiàng)資金項(xiàng)目（2011KJCX014-01），廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2011B0203003）

董斌，男，碩士，講師，研究方向：園林植物及經(jīng)濟(jì)林的科研與教學(xué)；E-mail：bbeenn@163.com

黃永芳，女，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：經(jīng)濟(jì)林及森林培育的科研和教學(xué)；E-mail：hyfang@scau.edu.cn