微生物蛋白質(zhì)組學(xué)的研究進(jìn)展

聶 麗，邵正英，魏賽金

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，江西 南昌 330045）

目前，研究蛋白質(zhì)組學(xué)已經(jīng)成為生命科學(xué)的熱點(diǎn)和焦點(diǎn)，開展蛋白質(zhì)組研究對生命科學(xué)研究進(jìn)入后 基因時代具有跨時代的意義，也是后基因時代中生命科學(xué)研究的核心要素。蛋白質(zhì)組（proteome）一詞 最早在1994年由澳大利亞科學(xué)家 Wilkins等[1]提 出的，意指一個組織或細(xì)胞中的全部蛋白質(zhì)由基因組表達(dá)。蛋白質(zhì)組學(xué)（proteomics）是從整體動力學(xué)角度分析細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)修改狀態(tài)、表達(dá)水平來了解蛋白質(zhì)之間的相互作用，從而揭示細(xì)胞的活動規(guī)律及蛋白質(zhì)功能。

1 蛋白質(zhì)組學(xué)的分類

根據(jù)研究目的和手段的不同，蛋白質(zhì)組學(xué)可分為組成性蛋白組學(xué)、比較蛋白組學(xué)和相互作用蛋白質(zhì) 組學(xué)[2]。組成性蛋白質(zhì)組學(xué)是鑒定并詳細(xì)闡述某個體系中蛋白質(zhì)翻譯后修飾的各種特性；Ohta等[3]用定 量蛋白組學(xué)描述了 4 000 蛋白質(zhì)識別孤立的有絲分裂染色體。比較蛋白質(zhì)組學(xué)即差異顯示蛋白質(zhì)組學(xué)，是以人類重大疾病或以重要生命過程為主要研究對象，進(jìn)行病理和生理體系或蛋白質(zhì)在過程中的差異表達(dá)；Hamler等[4]應(yīng) 用二維液相分離結(jié)合質(zhì)譜鑒定的路線比較了乳腺癌上皮細(xì)胞與正常乳腺上皮細(xì)胞間蛋 白質(zhì)間的差異表達(dá)。蛋 白質(zhì)組學(xué)的相互作用是應(yīng)用各種先進(jìn)技術(shù)對蛋白質(zhì)間的相互作用進(jìn)行研究,將某體 系中蛋白質(zhì)間的作用繪制成網(wǎng)絡(luò)圖譜。Ohta等[3]進(jìn) 一步通過生物信息學(xué)分析，預(yù)測蛋白質(zhì)的功能。

2 蛋白質(zhì)組學(xué)的技術(shù)

2.1 單一蛋白質(zhì)組學(xué)的鑒定

在蛋白質(zhì)組研究中，常用雙向凝膠電泳（2DE）和聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離成混合 物的蛋白質(zhì)，收集目的蛋白質(zhì)膠帶和膠點(diǎn)，經(jīng)膠內(nèi)酶解后應(yīng)用質(zhì)譜法分析以獲得蛋白質(zhì)信息。其中雙向 電泳（2DE）這是最經(jīng)典最成熟的蛋白質(zhì)分離技術(shù)產(chǎn)生于20 世紀(jì) 70年代[5]，是通過相對分子量和蛋白 質(zhì)的等電點(diǎn)（PI）的不同將高通量地蛋白分離出來[6]。單個蛋白質(zhì)的鑒定生物化學(xué)領(lǐng)域常見的問題，目 前有兩大方法論：Edman降解法和質(zhì)譜法。質(zhì)譜法又細(xì)分為兩類：基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）和高效液相串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS），如 MALDI-TOF-MS 技術(shù)在脂質(zhì)中的應(yīng)用[7]。后者較前者具有更高的靈敏度和幾乎 100%的可能性，且 具有MALDI-TOF-MS 不可比擬的從單一蛋白質(zhì) 膠帶中準(zhǔn)確鑒定出多個蛋白質(zhì)組分的能力。如對膜蛋白的蛋白質(zhì)組學(xué)的研究用同位素親和標(biāo)記技術(shù)、MALDI-TOF-MS 技術(shù)、MD-LC 技術(shù)相互結(jié)合鑒別出未描述的MT1-基質(zhì)金屬蛋白酶底物[8]。

2.2 蛋白質(zhì)全譜鑒定

蛋白質(zhì)學(xué)的核心內(nèi)容之一就是蛋白質(zhì)鑒定。傳統(tǒng)的方法如蛋白質(zhì)微量測序、氨基酸組分分析費(fèi)時費(fèi) 力、通量低，存在不容易實(shí)現(xiàn)規(guī)?；妥詣踊Y(jié)果靈敏度差等問題。當(dāng)前主流的基于軟電離技術(shù)的LC-MS/MS是實(shí)現(xiàn)高通量蛋白鑒定的主要方法。Kim等[9]用LC-MS/MS 技術(shù)，對 30個來自正常人類的不同組織、器官樣品進(jìn)行了深度蛋白組解析，共鑒定到了 17 294個蛋白，占人類全部有注釋編碼蛋白基 因的84%，對人類蛋白質(zhì)組草圖繪制。將純化的蛋白質(zhì)用消化酶水解成肽段，肽段混合物經(jīng)過除鹽后進(jìn) 入液相色譜實(shí)現(xiàn)初步分離，經(jīng)液相分離后的肽段經(jīng)第一級和第二級系統(tǒng)做進(jìn)一步碎裂，使肽段離子被打 碎成更小的、更有規(guī)律的碎片離子；理論上蛋白質(zhì)序列經(jīng)過酶解后形成肽段，肽段再經(jīng)過理論二級碎裂 形成理論的二級碎片離子譜圖；然 后用實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的MS/MS譜圖信息與理論產(chǎn)生的MS/MS譜圖信息比對，通過比較二者的相似度來確定譜圖對應(yīng)哪個肽段[10-11]。其中理論蛋白質(zhì)的數(shù)據(jù)庫來自基因組預(yù)測或前期 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證等數(shù)據(jù)。目前的蛋白組數(shù)據(jù)庫數(shù)有(SWISS-PROT、BLOCKS[12]、NOPdb[13]、ExPASy[14]等 )。

2.3 定量蛋白質(zhì)組

從蛋白質(zhì)的角度研究生命現(xiàn)象和規(guī)律已成為研究生命科學(xué)的主要手段，而這些研究往往離不開對細(xì) 胞、組織或器官中含有的蛋白質(zhì)表達(dá)量和種類的研究。對于不同條件、不同時期下研究蛋白質(zhì)表達(dá)水平的變化，尋找生物標(biāo)志物，這些研究都需要對蛋白質(zhì)進(jìn)行定量和鑒定。生物質(zhì)譜技術(shù)的不斷發(fā)展和成熟 為蛋白質(zhì)的差異表達(dá)分析提供了更可靠、動態(tài)范圍更廣的研究手段。當(dāng)前，基于質(zhì)譜技術(shù)的定量手段大 致分為無標(biāo)記定量（labal-free quantification）和標(biāo)記定量（labeled quantification）。其中 labal-free定量 不需要對比較樣品做特定標(biāo)記處理，只需要比較特定的肽段、蛋白在不同樣品間的色譜質(zhì)譜響應(yīng)信號便 可得到樣品間蛋白表達(dá)量的變化，通常用于分析大規(guī)模蛋白鑒定和定量時所產(chǎn)生的質(zhì)譜數(shù)據(jù)。如利用Labal-free定量技術(shù)規(guī)?；治鰪?fù)雜的蛋白質(zhì)組學(xué)質(zhì)譜數(shù)據(jù)[15]。利用iTRAQ 定量技術(shù)是目前定量蛋白質(zhì) 組學(xué)中應(yīng)用最廣泛的技術(shù)。在一級質(zhì)譜圖中，標(biāo) 記在不同樣本中的所有iTRAQ 試劑在同一蛋白質(zhì)的質(zhì)荷 比表現(xiàn)是相同的；在二級質(zhì)譜中，iTRAQ 試劑中的平衡基團(tuán)發(fā)生中性丟失，信號離子以不同的質(zhì)荷比表現(xiàn)出不同波峰高度或面積，以此得到同一蛋白在不同樣本中的表達(dá)差異；同時，肽段的MS/MS 結(jié)果結(jié) 合數(shù)據(jù)庫檢索可以鑒定出相應(yīng)的蛋白質(zhì)種類。

2.4 目標(biāo)蛋白質(zhì)組

現(xiàn)代生物標(biāo)記物根據(jù)發(fā)現(xiàn)階段、驗(yàn)證階段、臨床確認(rèn)階段這三個階段進(jìn)行研究。在發(fā)現(xiàn)階段，采用蛋白組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)及鑒定生物標(biāo)記物應(yīng)用較多，而在確認(rèn)和驗(yàn)證階段，樣品高度復(fù)雜，傳統(tǒng)蛋白質(zhì)組學(xué) 方法在此背景噪音結(jié)果不盡人意。正是在這樣的背景下，發(fā)展了目標(biāo)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)。它具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、準(zhǔn)確性高、重現(xiàn)性好、現(xiàn)行動態(tài)范圍廣等優(yōu)勢，基于蛋白質(zhì)組學(xué)的生物標(biāo)記物研究、蛋白質(zhì) 翻譯后修飾、定量蛋白質(zhì)組和蛋白質(zhì)組相互作用領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。目前有MRMHR（muitiple reacting monitoring）技術(shù)和SWATH（sequential window acquisition of all mass sepectra）定量技術(shù)。MRMHR是一種數(shù)據(jù)獲取方式，基于假定信息設(shè)定或已知信息的質(zhì)譜檢測規(guī)則，信號記錄符合規(guī)則的離子，去除大量有干擾能力或不符合規(guī)則的離子信號，從而得到質(zhì)譜信息[16]。而 SWATH 定量技術(shù)是一種新型的、高通 量的、全景式的MS/MS 掃描技術(shù)，將掃描范圍劃分為一系列區(qū)間，此區(qū)間是以25da 為間隔的，進(jìn)而 超高速掃描全部離子，來 獲得掃描范圍內(nèi)的所有碎片信息，拓 展了 MS/MSALL技術(shù)[17-18]。如 利用SWATH 和iTRAQ 定量技術(shù)揭示 CD109在晚期非小細(xì)胞的過表達(dá)和生物相關(guān)性[19]。

2.5 相互作用蛋白質(zhì)組

蛋白質(zhì)很少單獨(dú)發(fā)揮作用，在所有微生物功能中，占主導(dǎo)地位的是蛋白質(zhì)混合物的功能。蛋白質(zhì)組的相互作用的研究方法主要有酵母雙雜交技術(shù)（Y2H）、親和純化（AP）、化學(xué)交聯(lián)偶聯(lián)質(zhì)譜（CXMS）等方法。Y2H 和CXMS 雖然通量相對較高，但結(jié)果假陽性較大，不同實(shí)驗(yàn)室做出的結(jié)果差距較大。AP-SWATH 技術(shù)是在AP 技術(shù)基礎(chǔ)上，在非常接近于生理?xiàng)l件的情況下使用的純化標(biāo)簽是經(jīng)過特別設(shè)計的，能捕捉到分子伴侶及其特定的蛋白質(zhì)，研究人員經(jīng)質(zhì)譜分離技術(shù)分析可鑒別出這種蛋白質(zhì)相互作用組。該方法特異性非常高，能夠準(zhǔn)確地富集到靶蛋白的特異性相互作用蛋白。如采用AP-SWATH 定量技 術(shù)研究 14-3-3家族的蛋白質(zhì)相互作用[20]。

3 蛋白質(zhì)組學(xué)在微生物中的應(yīng)用

3.1 極端微生物蛋白質(zhì)組學(xué)研究

第一個古細(xì)菌蛋白質(zhì)組研究的初級階段完成的基因組闡述。Z ivanovic等[21]從 熱液煙囪收集的樣品中 分離的一株嗜熱耐 ? 輻射菌（Gammatolerans），它是古細(xì)菌最抗輻射的生物。對其測定出基因組序列與 其他嗜熱菌基因組比較，進(jìn)一步通過鳥槍法與 LC-MS/MS 進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn) 10 931個獨(dú) 特的肽，對應(yīng) 951個蛋白質(zhì)。這一信息驗(yàn)證了基因組注釋的準(zhǔn)確性。嗜鹽古生菌是Halobacteriacea家族的一員，大多數(shù)嗜鹽古生菌需要 1.5mol/L氯化鈉增長來保持細(xì)胞的結(jié)構(gòu)完整性。因此這些生物體的蛋白 質(zhì)在高鹽度適應(yīng)是活躍的和穩(wěn)定的條件。W A Joo等[22]討論了當(dāng)前蛋白質(zhì)組研究嗜鹽古生菌和引入有效篩 查程序，預(yù)測，確認(rèn)新嗜鹽酶的功能。嗜冷微生物能夠持續(xù)低溫的環(huán)境生存和增殖，克服了低溫這項(xiàng)挑 戰(zhàn)包括：酶活性降低，膜流動性降低，改變運(yùn)輸營養(yǎng)物質(zhì)和廢物，減少轉(zhuǎn)錄、翻譯和細(xì)胞分裂、不適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)折疊，胞內(nèi)冰的形成。Salvino等[23]介 紹了Psychropiezophilic微生物適應(yīng)寒冷和生活在深深的海洋，最大增長速度在2℃和最高生長溫度僅 12℃，這表明在溫度低至2℃，一些酶或超分子結(jié)構(gòu)已 經(jīng)顯示出改變構(gòu)象，消極地影響代謝通量。

3.2 放線菌蛋白質(zhì)組學(xué)研究

放線菌與人類之間密切相關(guān)，有益菌占絕大多數(shù)，對人類健康做出了重要的貢獻(xiàn)，不但合成多種維 生素、生物活性物質(zhì)及酶類，而且具有復(fù)雜發(fā)育過程和形態(tài)分化，具有較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力。Maréchal等[24]應(yīng) 用比較蛋白組學(xué)對產(chǎn)抗生素量相對高的ppk突變株和產(chǎn)抗生素量低的野生菌株S.lividans的蛋白質(zhì) 組差異進(jìn)行比較，分析發(fā)現(xiàn)了新的蛋白 12個；證實(shí)鏈霉菌的生物合成中存儲脂類代謝和抗生素之間的聯(lián) 系。Manteca等[25]使用LC-MC/MC 技術(shù)和iTRAQ 技術(shù)對S.coelicolor液體發(fā)酵和固體培養(yǎng)下比較不同發(fā) 育階段的蛋白質(zhì)組，在早期的區(qū)分菌絲體(MI)和多核菌絲體(MII)的蛋白質(zhì)比較鑒定發(fā)現(xiàn)這兩菌絲體中相 似的蛋白質(zhì)達(dá)到 83%之多，參與初級代謝的蛋白質(zhì)在MI更豐富，參與次級代謝的蛋白質(zhì)上調(diào)在MII時，最主要的是在末期形成孢子的過程中 MII的蛋白質(zhì)存在顯著差異。Mastronunzio[26]基于具有共性的3個 基因組序列，應(yīng)用LC-MS/MS 蛋白組學(xué)技術(shù)對弗蘭克氏菌屬 CcI3的胞外蛋白質(zhì)進(jìn)行處理，進(jìn)過生物信 息學(xué)分析檢測到共生蛋白質(zhì) 1 000多個，其中有固氮蛋白、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、信號蛋白、結(jié)節(jié)性分泌蛋白和細(xì) 胞表面蛋白，且含量最豐富的是固氮蛋白。這為揭示共生細(xì)菌的生活方式提供了依據(jù)。Chen等[27]目的性的篩選 26 株未被測序的放線菌株中 NRPs 和PKs的表達(dá)，發(fā)現(xiàn) 10個含高 GC 基因組的NRPS/PKS 基因 簇存在于6株菌株中。

3.3 病原菌蛋白質(zhì)組學(xué)研究

凡能引起人類疾病的細(xì)菌統(tǒng)稱為病原菌或致病菌，目前，有40多種病原菌被測出其全基因序列，對 其中的十幾種病原菌的蛋白組學(xué)進(jìn)行了研究。Jungblut等[28]應(yīng) 用蛋白組學(xué)技術(shù)對結(jié)核分枝桿菌 H37Rv，發(fā)現(xiàn)了蛋白質(zhì)在6個基因庫中都未測序到，其中在CDC1551 菌株中發(fā)現(xiàn) 5個的ORF。這一結(jié)果表明基因組測序還存在某些缺陷，蛋白質(zhì)組的研究對其結(jié)果起到修飾和補(bǔ)充的作用。Jungblut等 [29]對幽門螺桿 菌 26695 和J99 研究發(fā)現(xiàn)，通過高分辨率的二維電泳技術(shù)分離的分辨能力 5 000個蛋白質(zhì)斑點(diǎn)，使用基 質(zhì)輔助激光解吸/電離質(zhì)譜(MALDI-MS)、肽質(zhì)量指紋識別了 152個蛋白質(zhì)，其中包括9個已知的毒力因 子和28個抗原。尿路致病性大腸埃希菌（E.coli）536菌株有4個毒力因子（PAIs I536～I(xiàn)V536），PAI II536 可使 leuX 失活，其編碼 tRNA5Leu，影響毒力因子不同的表達(dá)特征 [30]。Duffes等 [31]對產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特 氏菌野生型和具有抗性 DivercinV41 進(jìn)行全細(xì)胞蛋白表達(dá)的研究，通過 2DE 分析發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)模式存在很 大差異，具有抗性菌株中未發(fā)現(xiàn)存在與野生菌株中的9個蛋白點(diǎn)，但新發(fā)現(xiàn)了 8個蛋白點(diǎn)，其中新增的蛋白點(diǎn)中有一個被確定為鞭毛蛋白，且此鞭毛蛋白的胞內(nèi)合成可能通過σ 因子間接影響在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中具有廣泛修飾作用。

3.4 群體微生物蛋白質(zhì)組學(xué)研究

首次將“元蛋白組學(xué)（宏蛋白組學(xué)）”一詞提出的是Wilmes 和Bond [32]，將其定義為：環(huán)境微生物群 在特定的時間內(nèi)蛋白質(zhì)的所有總和。在生命有機(jī)體內(nèi)蛋白質(zhì)參與生物轉(zhuǎn)化，而在構(gòu)建微生物群動態(tài)功能 學(xué)時元蛋白組學(xué)是最全面、最恰當(dāng)?shù)姆椒ǎ瑫r也是研究代謝組學(xué)中代謝途徑和調(diào)節(jié)機(jī)制最重要的一步。元蛋白組學(xué)可以分析活性污泥、廢水處理系統(tǒng)的生物除磷過程中的代謝信息。Wilmes等[33]應(yīng)用2-DE 和質(zhì)譜技術(shù)發(fā)現(xiàn)了 46個蛋白，與生物除磷過程（EBPR）相關(guān)的宏基因組序列最近，這些蛋白直接參與EBPR 過程，包括參與乙醛酸/檸檬酸循環(huán)、糖原的分解與合成、糖酵解、脂肪酸的β 氧化、磷酸脂肪酸合成和運(yùn)輸；還發(fā)現(xiàn)了幾個蛋白參與細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)。這實(shí)驗(yàn)直接表明了通過元白組學(xué)了解代謝調(diào)控機(jī)制。元蛋 白組學(xué)可以分析水體微生物群落的組成和蛋白質(zhì)功能。Kan等[34]以切薩皮克灣的微生物群落（0.2～3.0μm）的元蛋白質(zhì)組進(jìn)行研究，應(yīng)用LC-MS/MS 分析法發(fā)現(xiàn)該地區(qū)微生物的所有蛋白質(zhì)中，中灣重復(fù)蛋 白約占 92%，上下灣的重復(fù)蛋白分別約為 30%和70%。應(yīng)用MS-BLAST搜索法有3 種蛋白質(zhì)被檢測出，這些蛋白質(zhì)的識別來源于海洋微生物，與切薩皮克灣α-變形菌、擬桿菌屬高度相關(guān)。而 Morris等 [35]應(yīng)用比較元蛋白組學(xué)揭示了海洋微生物群落的能源利用率和能量轉(zhuǎn)換。首次將元蛋白組學(xué)技術(shù)應(yīng)用在嬰兒糞 便微生物是Klaassens等 [36]，將2-DE、MALDI-TOF-MS 分析法結(jié)合起來表明糞便生物群落元蛋白組圖 譜會隨著時間的變化而變化。

4 展 望

目前，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)仍處在不斷發(fā)展、完善的階段，并迅速在各行各業(yè)中廣泛應(yīng)用。微生物蛋白 質(zhì)組學(xué)的應(yīng)用具有重大意義，同時也存在不少困難：在極端微生物中，雖然闡述了些極端微生物在不同 脅迫下的抵御機(jī)制，因脅迫因素導(dǎo)致傷害的改善提供了新的依據(jù)，但是還有大部分極端微生物未被發(fā)現(xiàn)，未被測序出； 在放線菌中廣泛存在的次級代謝物基因資源可被繼續(xù)挖掘和利用； 病原菌感染機(jī)制及過程，疫苗及新藥的開發(fā)和應(yīng)用等生物蛋白質(zhì)組學(xué)策略的研究可被進(jìn)一步的完善和補(bǔ)充；元蛋白質(zhì)組學(xué)處于初 級階段，但微生物群落功能信息的研究潛力巨大 [37]，目前進(jìn)行元蛋白組學(xué)的研究過少，需要對生物化學(xué) 循環(huán)中功能成分進(jìn)行深入研究。

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