響應(yīng)面法優(yōu)化“酶法-超聲波”連續(xù)提取核桃青皮多酚

伏慧慧，譚梅，郭艷秋，侯太芳，張麗，2，宋麗軍，2，*

（1.塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾843300；2.南疆特色農(nóng)產(chǎn)品深加工兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆阿拉爾843300）

響應(yīng)面法優(yōu)化“酶法-超聲波”連續(xù)提取核桃青皮多酚

伏慧慧1，譚梅1，郭艷秋1，侯太芳1，張麗1，2，宋麗軍1，2，*

（1.塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾843300；2.南疆特色農(nóng)產(chǎn)品深加工兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆阿拉爾843300）

為了優(yōu)化核桃青皮中多酚類物質(zhì)的“酶法-超聲波”連續(xù)提取工藝，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過(guò)Design Expert 8.05軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)與優(yōu)化，得到了預(yù)測(cè)數(shù)學(xué)模型。結(jié)果表明，酶法提取最佳工藝條件為：采用纖維素酶，酶解溫度55.00℃、酶解pH 5.00、酶解時(shí)間75.00min、酶添加量15.00 U/mL、液料比30∶1mL/g。酶解后繼續(xù)采用超聲波輔助二次提取，以50%“乙醇-水”為提取液，超聲時(shí)間45min、超聲溫度50℃、超聲功率100W，此條件下多酚提取率為61.36%。

響應(yīng)面；纖維素酶；超聲波；核桃青皮；多酚

核桃青皮，又稱青龍衣，是核桃加工過(guò)程的的主要副產(chǎn)物。核桃青皮中含有豐富的多酚類化合物，如綠原酸、香草酸、槲皮素、沒(méi)食子酸、核桃酮等[1-3]，具有較強(qiáng)的抗氧化活性，有抗衰老、治療心腦血管疾病、降血脂、抗癌、抗輻射等生理活性[4-5]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，截止2010年底，新疆核桃青皮產(chǎn)量已達(dá)到13.41萬(wàn)t[6]，但長(zhǎng)期以來(lái)，核桃青皮均作為廢渣拋棄，造成了極大的環(huán)境污染和資源浪費(fèi)，因此，有效利用新疆核桃青皮資源顯得極為重要。

近年來(lái)，酶法、超聲波、微波、超臨界CO2等提取技術(shù)已在中藥材及食品的生物活性成分提取領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用，如多糖[6]、功能油脂[7]、石榴皮多酚[10]、皂甙[11]、茶多酚[13-16]、葡萄多酚[17-18]、余甘子多酚[19]、板栗多酚[20]、蘋果多酚[21]等物質(zhì)提取方面得到了深入研究，然而“酶法-超聲波”連續(xù)提取在核桃青皮多酚提取中的研究卻鮮見報(bào)道。

本文以新疆薄皮核桃溫185青皮為原料，采用酶法提取其中多酚類物質(zhì)，并利用超聲波輔助“乙醇-水”溶液進(jìn)行二次提取。以響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化“酶法-超聲波”連續(xù)提取核桃青皮多酚的最佳工藝，為新疆核桃青皮多酚提取提供新方法。

1 材料與方法

1.1 材料試劑

核桃青皮：由于不同品種、生長(zhǎng)期的核桃中多酚含量差異較大，本試驗(yàn)原料一次性采集。新疆薄皮核桃溫185核桃青皮，樹齡21年～23年，2012年10月2日購(gòu)于新疆阿拉爾市。

福林-酚試劑：Sigma公司；沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品：Sigma公司；

果膠酶，纖維素酶：南寧市基亞實(shí)驗(yàn)用品公司；中性蛋白酶：上海藍(lán)季科技有限公司；乙醇、無(wú)水碳酸鈉等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DHG-9101-1S減壓干燥箱：上海鴻都電子科技有限公司；HH-S6恒溫水浴鍋：上海博訊事業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；FZ102粉碎機(jī)：北京市永光明醫(yī)療儀器廠；Neofuge 15R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：北京陽(yáng)光思特生物技術(shù)有限公司；SB-3200DTDN超聲波清洗器：寧波新芝生物科技股份公司；SHA-C恒溫振蕩器：常州國(guó)華生化儀器股份公司；島津UV-Mini1240型紫外可見分光光度計(jì)：日本島津公司；MA110型電子天平：上海臺(tái)衡儀器儀表有限公司。

1.3 提取工藝及要點(diǎn)

核桃青皮→預(yù)處理→減壓干燥→粉碎、過(guò)篩→樣品-酶-緩沖液混合→恒溫震蕩提取→加入乙醇→超聲輔助二次提取→離心→上清液→測(cè)定總多酚。

操作要點(diǎn)：

1）核桃青皮切分后于50℃減壓干燥，粉碎，過(guò)80目篩，置于棕色瓶中密封，-18℃冷凍保藏備用。

2）酶法提?。喝? g粉末與提取溶液（酶-磷酸鹽緩沖液體系）混合，在恒溫振蕩器中避光提取。為避免有機(jī)溶劑引起酶變性，本試驗(yàn)在第一提取階段采用水提取，然后在提取后的溶液中加入乙醇（使最終比例為乙醇∶緩沖液=1∶1）進(jìn)行超聲波輔助二次提取，離心后取上清液測(cè)定總多酚含量。

3）二次提取工藝：本試驗(yàn)確定采用“乙醇∶水=1∶1”的溶液為溶劑，采用超聲波輔助二次提取超聲功率100W，時(shí)間45min，溫度50℃（避光）。離心后取上清液測(cè)定多酚含量。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 定性試驗(yàn)[2，4]

根據(jù)參考文獻(xiàn)[2，4]對(duì)提取液進(jìn)行多酚類定性分析。

1.4.2 總多酚測(cè)定

采用福林-酚法測(cè)定，參見參考文獻(xiàn)[11-13]。

沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=0.102 5 x－0.009 1（R2=0.998 3）。

總多酚測(cè)定：取離心后的上清液1.0mL，按上述沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法測(cè)定吸光度，計(jì)算樣品中的多酚提取率。樣品中的多酚以沒(méi)食子酸的含量表示，單位為mg/g。

多酚提取率（%）=[提取液中多酚含量（g）/原料中多酚含量（g）]×100%。

1.4.3 酶法提取核桃青皮多酚工藝

1.4.3.1 酶的選擇

分別選擇纖維素酶、果膠酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶等，在其最佳酶解溫度、酶解pH條件下，分別酶解3.0 h，測(cè)定多酚提取率。

1.4.3.2 溫度對(duì)多酚提取率的影響

在酶解pH 5.0、時(shí)間60 min、酶添加量12 U/m L、液料比30mL/g條件下，分別設(shè)置酶解溫度30、40、50、60、70℃，考察溫度對(duì)多酚提取率的影響。

1.4.3.3 酶解pH對(duì)多酚提取率的影響

在酶解時(shí)間60min、酶添加量12 U/mL、液料比30mL/g、溫度50℃條件下，分別設(shè)置酶解pH為3.5、4、4.5、5、5.5、6，考察酶解pH對(duì)多酚提取率的影響。

1.4.3.4 酶解時(shí)間對(duì)多酚提取率的影響

在酶解pH 5.0、溫度50℃、酶添加量12U/mL、液料比30m L/g條件下，分別設(shè)置酶解時(shí)間為30、50、70、90、110、130min，考察酶解時(shí)間對(duì)多酚提取率的影響。

1.4.3.5 酶添加量對(duì)多酚提取率的影響

在酶解溫度50℃、pH 5.0、時(shí)間60min、液料比30mL/g條件下，分別設(shè)置酶解酶添加量3、6、9、12、15、18U/mL，考察酶添加量對(duì)多酚提取率的影響。

1.4.3.6 液料比對(duì)多酚提取率的影響

在酶解溫度50℃、pH 5.0、時(shí)間60min、酶添加量12U/m L條件下，分別設(shè)置液料比10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1mL/g，考察液料比對(duì)多酚提取率的影響。

在上述單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化“酶法-超聲波”聯(lián)合提取核桃青皮多酚工藝。

2 結(jié)果與分析

2.1 多酚類定性試驗(yàn)

多酚類定性試驗(yàn)見表1。

由表1可知，定性試驗(yàn)均顯示陽(yáng)性結(jié)果，說(shuō)明核桃青皮提取物中含有多酚類物質(zhì)。

2.2 酶法輔助提取核桃青皮單因素分析

2.2.1 酶的選擇

不同種類的酶處理對(duì)多酚提取率的影響見圖1。

由圖1可知，試驗(yàn)過(guò)程所用的4種酶對(duì)多酚提取均有促進(jìn)作用。其中纖維素酶的得率最高，達(dá)到43.20%（對(duì)照樣為26.59%）。因選擇纖維素酶作為后續(xù)試驗(yàn)用酶制劑。

2.2.2 酶解溫度對(duì)多酚提取率的影響

酶解溫度對(duì)核桃青皮多酚提取率的影響見圖2。

由圖2可知，酶解溫度對(duì)核桃青皮多酚具有顯著影響。在一定范圍內(nèi)，多酚提取率隨著溫度的升高而增加，當(dāng)溫度達(dá)到50℃～60℃時(shí)，多酚提取率達(dá)到最大；當(dāng)溫度高于60℃時(shí)，多酚提取率隨溫度的升高而逐漸減少，可能原因是高溫導(dǎo)致酶的活性降低，且過(guò)高的溫度也會(huì)對(duì)已溶出的多酚類物質(zhì)起到破壞的作用[11]。故選擇酶解溫度為50℃，此時(shí)多酚提取率為54.76%。

2.2.3 酶解pH對(duì)多酚提取率的影響

酶解pH對(duì)核桃青皮多酚提取率的影響見圖3。

由圖3可知，pH 5.0時(shí)，多酚提取率達(dá)到最大值；pH偏離該范圍時(shí)，多酚提取率顯著減小。原因?yàn)槊傅幕钚允墉h(huán)境pH的影響很大，在酶的最適pH條件下，酶反應(yīng)速率達(dá)到最大，高于或低于該最適pH，反應(yīng)速度都會(huì)下降[5]。故將最佳提取pH確定為5.0，此時(shí)多酚提取率為54.74%。

2.2.4 酶解時(shí)間對(duì)多酚提取率的影響

酶解時(shí)間對(duì)核桃青皮多酚提取率的影響見圖4。

由圖4可知，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)多酚提取率明顯增高，當(dāng)酶解時(shí)間為70min時(shí)，多酚提取率達(dá)到最高值57.56%；繼續(xù)延長(zhǎng)酶解時(shí)間，多酚提取率增加不顯著。因此，選擇最佳的酶解時(shí)間為70min。

2.2.5 酶添加量對(duì)多酚提取率的影響

酶添加量對(duì)核桃青皮多酚提取率的影響見圖5。由圖5可知，多酚提取率隨酶添加量的增大而增大，這是由于纖維素酶催化核桃青皮細(xì)胞壁纖維素物質(zhì)的水解，導(dǎo)致細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)損壞，細(xì)胞膜透性增加[8]，利用多酚類物質(zhì)的溶出。在酶添加量為12U/mL時(shí)，多酚提取率為58.68%；繼續(xù)增加酶量，多酚提取率雖略有增加，但幅度不大。綜合提取效果及成本因素，選纖維素酶的酶添加量為12U/mL。

2.2.6 液料比對(duì)多酚提取率的影響

液料比對(duì)核桃青皮多酚提取率的影響見圖6。

由圖6可知，當(dāng)液料比小于30∶1時(shí)，隨著液料比的增大，多酚的得率迅速由35.41%增大至56.16%。當(dāng)液料比大于30∶1時(shí)，多酚提取率雖略有增加，但增幅不大。考慮到后續(xù)的超聲波輔助二次提取工藝，以及降低濃縮成本，增大溶劑的量對(duì)多酚提取的意義不大，因此選擇液料比30∶1mL/g。

2.3 響應(yīng)面分析

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取溫度、pH、時(shí)間、酶添加量4個(gè)因素，運(yùn)用Design Expert8.05軟件的Box-Behnken原理進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)。各因素及水平見表2。

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表3所示。

以多酚提取率為響應(yīng)值（Y），利用Design Expert 8.05軟件對(duì)表3數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到響應(yīng)值對(duì)自變量的多元回歸方程：Y=58.75＋2.53A＋0.22B＋3.40C＋3.22D＋1.24AB-0.12 A C＋0.23AD-1.74BC＋0.15BD-2.30CD-2.63A2-3.47B2-1.80C2-0.32D2（1），其中，Y為核核桃多酚提取率的預(yù)測(cè)值，A、B、C、D分別為上述4個(gè)自變量的編碼值。

由表4可以看出：Fmodel=499.2，P＜0.000 1，表明模型（1）極顯著，R2=0.998 0，Adj R2=0.996 0，Pred R2=0.989 6，Adeq Precision=73.632，說(shuō)明該模型擬合程度良好，試驗(yàn)誤差小，該模型可以用來(lái)分析和預(yù)測(cè)“酶法-超聲波”聯(lián)合提取核桃青皮多酚的效果。

模型（1）中一次項(xiàng)A、C和D極其顯著，B顯著，交互項(xiàng)AB，BC和CD極其顯著，A2、B2、C2極其顯著。對(duì)表2的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，剔除不顯著交互項(xiàng)，得到核桃青皮多酚提取率（%）對(duì)各自變量的標(biāo)準(zhǔn)回歸方程為：Y=10.5＋0.43A＋0.037 B＋0.58C＋0.55D＋0.21AB-0.30BC-0.39CD-0.45A2-0.59B2-0.31C2-0.055D2（2），各自變量對(duì)響應(yīng)值的影響大小順序?yàn)椋篊＞D＞A＞B。

圖7為不同因素間交互作用對(duì)核桃青皮多酚提取效果的影響。通過(guò)等高線可直觀地反映出不同變量間交互作用的顯著程度，等高線越扁平說(shuō)明因素之間交互作用越顯著，對(duì)Y值（多酚提取率）的影響越大。由圖7可知：溫度和pH、pH和酶解時(shí)間、酶解時(shí)間和酶添加量交互作用的等高線均呈現(xiàn)橢圓、扁平狀，表示上述因素之間的相互作用顯著。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)軟件和模型進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化分析，得到核桃青皮多酚“酶法-超聲波”聯(lián)合提取的最佳工藝條件為：溫度55.40℃，pH 5.04、時(shí)間74.93min、酶添加量15.00U/mL、液料比30∶1mL/g，在此條件下預(yù)測(cè)得率為62.54%。結(jié)合實(shí)際操作情況，將上述最優(yōu)工藝調(diào)整為：溫度55.00℃，pH 5.00、時(shí)間75.00min、酶添加量15.00U/mL、液料比30∶1mL/g，并在此優(yōu)化工藝條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。3次驗(yàn)證試驗(yàn)多酚提取率為61.36%，驗(yàn)證值與預(yù)測(cè)值相對(duì)誤差相差較小，說(shuō)明了模型的有效性。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)在單因素基礎(chǔ)上，通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化了“酶法-超聲波”聯(lián)合提取核桃青皮多酚的最佳工藝，建立了可用的二次多項(xiàng)預(yù)測(cè)模型。各因素對(duì)多酚的影響順序?yàn)椋好附鈺r(shí)間＞酶添加量＞酶解溫度＞酶解pH。最佳工藝參數(shù)為：粉碎粒度80目、酶解溫度55.00℃、酶解pH 5.00、酶解時(shí)間75.00min、酶添加量15.00U/m L、液料比30：1mL/g，酶解后繼續(xù)采用超聲波輔助二次提取法，以50%“乙醇-水”為提取液，超聲時(shí)間45min、超聲溫度50℃、超聲功率100W，此條件下多酚提取率為61.36%。

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Optimization of Enzymatic-ultrasonic Continuous Extraction of Polyphenols from Walnut GreenPeels by Response Surface Methodology

FUHui-hui1，TANMei1，GUOYan-qiu1，HOUTai-fang1，ZHANGLi1，2，SONG Li-jun1，2，*
（1.College of Life Sciences，Tarim University，Alar843300，Xinjiang，China；2.Xinjiang Production and Construction CorpsKey Laboratory to Process of Agricultural Products in Southern Xinjiang，Tarim University，Alar843300，Xinjiang，China）

In order to optimize the enzymatic-ultrasonic continuous extraction processes of polyphenols fromwalnut green peels，the optimum extraction technology and mathematical regression model were established byresponse surface methodology on the basis of single-factor test. The results showed that the optimal extractionconditions were extraction temperature of 55 ℃， extraction time of 75.00 min， extraction pH of 5.00， enzymedosage of 15.00 U/mL， ratio of liquid to solid of 30 ∶ 1 mL/g. And the ultrasonic-assisted extraction was operatedafter enzymatic extraction for 45 min at the power of 100 W by 50 % ethanol solution as extractant. Under theseconditions， the maximum extraction yield of polyphenols from walnut green peels was 61.36 %.

response surface methodology； cellulase； ultrasonic； walnut green peels； polyphenols

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.07.011

2014-11-17

新疆兵團(tuán)工業(yè)科技計(jì)劃項(xiàng)目（NO：2012BA011）；國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新項(xiàng)目（NO：TDGCX201246，NO：201310757009）

伏慧慧（1992—），女（漢），本科，主要研究方向：糧油加工。

*通信作者