山慈菇多糖對(duì)荷H22肝癌小鼠的抗腫瘤機(jī)制研究

徐小娟，蔡懿鑫，毛宇，徐芳，劉湘新，賀建華，*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410128；2.湖南省醫(yī)藥技工學(xué)校，湖南長(zhǎng)沙410000；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410128；4.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410128）

山慈菇多糖對(duì)荷H22肝癌小鼠的抗腫瘤機(jī)制研究

徐小娟1，2，蔡懿鑫3，毛宇1，徐芳1，劉湘新4，賀建華3，*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410128；2.湖南省醫(yī)藥技工學(xué)校，湖南長(zhǎng)沙410000；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410128；4.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410128）

研究山慈菇多糖對(duì)H22肝癌實(shí)體瘤小鼠的抗腫瘤作用及其機(jī)制。制作小鼠H22實(shí)體瘤肝癌模型，通過脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)分析其對(duì)小鼠免疫器官的影響，Elisa檢測(cè)血清白介素-2（IL-2）含量、腫瘤壞死因子（TNFα）含量，免疫組化法觀察（Bcl-2）表達(dá)水平。山慈菇多糖的低、中、高劑量組抑瘤率分別為43.74%、37.57%、30.76%，；能增強(qiáng)血清中IL2、TNFα活性；抗凋亡因子Bcl-2的表達(dá)量不同程度地減少。山慈菇多糖對(duì)H22肝癌小鼠具有一定的腫瘤抑制作用，本次實(shí)驗(yàn)不體現(xiàn)劑量依賴性，顯示山慈菇多糖無毒副作用，能增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤能力，降低腫瘤的持續(xù)增殖能力。

抗腫瘤；山慈菇多糖；肝癌H22；IL-2；TNFα；bcl-2

山慈菇（pseudobulbus cremastrae seu pleiones）始見于《本草拾遺》[1]，為中國(guó)藥典收載的少常用中藥[2]。山慈菇來源復(fù)雜，名稱眾多[3]，本試驗(yàn)的山慈菇為蘭科植物獨(dú)蒜蘭（P.yunnanensis Rolfe）的假鱗莖，習(xí)稱“冰球子”假鱗莖入藥，稱“山慈菇”或“毛慈菇”，藥材又稱毛慈菇，其味甘、微辛、寒、歸肝、脾經(jīng)，具有清熱解毒、消癰散結(jié)的功效，中醫(yī)臨床上常用于治療淋巴結(jié)核，乳腺癌、食管癌、胃癌等惡性腫瘤，以及蛇、蟲、狂犬咬傷[4]，降壓[5]。原發(fā)性肝癌（hepato celluar carcinoma，HCC，簡(jiǎn)稱肝癌），是世界上最常見的惡性腫瘤之一[6]，目前治療肝癌仍以手術(shù)及化療為主，但化療易引起的肝腎毒性等不良反應(yīng)[7]。多糖是一類由單糖聚合而成的多聚糖。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種植物多糖具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等作用。本實(shí)驗(yàn)選用小鼠肝癌H22細(xì)胞是最常用的小鼠可移植性腫瘤細(xì)胞系之一，廣泛應(yīng)用于小鼠腫瘤動(dòng)物模型的復(fù)制。山慈菇多糖抗腫瘤的機(jī)制少見報(bào)道，因此對(duì)山慈菇多糖誘導(dǎo)鼠源性H22肝癌細(xì)胞凋亡的抗腫瘤機(jī)制作一初步研究。

1 材料

1.1 藥物與試劑

山慈菇多糖：購(gòu)自陜西西安一生物制劑公司，經(jīng)鑒定為正品；腹水型肝癌H22細(xì)胞株：從北京藥植所引進(jìn)；IL-2、TNFα試劑盒：武漢博士德試劑公司；BCL-2：北京中杉生物試劑公司。

1.2 動(dòng)物

SPF級(jí)昆明小鼠，雌性，體質(zhì)量（22±2）g，購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

2 方法

2.1 H22細(xì)胞的培育

將細(xì)胞濃度調(diào)整至1×106，注射至體重22 g～24 g昆明小鼠腹腔，在第8天將小鼠頸椎脫臼處死，抽取乳白色腹水，將細(xì)胞加0.9%生理鹽水按1∶3（體積比）稀釋，調(diào)整細(xì)胞濃度至1∶106，制成細(xì)胞懸液。

2.2 多糖溶液的配置

多糖按各組劑量，放置10mL離心管中用0.9%生理鹽水配置，灌胃后放冰箱4℃冷藏。

2.3 動(dòng)物模型建立

將細(xì)胞懸液接種到小鼠右腋，接種后出現(xiàn)米粒大的鼓包視為接種成功。

2.4 分組及劑量

空白組10只小鼠不接種，每組10只。山慈菇多糖高劑量組——900mg/kg溶液0.2mL，山慈菇多糖中劑量組——600mg/kg溶液0.2mL，山慈菇多糖低劑量組——300mg/kg溶液0.2m L，模型組——生理鹽水0.2mL，陽(yáng)性組——腹腔注射環(huán)磷酰胺20mg/kg溶液0.2mL，正常組——生理鹽水0.2mL。

2.5 給藥

腫瘤移植的當(dāng)天記為0 d。注射48 h后，連續(xù)用藥13 d。隔日稱重并觀察小鼠生存狀態(tài)，模型組在第5天可見實(shí)體瘤體積比接種時(shí)體積有所增大，并用游標(biāo)卡尺測(cè)量腋下腫瘤的長(zhǎng)和寬。

2.6 檢測(cè)指標(biāo)

小鼠末次給藥24 h后，給小鼠稱體重、拍照、眼眶采血，3 000 r/min離心10min制備血清，Elisa試劑盒檢測(cè)血清中IL-2、TNFα的活性，用75%乙醇浸泡10 s后剝?nèi)⌒∈罅鼋M織、肝臟、脾臟、胸腺稱重，瘤組織和肝臟拍照并稱重，將瘤組織浸入4%多聚甲醛固定液中密封，石蠟包埋，連續(xù)切片，免疫組化用SABC三步法檢測(cè)腫瘤組織中Bcl-2表達(dá)。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果及分析

3.1 對(duì)實(shí)體瘤小鼠抑瘤率、重要免疫器官和IL-2、TNFα水平的影響

對(duì)實(shí)體瘤小鼠抑瘤率、重要免疫器官和IL-2、TNFα水平的影響，見表1。

由表1可知，山慈菇多糖低、中、高劑量組對(duì)小鼠肝癌H22實(shí)體瘤的抑制率分別為43.74%、37.57%、30.76%。經(jīng)SPSS18.0單因素分析，與模型組比較，低劑量組具有極顯著差異（P＜0.01），中劑量組具有顯著性差異（P＜0.05），環(huán)磷酰胺組抑制率達(dá)到80.89%，與模型組比較具有極顯著差異（P＜0.01），且與山慈菇多糖各劑量組相比，抑制腫瘤作用較強(qiáng)，山慈菇多糖低、中劑量組的TNFα、IL2活性提高，與模型組相比具有極顯著性（P＜0.01）。

3.2 免疫組織化學(xué)技術(shù)觀察bcl-2蛋白表達(dá)

免疫組織化學(xué)技術(shù)觀察bcl-2蛋白表達(dá)，見圖1。

免疫組織化學(xué)（免疫細(xì)胞化學(xué)）技術(shù)是一項(xiàng)利用抗原抗體反應(yīng)，使標(biāo)記抗體的顯色劑顯色來對(duì)抗原進(jìn)行定位、定性、定量分析的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。用免疫組織化學(xué)技術(shù)SABC三步法檢測(cè)Bcl-2的蛋白表達(dá)，Bcl-2蛋白主要分布在癌細(xì)胞漿。

檢測(cè)結(jié)果顯示多糖組Bcl-2表達(dá)隨劑量增多有所減少，模型組Bcl-2表達(dá)較高，細(xì)胞內(nèi)呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)。

4 結(jié)論

1）本試驗(yàn)結(jié)果顯示，山慈菇多糖可以改善H22肝癌小鼠生存狀態(tài)。

2）環(huán)磷酰胺和山慈菇多糖可不同程度地抑制H22荷瘤小鼠實(shí)體瘤的生長(zhǎng)，相對(duì)模型組，山慈菇多糖中、高劑量組的效果較為明顯，達(dá)到了43.74%和37.57%，山慈菇多糖組荷瘤小鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)下降不明顯，無體質(zhì)量減輕，表明山慈菇多糖對(duì)小鼠機(jī)體的毒副作用小。

3）IL-2、TNFα的變化是反映細(xì)胞功能的一個(gè)重要指標(biāo)，研究發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性肝癌患者外周血IL-2、TNFα水平明顯低于正常人[8]。山慈菇多糖可以提高小鼠IL-2、TNFα的活性，低、中劑量組較為明顯，有利于荷瘤機(jī)體的治療，實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，多糖各劑量組荷瘤小鼠生理狀態(tài)較好，食量、水量、活動(dòng)量較模型、對(duì)照組強(qiáng)，初步揭示了其抑瘤機(jī)理之一，可能是誘導(dǎo)荷瘤鼠脾細(xì)胞分泌TNFα和IL-2等細(xì)胞因子[9]，從而抑制移植性肝癌H22瘤體的生長(zhǎng)。

4）本試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示多糖組Bcl-2表達(dá)隨藥物濃度增高有所減少，模型組Bcl-2表達(dá)較高，細(xì)胞內(nèi)呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)?？墒笲cl-2的減少進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。山慈菇多糖的抑制腫瘤作用可能與誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，降低腫瘤的持續(xù)增殖能力有關(guān)。

綜上所述，山慈菇多糖具有一定的抗腫瘤作用，其作用機(jī)制可能與免疫調(diào)節(jié)及相關(guān)蛋白表達(dá)存在一定的關(guān)聯(lián)。

[1]董海玲.山慈菇的化學(xué)成分和藥理作用研究進(jìn)展[J].中草藥, 2007,38(11).1734-1738

[2]劉新橋.中藥山慈菇的化學(xué)成分及抗腫瘤活性研究[D].天津:天津大學(xué),2007

[3] 阮小麗.山慈菇的抗腫瘤及抑菌作用[J].中藥材,2009,32:1886-1888

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[5] Fujisawa Pharmaceutical Co,Ltd.Antihypertensive cremastosineⅠ and Ⅱ isolation:JP:57035518[P].1982-02-26

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[7]許文翠.欖香烯對(duì)荷H22小鼠的抑瘤作用和對(duì)bcl-2家族促細(xì)胞凋亡蛋白N表達(dá)的影響[D].大連:大連醫(yī)科大學(xué),2011

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Study on Anti-tumor Effect of Pseudobulbus Cremastrae Seu Pleiones Polysaccharide on Mice withH22 Hepatocellular Carcinoma

XU Xiao-juan1，2，CAI Yi-xin3，MAO Yu1，XU Fang1，LIU Xiang-xin4，HE Jian-hua3，*
（1.College of Food Science and Technology，Hunan Agricultural University，Changsha410128，Hunan，China；2.Hunan Medical and Pharmaceutical Technical College，Changsha 410128，Hunan，China；3.College of Animal Science and Technology，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，Hunan，China；4.Veterinary Faculty，Hunan Agricultuial University，Changsha410128，Hunan，China）

To study on the anti -tumor effect and mechanism of pseudobulbus cremastrae seu pleionespolysaccharide on mice with H22 hepatocellular carcinoma. The solid tumor of H22 were established to observethe anti-tumor effect of pseudobulbus cremastrae seu pleiones polysaccharide. The thymus index and spleenindex were used to analyze the influence. The serum interleukin-2 （IL-2） and tumor necrosis factor-alpha（TNF-α） levels were detected by ELISA.SABC Immunohistochemical method to observe the Bcl-2 expressionlevel. The solid tumor inhibition ratio of low， middle and high dose of pseudobulbus cremastrae seu pleionespolysaccharide treated groups were 43.74 %，37.57 %，30.76 %，respectively， Increases in serum IL2，TNFαactivity， could control the expression of Bcl -2. pseudobulbus cremastrae seu pleiones polysaccharide couldinhibit the H22 solid tumor on mice with not a dose- dependent and no obvious side effect. The probable route ofinhibitory effect of it on mice with H22 solid tumor is immune-enhancement and acceleration of cell apoptosis.

anti-tumor； pseudobulbus cremastrae seu pleiones polysaccharide； mice with H22 hepatocellularcarcinoma； Bcl-2

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.07.006

2014-12-02

中日政府間國(guó)際合作項(xiàng)目（2011DFA30490-2）

徐小娟（1987—），女（漢），在讀碩士，研究方向：營(yíng)養(yǎng)與健康。

*通信作者：賀建華，男，教授，博士，研究方向：營(yíng)養(yǎng)與健康。