褐藻多糖的分離提取及生理活性研究進展

吳 澤, 魏琦峰, 邱慶慶, 任秀蓮

哈爾濱工業(yè)大學(威海)海洋科學與技術(shù)學院,山東 威海 264200

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褐藻多糖的分離提取及生理活性研究進展

吳 澤, 魏琦峰, 邱慶慶, 任秀蓮*

哈爾濱工業(yè)大學(威海)海洋科學與技術(shù)學院,山東 威海 264200

褐藻多糖是海藻膠、褐藻糖膠和褐藻淀粉的統(tǒng)稱，主要存在于褐藻中。褐藻糖膠作為其主要的生理活性物質(zhì)，主要由L-巖藻糖和硫酸酯基組成，具有抗氧化、抗凝血、防癌抗腫瘤、抗病毒和消炎等活性。綜述了褐藻多糖的提取分離方法和褐藻糖膠的生理活性研究進展，以期為褐藻多糖的應(yīng)用提供參考。

褐藻多糖；褐藻糖膠；提取分離；生物活性

近年來，從海洋尤其是海藻中提取生物活性物質(zhì)，用作功能膳食和營養(yǎng)食品的開發(fā)引起了人們極大的關(guān)注[1]。全球海藻產(chǎn)業(yè)每年產(chǎn)值高達55～60億美元，其中食品產(chǎn)業(yè)占據(jù)了約50億美元的市場份額，其余由藻膠、化肥、動物飼料、化妝品和藥品產(chǎn)業(yè)分攤[2]。海藻多糖是一種廣泛應(yīng)用的高附加值、高活性天然產(chǎn)物，其中又以褐藻多糖為代表。褐藻多糖的提取原料主要有海藻(如褐藻)和海洋棘皮動物(如海膽、海參等)兩大類[3]。褐藻在海洋中儲量大、可再生，使得褐藻多糖的分離提取、結(jié)構(gòu)測定和生理活性成為目前研究的主要內(nèi)容[4]。這里所指的褐藻多糖是廣義的，狹義范圍的褐藻多糖主要由褐藻淀粉、褐藻膠和褐藻糖膠3部分組成，其中褐藻膠是褐藻酸及褐藻酸鹽衍生物的統(tǒng)稱，代表性物質(zhì)為褐藻酸鈉。褐藻糖膠，別稱褐藻多糖硫酸酯(FCSPs)，是一種含有大量L-巖藻糖和硫酸酯基的特殊多糖[5]。褐藻多糖表現(xiàn)出的高生物活性往往是由褐藻糖膠提供的。

由于褐藻糖膠有著廣泛的生理活性，在醫(yī)學等領(lǐng)域有著重要的應(yīng)用價值。但是由于褐藻糖膠的活性與其分子量、單糖組分、硫酸鹽含量和硫酸酯基的組成有關(guān)，因此在分離過程中容易造成硫酸鹽的損失以及目標化合物結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變，褐藻多糖的提取分離方法是制約其廣泛應(yīng)用的瓶頸。本文綜述了褐藻多糖的分離提取方法、褐藻糖膠的生理活性等研究現(xiàn)狀，以期為褐藻多糖的研發(fā)與應(yīng)用提供參考。

2 褐藻多糖的提取分離現(xiàn)狀

2.1 海藻預(yù)處理工藝

海藻中褐藻多糖硫酸酯的含量只占少數(shù)，在提取過程中為了避免對其他成分的協(xié)同提取，預(yù)處理工藝很有必要[6]。在水溶液中，海藻的細胞結(jié)構(gòu)容易被水解，通常使用甲醇∶氯仿∶水=4∶2∶1的混合溶液作為預(yù)處理溶液，此三相體系可以除去脂質(zhì)、萜類和酚類物質(zhì)[7]。生物黃質(zhì)、酚類物質(zhì)較易結(jié)合在褐藻多糖硫酸酯及褐藻酸鹽上，產(chǎn)生協(xié)同提取效應(yīng)，一般采用甲醛對原料進行預(yù)處理[8]。乙醛主要用于除去原料中的葉綠素和甘露醇，通常是將乙醛溶于較高濃度的乙醇水溶液中，避免了預(yù)處理過程中褐藻多糖硫酸酯的初次提取[9,10]。上述預(yù)處理工藝不會破壞目標產(chǎn)物的分子結(jié)構(gòu)，但甲醛可能會引發(fā)蛋白質(zhì)與多酚或者核酸之間的共價鍵合，產(chǎn)生大分子的復(fù)雜物質(zhì)，這種物質(zhì)容易與目標產(chǎn)物反應(yīng)，降低最終得率[11]。

2.2 褐藻多糖的分離提取

褐藻多糖提取的相關(guān)研究最早出現(xiàn)在1913年，Kylin[12]對各種海藻采取先酸提后純化的方法得到了褐藻多糖硫酸酯，主要成分是巖藻糖、甘露醇和海藻酸等物質(zhì)。早期的FCSPs提取一般都采用稀酸，如乙酸和鹽酸進行所謂的初步提取以水解非FCSPs多糖，在不同的研究中具體的提取與純化方法都經(jīng)過各自優(yōu)化有一定不同。傳統(tǒng)的褐藻多糖提取法主要有酸提法、水提法和CaCl2法，新近發(fā)展的提取方法主要有超聲波、微波輔助提取法和酶輔助提取法。

2.2.1 傳統(tǒng)提取法 Marais等[13]將43 g褐藻研磨后常溫提取，再用含1% CaCl2的0.01 mol/L NaCl在70℃下提取，重復(fù)2次后合并提取物?；旌衔镆哉麴s水透析，濃縮至100 mL，得到粗多糖提取物。粗提物隨后以乙醇沉淀，離心收集得粗褐藻多糖。純化后進行成分分析，結(jié)果表明，得到的褐藻多糖僅含有L-巖藻糖和硫酸鹽。結(jié)合甲基化、紅外和核磁共振分析，結(jié)果表明得到的褐藻多糖中以α-1,3-糖苷鍵為主，僅有少量的1,4-糖苷鍵。支鏈主要存在于α-1,3-糖苷鍵中3號所在糖單元的2號位上，以巖藻糖殘基為主。Duarte等[14]在室溫、機械攪拌條件下從海藻粉末中提取褐藻多糖，反應(yīng)完成后離心，上清液先濃縮再以蒸餾水透析，之后經(jīng)離心分離得粗多糖。粗多糖以乙醇沉淀，接著用CaCl2處理之后再以氯化十六烷基吡啶(pH 7)沉淀。所得沉淀溶解在3 mol/L的CaCl2溶液中以除去吡啶鹽，再以乙醇沉淀。不溶于乙醇的物質(zhì)懸浮在水中，離心得到水溶性與水不溶性組分，水溶性多糖得率為0.4%(0.5 mol/L NaCl和水透析)，水不溶性多糖經(jīng)乙二醇雙四乙酸(EGTA)(1%，pH 7)、0.5 mol/L NaCl和水透析后又恢復(fù)其可溶性，最終得率為0.3%。Cumashi等[15]在85℃條件下以2%的CaCl2從脫脂后的干燥海藻中提取褐藻多糖硫酸酯5 h，得到的清液用塞太弗侖(cetavlon)進行沉淀，之后再以鈣鹽洗滌掉塞太弗侖鹽，堿洗去乙?；耐瑫r將褐藻多糖硫酸酯轉(zhuǎn)化為硫酸鹽。檢測所得褐藻多糖硫酸酯的主要成分為巖藻糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、糖醛酸及硫酸鹽。

Ponce等[16]以貍藻為原料，分別用蒸餾水、2%CaCl2、pH為2的稀鹽酸作溶劑提取褐藻多糖硫酸酯。各體系都是先進行常溫提取再在70℃條件下提取，所得產(chǎn)品得率和性質(zhì)相近。分析結(jié)果表明，在常溫下提取得到的褐藻多糖硫酸酯以L-巖藻糖、半乳糖和硫酸酯基為主；70℃下的提取物以巖藻糖為主，并伴有少量的雜單糖(D-甘露糖、D-半乳糖和D-木糖)和較大量糖醛酸及微量硫酸酯基。常溫提取得到的褐藻多糖硫酸酯表現(xiàn)出了較強的抗Ⅰ型、Ⅱ型熱疹病毒活性。Hemmingson等[17]以風干的裙帶菜葉片(70∶30，w/w)為原料，1%H2SO4(w/w)溶液室溫提取2次，每次6 h，每20 g原料中加入1 L H2SO4。過濾后的提取液以NaOH調(diào)節(jié)至中性，鹽以及小分子物質(zhì)用截留分子量為14 kDa的透析袋除去，再經(jīng)低壓冷凍干燥得褐藻多糖硫酸酯，得率為4.5%。

Li等[18]采用熱水提取褐藻多糖硫酸酯，經(jīng)DEAE瓊脂糖膠和CL-6B色譜柱純化得到6個組分，每個組分均由大量巖藻糖、甘露糖、半乳糖、硫酸酯基和糠醛酸組成，所得多糖的平均分子質(zhì)量為25～950 kDa。提取在70℃的水浴中進行，所得產(chǎn)物經(jīng)乙醇沉淀后再經(jīng)CaCl2進一步除去褐藻酸，最終的褐藻多糖硫酸酯得率為0.78%，硫酸酯基含量18.6%。

Ale等[19]對傳統(tǒng)法所涉及的影響因子(溫度、時間和酸度)進行了定量考察，原料粉碎后經(jīng)甲醇∶氯仿∶水=4∶2∶1的溶液預(yù)處理以除去色素和酚類化合物。通過響應(yīng)面優(yōu)化法確立了各項參數(shù)，發(fā)現(xiàn)一步提取法在90℃水浴中200 r/min下提取4 h，HCl濃度為0.03 mol/L時所得的FCSPs得率最高，可達7%。所得褐藻多糖硫酸酯的主要組分為巖藻糖、半乳糖及葡萄糖醛酸。提取時間越短，多糖得率越低，巖藻糖含量越高。當HCl濃度高于0.2 mol/L時，溫度與時間的增加不利于多糖的多步提取。

2.2.2 新提取方法 相較于傳統(tǒng)的酸提、水提醇沉和鹽提法，近些年來發(fā)展出了更為高效、快速的多糖提取方法。微波法、超聲波法和酶輔助提取法都因其各自優(yōu)點受到了廣泛的研究。Rodriguez等[20]以微波輔助提取法提取褐藻多糖硫酸酯。褐藻粉末以1∶25(g∶mL)的料液比加入蒸餾水后置于提取管中，懸浮液在120 psi的壓力下輻射提取1 min之后，迅速置于冰水浴冷卻，懸浮液經(jīng)離心后殘留物收集備用。上清液加入1%CaCl2后在4℃下靜置過夜除去海藻酸鹽，離心后上清液以兩倍體積乙醇純化，4℃貯存8 h。乙醇沉淀后的多糖在8 500 r/min、4℃條件下離心15 min得成品。最終，褐藻糖膠得率18.22%，褐藻消化率51.36%，微波酶解后總糖得率27.62%，硫酸根含量21.09%。Quitain等[21]采用微波輔助水熱法提取褐藻多糖硫酸酯。先以4 mL/min的超臨界CO2流速提取原料中的脂質(zhì)后，殘留物用于提取褐藻多糖硫酸酯。經(jīng)微波加熱降解之后，在140℃左右提取15～60 min得13 kDa的小分子量目標產(chǎn)物，在110℃左右提取得240 kDa的大分子量目標產(chǎn)物，當溫度高于160℃之后未提取到褐藻多糖硫酸酯。Kai等[22]采用超臨界CO2和微波加熱法從裙帶菜中提取褐藻多糖硫酸酯和巖藻黃質(zhì)。在313 K、40 mPa的條件下超臨界提取180 min，巖藻黃質(zhì)提取率可達75%。以微波水熱法提取巖藻黃質(zhì)殘留物，在383 K的溫度下提取得到大分子量褐藻多糖硫酸酯，在413 K的溫度下提取得到小分子量褐藻多糖硫酸酯(5～30 kDa)。Mussatto等[23]采用自水解法從褐藻中提取褐藻多糖硫酸酯。在180℃的條件下自水解20 min后，褐藻多糖得率最高為16.5%(w/w)。所得多糖的主要組分為巖藻糖和半乳糖(摩爾比70∶30)，硫酸酯基含量高于20%。

3 褐藻糖膠生理活性

3.1 抗凝血和抗氧化活性

褐藻糖膠具有廣泛的生理活性，但目前研究最多的還是其強效抗凝血性。許多研究表明，褐藻糖膠的抗凝血性主要與其硫酸酯基的位置、分子量的大小和糖含量有關(guān)[24]。Chevolot 等[25]的研究表明硫酸酯基只有存在O-2和O-3位時才能表現(xiàn)出抗凝血活性。一般表現(xiàn)出較高抗凝血活性的褐藻糖膠的分子量在50～100 kDa之間[26]。Cumashi等[15]研究了9類褐藻中提取的褐藻糖膠的抗凝性能。除了奧氏海藻，其余海藻中的多糖都具有大量的2-O-α-D-吡喃葡萄糖基分支結(jié)構(gòu)，并且通過活化部分凝血酶時間(APTT)試驗表現(xiàn)出了抗凝血性能。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，只有L.saccharina、L.digitata、F.serratus、F.distichus和F.evanescens5類海藻中提取的褐藻糖膠表現(xiàn)出了較強的抗凝血酶活性。Chandía等[27]將自由基解聚后的多糖與原多糖的抗凝血性和酶活抑制性進行了比較。凝血酶時間(TT)試驗結(jié)果表明兩者皆有抗凝血性，但解聚后的褐藻糖膠抗凝血活性明顯下降。在煙葉中，兩者對苯丙氨酸解氨酶、脂肪氧化酶和谷胱甘肽酶的酶活表現(xiàn)出了較強抑制性。Wang等[28]將提取的低分子褐藻糖膠經(jīng)由陰離子交換色譜進行分級，得到3個組分DF1、DF2和DF3，對各組分的抗凝血及抗氧化活性進行了分析。相較于BHA、BHT及α-生育酚，各組分褐藻糖膠都有更強的超氧游離基清除作用和更低的半數(shù)有效濃度(EC50)。羥基自由基清除能力、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)值與多糖的濃度密切相關(guān)。DFPS及DF1具有較強的還原能力，DF2和DF3的還原能力較低。APTT、凝血酶原時間(PT)和TT試驗的結(jié)果表明，各組分多糖的抗凝血活性與硫酸酯基的含量有關(guān)。Wijesinghe等[29]的研究顯示褐藻糖膠能顯著延長凝結(jié)時間，APTT和TT試驗結(jié)果表明這與褐藻多糖的用量和時間有關(guān)。尾出血試驗表明褐藻多糖能將出血時間從900 s延長到1 800 s。

3.2 抗病毒性

褐藻糖膠在生物體內(nèi)外都有抗病毒性，相較于其他抗病毒藥物，在臨床醫(yī)學上褐藻糖膠的毒性要低得多。Hayashi等[30]的研究發(fā)現(xiàn)從裙帶菜中提取得到的褐藻糖膠具有很強的單純皰疹Ⅰ型病毒(HSV-1)抑制性。小鼠活體試驗結(jié)果表明，用5-氟脲吡啶抑制小鼠自身免疫之后，口服褐藻糖膠能顯著提高HSV-1細胞的自然殺傷(NK)活性和增強細胞毒性T淋巴細胞(CTL)活性，同時中和抗體的釋放也明顯增加。Synytsya等[31]對感染了A型禽流感病毒(H5N3和H7N2)的小鼠進行了試驗，結(jié)果表明褐藻糖膠能抑制病毒復(fù)制、促進抗體產(chǎn)出。口服試驗顯著降低了病毒存活率，中和抗體及免疫球蛋白A迅速增加。Thuy等[32]研究了3種不同種類褐藻糖膠的抗艾滋病毒(HIV)活性。相近的IC50值表明3種多糖具有類似的抗HIV病毒能力，且與硫酸酯基的含量與位置無關(guān)。其與HIV病毒一起預(yù)培養(yǎng)能阻斷HIV進入目標細胞，降低感染風險。Rabanal等[33]以傳統(tǒng)酸提法得到少量galactofucans組分，試驗發(fā)現(xiàn)它是一種較溫和的HSV-1及柯薩奇B3病毒(CVB3)抑制劑，其余組分未表現(xiàn)出明顯的抗病毒活性。

3.3 抗癌、抗腫瘤活性

癌癥是醫(yī)學界最難治愈的疾病之一，通常用作癌癥治療的藥物都有毒性，它不光能殺死癌細胞還可以影響其他正常細胞組織。近年來，褐藻糖膠的抗癌、抗腫瘤活性的研究引起了研究者極大的關(guān)注。Roshan等[34]研究了褐藻糖膠對人體肝癌細胞株HepG2的抗癌效果及抗癌機理。褐藻糖膠能夠誘發(fā)細胞周期進程中的DNA合成后期(G2期)、細胞分裂期(M期)停滯及細胞死亡，同時觀察到p53基因和活性氧的增加，抑制了細胞生長。細胞死亡主要是由磷酸化的stat3因子(p-stat 3)的下降引起的。Anastyuk等[35]通過自水解法制得低分子量褐藻糖膠。天然多糖對人體惡性黑色素瘤細胞系SK-MEL-28和SK-MEL-5都表現(xiàn)出了抗癌活性，而低分子量多糖對兩系細胞都未表現(xiàn)出細胞增殖抑制活性；在抑制群落形成方面，對SK-MEL-5細胞系未表現(xiàn)出抑制性，但對SK-MEL-28細胞系表現(xiàn)出了與天然多糖相當?shù)囊种菩?70%)，這可能是由于硫酸酯基及α-1,4-巖藻糖苷鍵的存在引起的。Marudhupandi等[36]從小葉喇叭藻中提取得到褐藻糖膠，巖藻糖含量為53%，硫酸酯基含量38%。以人肺腺癌細胞(A549)系為研究對象，發(fā)現(xiàn)褐藻糖膠的體外抗癌活性主要與劑量有關(guān)，在31.25～500 μg/mL的濃度范圍內(nèi)抗癌活性可達24.9%～75.3%。Vishchuk等[37]從海帶和裙帶菜中提取褐藻糖膠。研究了它們對人體乳腺癌細胞系T-47D及黑色素瘤細胞系SK-MEL-28的抗腫瘤活性。提取到的2種多糖明顯地表現(xiàn)出了抑制腫瘤細胞增殖及群落生成的特性。

3.4 抗菌消炎

大量研究表明褐藻糖膠具有抗菌消炎活性，但是其潛在的抗菌消炎機理還不是特別清楚。Lee等[38]從深海褐藻中提取褐藻糖膠,以斑馬魚為研究模型，結(jié)果表明褐藻糖膠能通過抑制NO及活性氧的產(chǎn)出而減輕截尾誘導(dǎo)及脂多糖受激引發(fā)的炎癥。同時，褐藻糖膠可以保護斑馬魚胚胎免受內(nèi)毒素的感染。Ko等[39]從深海褐藻中分離得到3個多糖組分，研究結(jié)果表明各組分多糖均能抑制脂多糖受激型巨噬細胞(Raw 264.7)中NO的產(chǎn)出，減輕炎癥。此種效應(yīng)主要是通過降低iNOS、COX-2和促炎性細胞因子(TNF-α、IL-6和IL-1β)的傳遞實現(xiàn)的。Park等[40]發(fā)現(xiàn)褐藻糖膠能抑制BV2小膠質(zhì)細胞中由脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的NO和前列腺素E2(PGE2)生產(chǎn)過剩，弱化iNOS、COX-2、MCP-1、促炎因子(IL-1β)和腫瘤壞死因子(TNF-α)的傳遞。同時，褐藻糖膠還可以抑制核因子(NF-κB)活性，下調(diào)細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)、應(yīng)激活化蛋白激酶(JNK)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)和蛋白激酶B(AKT)的表達。

3.5 其他活性

除上述活性外，褐藻糖膠還有免疫調(diào)節(jié)、降血脂和降血糖等生理活性。Cho等[41]從孔葉藻中提取褐藻糖膠，離子交換色譜分級后得到F1和F2兩個組分。F1組分對RAW 264.7有強烈地刺激作用，可以激活NF-κB、MAPKs途徑，從而引發(fā)iNOS、COX-2和IL-10的傳遞提升NO的釋放。免疫調(diào)節(jié)功能最強的的多糖組分主要由1,3-巖藻糖苷鍵、1,2-甘露糖苷鍵、1,4-葡萄糖醛酸和硫酸酯基鍵合在巖藻糖主鏈的C-2、C-4位上。Cui等[42]的研究表明小分子量的褐藻糖膠可以保護內(nèi)皮功能、降低糖尿病小鼠血壓。Chen等[43]發(fā)現(xiàn)褐藻糖膠的攝入可以提升小鼠的運動功能和抗疲勞能力，降低血清水平，提升葡萄糖水平。Huang等[44]的研究顯示褐藻糖膠可以顯著降低低血脂小鼠中血清總膽固醇、甘油三酸脂和低密度脂蛋白膽固醇，提升高密度脂蛋白膽固醇、脂蛋白脂肪酶和膽固醇?；D(zhuǎn)移酶的活性。Raghavendran等[45]發(fā)現(xiàn)褐藻糖膠對阿司匹林等抗生素藥引發(fā)的小鼠胃黏膜損傷具有免疫調(diào)節(jié)功效。Kim等[46]研究了不同分子量褐藻糖膠對Ⅱ型糖尿病的影響，結(jié)果表明各分子量多糖均能有效預(yù)防餐后血糖上升，降低血糖水平。

4 展望

目前，褐藻多糖的提取方法已經(jīng)越來越多樣化，但更多的還是停留在實驗室研究階段，鑒于其廣泛的生理活性和良好的市場前景，開發(fā)出具有產(chǎn)業(yè)化價值的提取分離方法前景廣闊。不同原料、不同方法提取的褐藻多糖往往在生理活性、結(jié)構(gòu)功能上千差萬別，如何在提取過程中控制產(chǎn)品純度、避免結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化將成為未來研究中的一個熱點問題。

褐藻糖膠的活性與其分子量密切相關(guān)，為獲取小分子量褐藻糖膠，往往需要將所得的粗多糖進一步降解，耗時耗力且損失大，如何在提取過程中實現(xiàn)同步降解具有重要的研究意義。另一方面，褐藻糖膠的生理活性研究目前大多停留在表面，通過特定的一些試驗證明相關(guān)活性，但進一步的作用機理研究相對較少。隨著研究的深入、范圍的擴大，褐藻糖膠的活性機理研究勢在必行。

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Research Progress of the Extraction Procedures and Bioactivities of Brown Seaweed Polysaccharide

WU Ze,WEI Qi-feng,QIU Qing-qing,REN Xiu-lian*

SchoolofMarineScienceandTechnology,HarbinInstituteofTechnologyatWeihai,ShandongWeihai264200,China

Brown seaweeds polysaccharide usually contains alginate,fucoidan,laminam and mainly exist in brown seaweeds.As the main physiological active substances,fucoidan composes of L-fucose and sulfate groups.Fucoidan has different beneficial biological activities including antioxidant,anticoagulant,anti-cancer,anti-tumor,anti-virus and anti-inflammatory,etc.This paper reviewed the latest research progress of the extraction procedures and bioactivities of fucoidan,which was expected to provided reference for fucoidan application.

brown seaweeds polysaccharide; fucoidan; extraction; bioactivities

2015-05-03; 接受日期：2015-05-14

威海市科技發(fā)展計劃項目(CTBA02211003)資助。

吳澤，碩士研究生，主要從事天然產(chǎn)物提取分離研究。E-mail:wuze0612@sina.com。*通信作者：任秀蓮，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事有機酸的提取分離研究。E-mail: renxiulian@126.com

10.3969/j.issn.2095-2341.2015.03.09