李 耿, 劉曉志, 王志明, 高 健
華北制藥集團新藥研究開發(fā)有限責(zé)任公司, 抗體藥物研制國家重點實驗室, 石家莊 050015
雙特異性抗體藥物應(yīng)用進展
李 耿, 劉曉志, 王志明, 高 健*
華北制藥集團新藥研究開發(fā)有限責(zé)任公司, 抗體藥物研制國家重點實驗室, 石家莊 050015
基因工程的飛速發(fā)展推動了新型雙功能抗體藥物的成功研制。目前雙功能抗體藥物主要應(yīng)用于腫瘤的免疫治療、自身免疫疾病和感染類疾病的治療,在組織再生和臨床診斷領(lǐng)域也有應(yīng)用。就雙特異性抗體的發(fā)展史進行了簡要回顧,對其在免疫治療、組織再生和臨床診斷等領(lǐng)域中的應(yīng)用進展進行了綜述,并展望了未來的發(fā)展方向,以期為新型雙特異性抗體藥物的研制提供參考。
BiTE(T-細(xì)胞的雙特異抗體);雙特異性抗體;免疫治療;組織再生
1997年,雙特異IgG樣抗體的概念被提出,Coloma等[1]將具有不同結(jié)合特異性的單鏈區(qū)連接到IgG重鏈的C末端,和通常意義上的抗體分子不同,他們具有雙重的結(jié)合功能。最初由于技術(shù)障礙,導(dǎo)致雙特異抗體僅用于科學(xué)研究。然而,隨著技術(shù)的飛速進步, 極大地促進了工程、生產(chǎn)和重組蛋白衍生品的發(fā)展,雙特異抗體的研究被重新激活。至今,用于治療的各種雙特異抗體處于研發(fā)的不同階段。近年來,雙特異性抗體在腫瘤免疫治療方面和組織再生領(lǐng)域取得了不容忽視的成就。本文介紹了雙特異性抗體的發(fā)展歷程及其類型,并綜述了雙特異性抗體在免疫治療、組織再生和臨床診斷中的應(yīng)用,以期為雙特異性抗體藥物的研發(fā)提供參考。
1.1 雙特異性抗體的發(fā)展歷程
1961年,Nisonoff 和 Rivers[2]將不同特異性的兩個單價抗體制劑進行氧化重組得到了雙特異性抗體,第一次對雙特異性抗體進行了描述。1975年,雜交瘤技術(shù)建立,該項技術(shù)可用于生產(chǎn)具有預(yù)期特異性的單克隆抗體。20世紀(jì)80年代,Milstein研究團隊發(fā)現(xiàn),將兩個不同雜交瘤同體細(xì)胞融合雜交,可以用于雜交雙特異性分子的生產(chǎn)。通過體細(xì)胞雜交產(chǎn)生的多種抗體用于腫瘤的免疫治療,例如,用于富集效應(yīng)細(xì)胞靶向腫瘤細(xì)胞的進攻。雙特異性抗體藥物開始在治療中得到應(yīng)用,這種抗體可以富集效應(yīng)性T細(xì)胞靶并進攻腫瘤細(xì)胞[3]。但終因臨床試驗中的效率低、免疫原性和嚴(yán)重不良反應(yīng)等,沒有達到預(yù)期效果。這些缺點曾一度導(dǎo)致20世紀(jì)90年代人們對這一類分子喪失了興趣。
兩個抗體分子間的偶聯(lián)是通過化學(xué)或生物學(xué)方法實現(xiàn)的,如化學(xué)偶聯(lián)或基因重組。之前的策略主要集中在使用雙特異性抗體片段,例如Fab抗體分子的設(shè)計策略,利用人源化和全人源抗體進行化學(xué)偶聯(lián)生產(chǎn)雙特異性抗體,而不是使用基因工程生產(chǎn)[4]。之后的分子連接策略是使用基因工程生產(chǎn)重組的雙特異性抗體,包括如缺失恒定區(qū)的小型雙特異性抗體和包含恒定區(qū)的IgG樣雙特異性抗體?;蛑亟M的分子設(shè)計有較大的自由性,例如調(diào)節(jié)分子大小和結(jié)合價。隨著抗體工程和新技術(shù)的發(fā)展,在21世紀(jì)初,有關(guān)雙特異性抗體的研究被重新啟動[5]。除了用于癌癥免疫治療中的效應(yīng)細(xì)胞富集,雙特異性抗體還被用于放射免疫治療,以及攻擊兩個疾病相關(guān)的雙靶向策略。現(xiàn)代的基因工程可以設(shè)計生產(chǎn)具有特定組成的重組雙特異性抗體藥物,并具有更好的穩(wěn)定性。因此,制藥領(lǐng)域恢復(fù)了對雙特異性抗體研究的興趣,同時許多公司也建立了研究計劃。2009年批準(zhǔn)用于治療惡性腹水的第一個雙特異性抗體藥物上市,用于富集效應(yīng)細(xì)胞并靶向EpCAM陽性的腫瘤細(xì)胞。隨后,越來越多的雙特異性抗體藥物進入臨床和臨床前研究。
1.2 雙特異性抗體的類型
之前的研究已經(jīng)證實了多種類型的雙特異性抗體具有很好的臨床應(yīng)用前景。隨即引發(fā)了制藥公司極大的興趣,羅氏公司、輝瑞制藥、基因泰克、賽諾菲、艾伯維、日本中外制藥和安進公司等都在進行雙特異性抗體藥物的研發(fā)。最初,將兩個純化的單克隆抗體化學(xué)合成為一個雙特異性抗體分子,或者通過融合兩個雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)雙特異IgG分子。在過去的二十年中,基因工程設(shè)計了50多種不同結(jié)構(gòu)類型的雙特異性抗體分子用于藥物研發(fā)[6]。這些都給雙特異性抗體分子的治療和診斷應(yīng)用帶來了革命性的發(fā)展,并可以使研究者調(diào)整藥物分子的大小、化合價、半衰期和雙特異性抗體分子的生物分布等,以滿足靶向藥物的特殊要求。一般來說,雙特異性抗體可以分為兩種主要的類型,帶有Fc片段的類型和缺少Fc片段的類型,后者通常小于IgG和IgG樣的雙特異性抗體分子。
制備帶有Fc片段的雙特異性抗體可以利用純化IgG的既有方法,同時也具有較好的溶解性和穩(wěn)定性。此外,F(xiàn)c片段的存在也有利于一些生物效應(yīng)的實現(xiàn),例如細(xì)胞毒性(antibody-dependent cellular cytotoxicity,ADCC)和補體結(jié)合(complement fixation,CDC)效應(yīng)等,并且因其分子量大和FcRn介導(dǎo)的循環(huán)過程還可以增加其半衰期[7]。通過進一步的基因工程改造也可以實現(xiàn)一些其他性質(zhì),例如消除ADCC或CDC效應(yīng),但同時保留其長半衰期的屬性。
相比之下,缺少Fc片段的雙特異性抗體,完全依賴其與抗原結(jié)合發(fā)揮治療作用。在同一個表達細(xì)胞中,可以實現(xiàn)雙特異性抗體IgG分子的不同重型鏈和輕型鏈的表達和組裝。缺少Fc片段的雙特異性抗體,因其分子小,很容易被機體清除,需要頻繁注射。但其體積小,有利于組織滲透用于腫瘤治療。通過結(jié)合聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG),或使用擬PEG多肽或白蛋白也可以實現(xiàn)半衰期的延長。
2.1 雙特異性抗體在免疫治療中的應(yīng)用
抗體應(yīng)用是一個完善并迅速增長的藥物市場,至少有45個以抗體為基礎(chǔ)的產(chǎn)品在市場上銷售,2013年全球銷售總額達630億美元。抗體藥物臨床和商業(yè)的巨大成功,極大的刺激了包括雙特異性抗體在內(nèi)的下一代抗體藥物的研發(fā)。
當(dāng)前研發(fā)的連接細(xì)胞毒性T-細(xì)胞的雙特異性抗體藥物被稱為BiTE(bispecific T cell engager),特異結(jié)合CD3陽性T細(xì)胞的BiTE藥物在惡性疾病的動物模型和人類臨床試驗中證實了它的有效性[8]。對于腫瘤治療,利用患者自身的免疫系統(tǒng)攻擊腫瘤細(xì)胞的策略,較當(dāng)前的化療具有明顯優(yōu)勢。但是,這種策略因為特定的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞數(shù)量有限,限制了其抗腫瘤作用的發(fā)揮。起初人們使用淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞或腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞來進行免疫治療,但是收效甚微。后來,在進行細(xì)胞免疫治療前,將T細(xì)胞體外擴增到3×1011個細(xì)胞,再將T細(xì)胞和BiTE抗體一起輸入病人體內(nèi)。免疫效應(yīng)細(xì)胞和BiTE抗體在體外的孵育組裝,可以提供大量具有靶向的效應(yīng)細(xì)胞并有效降低游離的抗體量。BiTE抗體設(shè)計目標(biāo)是細(xì)胞依賴激活T細(xì)胞和臨時性激活T細(xì)胞并溶解癌細(xì)胞。此外,同時結(jié)合CD3和EGFR的BiTE藥物,可以克服單獨使用西妥昔單抗的一些限制。
工程化的雙特異性抗體開辟了許多潛在治療應(yīng)用的藥物研究,雙特異性抗體藥物時代即將到來?,F(xiàn)被批準(zhǔn)用于治療的雙特異性抗體藥物有catumaxomab(Removab ?,抗EpCAM和抗CD3)和blinatumomab(Blincyto ?,抗CD19和抗CD3),另有30余種的雙特異性抗體藥物處于臨床開發(fā)階段。這些雙特異性抗體藥物用于富集T細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞,但多數(shù)藥物用于介導(dǎo)兩種不同疾病靶點如細(xì)胞表面受體、可溶性配體及其他蛋白間的相互作用。利用抗體的模塊化結(jié)構(gòu)設(shè)計的雙特異性抗體藥物超過了60種,這其中的雙特異性抗體藥物具有不同屬性,如分子量、抗原結(jié)合位點的數(shù)目、不同結(jié)合位點之間的空間關(guān)系、單一抗原效價、支持二次免疫功能和藥代動力學(xué)的半衰期等。這些具有不同屬性的藥物,可以用于滿足臨床藥物的不同使用需求。
還有一些雙抗體藥物用于非癌癥治療,如自身免疫疾病等。正如癌癥的治療,往往尋求兩個獨立靶點的“共簇效應(yīng)”,而不是簡單的靶向兩個獨立的疾病相關(guān)蛋白。Xencor公司的XmAb5871(處于Ⅱ期臨床),用于結(jié)合CD19(B細(xì)胞受體輔助蛋白)和CD32B(B細(xì)胞的抑制性受體)。因為B細(xì)胞受體觸發(fā)CD32B介導(dǎo)的負(fù)反饋調(diào)節(jié)機制,抑制人體的免疫系統(tǒng)功能,可用于治療自身免疫性疾病。利用兩個單抗的簡單結(jié)合藥物,則不會產(chǎn)生這種受體間的“共簇效應(yīng)”。雙特異抗體藥物較一般抗體具有的優(yōu)勢是抗體親和力。 “親和力假說”認(rèn)為,雙特異抗體藥物更適合結(jié)合同一個細(xì)胞上的兩個靶點,而一般抗體則會導(dǎo)致結(jié)合的混亂。同時,治療自身免疫性疾病的挑戰(zhàn)是需要長期治療,因此對藥物安全和有效性的要求更高[9]。因此,在同等條件下,雙特異抗體藥物更安全有效。
受體酪氨酸激酶(RTK),如Her蛋白家族成員、胰島素樣生長因子受體、腫瘤細(xì)胞的生長刺激或調(diào)節(jié)蛋白。如在癌癥治療中使用的靶向HER1的Cetuximab (Erbitux?) 和Panitumumab (Vectibix?),及靶向HER2的Trastuzumab (Herceptin?) 和 Pertuzumab (Perjeta?)。然而,一個信號通路阻滯會導(dǎo)致另一個信號通路的切換,通過這種方式癌細(xì)胞可以解除信號通路的生長抑制。但是雙特異抗體藥物可以同時干擾兩個(或更多的)RTK信號通路,從而減少這種逃逸機制的可能,可有效提高療效。針對參與炎癥途徑的受體或配體,可以使用類似方式阻斷促炎癥信號,用于治療炎癥或自身免疫性疾病。
2.2 雙特異性抗體在組織再生中的應(yīng)用
對于組織再生和腫瘤治療,細(xì)胞療法是一個潛在的策略。對于組織再生,干細(xì)胞需要靶向到達受損區(qū)域進行修復(fù);而對于腫瘤治療,細(xì)胞毒性T細(xì)胞也需要定向到達腫瘤細(xì)胞,再對腫瘤細(xì)胞進行清除。例如,雙功能抗體同時識別位于T-細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞上的抗原,這樣就在空間上將兩者間接連在一起,進而完成了T-細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的溶解。雙功能抗體同時具有兩個不同單克隆抗體的性質(zhì),使其具有了許多潛在的應(yīng)用可能。
干細(xì)胞移植修復(fù)心臟的療效受到經(jīng)遷移、灌輸、增殖到損傷心肌部位的干細(xì)胞數(shù)目的限制。為了解決這個問題,Lum等[10]研究了雙特異性抗體的造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cells,HSC)是否靶向修復(fù)受損的心肌。移植骨髓中純化得到CD34陽性細(xì)胞使治療效果得到明顯改善。該團隊構(gòu)建的雙特異性抗體可以選擇性的同CD45和肌球蛋白輕鏈-1(myosin light chain-1,MLC-1)相結(jié)合,CD45表達在CD34+HSC細(xì)胞上,而MLC-1是肌細(xì)胞內(nèi)執(zhí)行肌細(xì)胞收縮的基本結(jié)構(gòu),當(dāng)肌細(xì)胞缺血性損傷時就暴露在細(xì)胞膜上;MLC-1可以被認(rèn)為是心肌損傷的生物標(biāo)志物。
此外,Zhao等[11]的一項研究表明,使用結(jié)合有雙特異性抗體的CD34陽性細(xì)胞可以定位在小鼠心肌缺血的梗死部位。這種定位可以改善心室功能,增強血管生成和減少纖維化。此外,這種注射還可以避免心肌重構(gòu)的風(fēng)險,結(jié)合雙特異性抗體的CD34陽性細(xì)胞,不僅可以增加CD34陽性細(xì)胞的數(shù)量,還可以改善左心室組織的功能。
2.3 雙特異性抗體在臨床診斷中的應(yīng)用
除了在治療領(lǐng)域的應(yīng)用,雙特異抗體藥物因其高度敏感性和特異性,被用于感染性疾病和癌癥的臨床診斷或醫(yī)學(xué)影像等。用于檢測的雙特異抗體藥物,其中的一個結(jié)合域同被檢測病原體、病毒或腫瘤細(xì)胞結(jié)合,另一結(jié)合域同根過氧化物酶或堿性磷酸酶結(jié)合。這增加了方法的靈活性并且可以一步完成,無需預(yù)先抗體標(biāo)記。雙特異性抗體的腫瘤成像可以兩步完成,使用雙特異性抗體對腫瘤細(xì)胞進行預(yù)標(biāo)記,再注射放射性同位素成像。這種方法與放射性同位素標(biāo)記抗體成像相比,特異性、靈敏度更好,并且背景信號低,這是因為未結(jié)合的放射性同位素可以被迅速清除。雙特異性抗體可以同時結(jié)合特定抗原和檢測部分的能力,使他們成為檢測分析中具有雙功能免疫能力的優(yōu)良探針。同傳統(tǒng)單克隆抗體相關(guān)的優(yōu)勢包括:設(shè)計靈活,一步法替代傳統(tǒng)的多步操作;避免了對試劑(如二抗等)的標(biāo)記,降低了修飾酶或抗體的化學(xué)危害;抗體被應(yīng)用于各種不同的免疫診斷檢測平臺,如:微孔板、棒、條、濾盤和旋轉(zhuǎn)盤型的分析系統(tǒng)中。因為簡化了檢測步驟,雙特異性抗體已經(jīng)應(yīng)用于上述檢測中。雙特異性抗體當(dāng)前被應(yīng)用于開發(fā)簡單、快速和高度敏感的細(xì)菌病毒感染及癌癥診斷等。
處于臨床研究階段的雙特異性抗體主要集中在癌癥治療和組織再生領(lǐng)域。主要目標(biāo)是同時解決處于病理生理過程的不同靶點,從而提高治療效果。其他需要解決的重要方面是,確定最優(yōu)應(yīng)用模式和調(diào)節(jié)PK屬性,尤其是小型雙特異性抗體分子。在使用BiTEs藥物時,需要使用靜脈注射的方式控制血藥濃度。通過PEG化或白蛋白綁定的策略可以延長藥物的半衰期。在癌癥治療中,雙特異性抗體用于將免疫效應(yīng)細(xì)胞重新定位到破壞腫瘤細(xì)胞(癌癥免疫療法),或通過受體或配體失活和兩個不同的信號級聯(lián)。越來越多的新策略融入雙特異性抗體藥物的研發(fā),越來越多的雙特異性抗體藥物進入臨床試驗,可能很快就有新的藥物被批準(zhǔn)上市。雙特異性抗體藥物的終極目標(biāo)是作為制劑(如藥物、效應(yīng)細(xì)胞)和靶標(biāo)(如腫瘤、組織損傷)之間的鏈接,BiTE藥物是高效并具有代表性的一類免疫治療藥物。
2014年12月FDA批準(zhǔn)的安進公司生產(chǎn)的Blinatumomab是第一個BiTE類藥物,用于急性淋巴細(xì)胞白血病的治療。國內(nèi)的雙特異性抗體研究也取得了很多成果,郭寧教授[12]成功構(gòu)建了抗HER2 與CD16 的雙功能抗體;李博華等[13]利用Trastuzmab和Pertuzumab可變區(qū)構(gòu)建的雙功能抗體,能夠有效抑制ErbB2 的異二聚體化,該抗體對于Trastuzumab 耐藥株治療有效;寇庚等[14]構(gòu)建了靶向VEGF和骨橋蛋白的雙特異性抗體;張大鵬等[15]構(gòu)建了可同時結(jié)合VEGF-A和VEGF-C的雙特異性抗體,均能有效抑制腫瘤血管新生,在體內(nèi)顯示出較好的抑瘤效果;張濤等[16]研發(fā)的雙特異性抗體,能同時結(jié)合人體內(nèi)結(jié)直腸癌細(xì)胞靶點CD133和人體T細(xì)胞CD3靶點,動物實驗研究顯示其能夠顯著抑制高表達CD133腫瘤細(xì)胞的生長,并能促進其凋亡。在未來,雙特異性抗體必將在腫瘤免疫治療、組織再生、臨床檢測等領(lǐng)域中發(fā)揮重要的作用。在設(shè)計構(gòu)建結(jié)構(gòu)更為簡單穩(wěn)定的雙特異性抗體、選擇高效表達系統(tǒng)、尋求更簡化的生產(chǎn)步驟等方面仍需繼續(xù)努力探索。
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Application of Bispecific Antibody Drugs
LI Geng, LIU Xiao-zhi, WANG Zhi-ming, GAO Jian*
StateKeyLaboratoryofAntibodyResearch&Development;NewDrugResearchandDevelopmentCompanyLTD.,NorthChinaPharmaceuticalCorporation,Shijiazhuang050015,China
Rapid development of gene engineering has led to the success of the new type of bispecific antibody drugs. At present, the application of dual bispecific antibody drugs was in tumor immunotherapy, autoimmune diseases, infectious diseases, tissue regeneration and clinical diagnosis. In this paper, the brief development history was introduced, and applications of bispecific antibodies in immunological therapy, tissue regeneration and clinical diagnosis were reviewed. At last, development prospect was forecasted. The paper was expected to provided reference for the research and development of new bispecific antibody drugs.
BiTE (bispecific T cell engager); bispecific antibodies; immunotherapy; regenerative medicine
2015-09-08; 接受日期:2015-09-25
國家科技重大專項項目( 2012ZX09101313) ;河北省重大科技成果轉(zhuǎn)化專項(13042404Z)資助。
李耿,工程師,主要從事蛋白藥物研發(fā)。E-mail: 13073182298@163.com。*通信作者:高健,高級工程師,主要從事蛋白藥物研發(fā)。E-mail: gaojian3993@aliyun.com
10.3969/j.issn.2095-2341.2015.06.03