實驗小鼠腸道微生物的研究現(xiàn)狀

景亞星, 白　鷺, 高煥云, 鄭振宇,

（1. 河南農(nóng)業(yè)大學生命科學學院, 鄭州　450002； 2. 河南農(nóng)業(yè)大學牧醫(yī)工程學院, 鄭州　450002）

實驗小鼠腸道微生物的研究現(xiàn)狀

景亞星1, 白鷺2, 高煥云2, 鄭振宇1,2

（1. 河南農(nóng)業(yè)大學生命科學學院, 鄭州450002； 2. 河南農(nóng)業(yè)大學牧醫(yī)工程學院, 鄭州450002）

本文就影響實驗小鼠腸道微生物菌群組成的因素以及無菌（GF）小鼠的腸道微生物研究現(xiàn)狀作了概述，為進一步了解和研究人類和動物腸道微生物提供依據(jù)。

腸道微生物； 現(xiàn)代生物技術(shù)； 無菌（GF）小鼠

動物體內(nèi)存在著種類繁多的微生物，胃腸道中的微生物菌群是一個獨特多變的生態(tài)系統(tǒng)，是現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的生態(tài)系統(tǒng)中細胞密度最高的系統(tǒng)之一［1］。定植于大腸和小腸的微生物對維持宿主功能具有重要作用, 包括宿主代謝產(chǎn)物的生成、食物中能量攝取和免疫系統(tǒng)發(fā)育等。小鼠是目前應用最廣泛、被研究的最詳細、品種最多的哺乳類實驗動物, 本文旨在概述實驗小鼠腸道微生物的相關研究現(xiàn)狀。

1　腸道微生物研究概述

動物胃腸道微生物在動物健康、營養(yǎng)、免疫等方面有舉足輕重的作用。早在19世紀法國微生物學家巴斯德就提出學說——正常菌群對宿主是有益的， 之后人們更加注重對動物胃腸道正常微生物群的組成、定植規(guī)律及其與宿主關系的研究。

動物胃腸道微生物可以參與宿主多糖、脂類和氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)的代謝，與宿主形成一個相互依賴的整體并和代謝疾病的發(fā)生有關［2,3］。正常情況下動物腸道微生物菌群處于穩(wěn)定的生態(tài)平衡狀態(tài)，從而保證機體腸道功能的正常發(fā)揮。另外，有益菌群作為腸道內(nèi)壁黏膜的特異性生物屏障，可以抑制病原菌的增殖，使腸道微生物處于穩(wěn)定平衡狀態(tài)。動物胃腸道微生物區(qū)系的穩(wěn)定平衡是宿主動物保持良好的健康狀況和發(fā)揮正常功能所必須的條件。當菌群平衡遭到破壞時會導致病理的發(fā)生，腸道菌群也會發(fā)生巨大變化從而導致菌群失調(diào)［4］。

因此，便捷高效的調(diào)控動物胃腸道微生物組成、保持動物胃腸道微生物區(qū)系平衡以及維持動物健康成為國際上的研究熱點。

1.1腸道微生物的多樣性研究

動物消化道存在著數(shù)目龐大且相對穩(wěn)定的微生物群落。菌群的多樣性能夠保證腸道微生物區(qū)系的平衡, 也提高了其適應多變環(huán)境的能力, 微生物群落能夠維持胃腸道環(huán)境相對穩(wěn)定并促進營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收?，F(xiàn)代分子生物學技術(shù)和生物信息學的快速發(fā)展為微生物多樣性的研究提供了新思路和新技術(shù)，人們采用聚合酶鏈式反應技術(shù)和高通量測序技術(shù)分離鑒定了大量的腸道厭氧微生物，完善了微生物的種類和分類系統(tǒng)，也充分證明了腸道微生物的多樣性?，F(xiàn)在己經(jīng)比較成熟的技術(shù)有遺傳指紋圖譜技術(shù)、宏基因序列分析、DNA雜交技術(shù)、指紋分析技術(shù)等，這些技術(shù)對腸道微生物群體多樣性的研究和微生物群體動態(tài)的追蹤研究有關鍵性的作用。

1.2腸道微生物功能研究

隨著研究技術(shù)的進步和對腸道微生態(tài)重視程度的增加，人們越來越多地了解腸道微生態(tài)菌群，腸道正常的微生物群落是微生物與宿主在共同進化過程中形成的、對宿主有益的群落，并且與宿主的營養(yǎng)、免疫、代謝和毒性等方面密切相關［5-7］。此外，腸道微生物可以促進腸道組織發(fā)育，其代謝產(chǎn)生的短鏈脂肪酸為腸道上皮細胞提供所需營養(yǎng)，加速上皮細胞的生長與分化。腸道內(nèi)的雙歧桿菌、梭菌、乳桿菌等微生物能合成多種蛋白質(zhì)和維生素，供宿主利用。腸道微生物還能夠促進宿主對亞油酸的吸收，促進膽固醇向類固醇方向的轉(zhuǎn)變［8］，Backhed等［9］利用無菌（GF）小鼠進行試驗，將正常小鼠的腸道細菌接種GF小鼠，于14 d后檢測，發(fā)現(xiàn)在飼喂量減少29%的情況下，體內(nèi)脂肪竟增加42%，表明腸道微生物可能與機體能量的貯存有關。腸道微生物具有抵御病原微生物侵襲、刺激機體免疫器官的成熟、激活免疫系統(tǒng)等作用，不同種類和數(shù)量的正常微生物定植在胃腸道黏膜以及分布在腸道內(nèi)容物中，形成動態(tài)微生態(tài)平衡，已有研究發(fā)現(xiàn)普通小鼠相對于GF小鼠和悉生小鼠，脂多糖刺激脾臟來源的巨噬細胞產(chǎn)生IL-12的作用明顯增強，提示完整的腸道菌群是脾臟產(chǎn)生IL-12的基礎［10］。

2　影響實驗小鼠腸道微生物菌群的因素

2.1飼糧成分對小鼠腸道菌群組成的影響

日糧是影響動物腸道菌群組成的最主要因素，包括飼料類型、物理結(jié)構(gòu)、營養(yǎng)組成以及抗生素的使用等。動物對食物營養(yǎng)的吸收不僅與自身腸道微生物的數(shù)量有關，還取決于腸道菌群的組成。隨著研究的深入，科學家已經(jīng)意識到飲食能夠顯著地改變微生物菌群的組成和豐度，飼喂不同能量的飼料發(fā)現(xiàn)不同飼糧條件下腸道內(nèi)的一些特定菌群與動物的飼料轉(zhuǎn)化率存在關聯(lián)。陳杏云等［11,12］采用高脂飲食建立肥胖菌群人源化（HFA）小鼠模型，并證實了高脂飲食明顯改變HFA小鼠腸道菌群的結(jié)構(gòu)，主要表現(xiàn)為誘導腸道內(nèi)有害菌生長繁殖。酸性條件能夠抑制大腸桿菌等有害菌的生長，卻能促進乳酸菌的繁殖，趙艷姣等［13］通過給小鼠飼喂添加不同比例的霉變飼料，觀察到葡萄糖氧化酶（GOD）能減少腸道大腸桿菌的數(shù)量，當添加GOD的量提高到0.3%，乳酸菌數(shù)量得到提高。

2.2日齡對小鼠腸道菌群組成的影響

宿主的年齡差異影響腸道微生物的結(jié)構(gòu)，腸道菌群的豐度會隨著宿主的生理變化而變化，有研究報道［14,15］，從幼年到成年腸道中硬壁菌門/擬桿菌門的比例增加，而從成年到老年又逐漸減小，據(jù)統(tǒng)計，真細菌屬、擬桿菌屬和瘤胃球菌屬是在成年腸道菌群中發(fā)現(xiàn)的主要微生物種類。新生小鼠一般是無菌的或者菌體數(shù)量很少, 隨著年齡的增長,小鼠腸道菌群的豐度開始增加。尹業(yè)師等［16］通過聚合酶鏈式反應和變性梯度凝膠電泳（PCR-DGGE）實驗顯示，小鼠在成長過程中，DGGE的條帶數(shù)由7日齡的少數(shù)幾條增至14條，13日齡的平均超過20條、28日齡的平均超過30條、28和42日齡的DGGE條帶數(shù)基本一致，結(jié)果表明隨著日齡的變大，腸道菌群多樣性增加并且穩(wěn)定性增強。

2.3益生菌對小鼠腸道菌群組成的影響

有益微生物可以抑制其他有害菌在消化道內(nèi)的生長增殖，也可以維持機體正常的生理機制，被認為是一類具有廣闊開發(fā)和應用前景的抗生素替代品。但是，有益微生物的數(shù)量會受多種因素的影響，繼而使病原菌不斷繁殖，消化道菌群紊亂。王友湘等［17］對小鼠灌喂瑞士乳桿菌后顯示，相關微生物在腸道的定植有相應的調(diào)理過程，也說明益生菌對小鼠腸道微生物區(qū)系有一定的調(diào)節(jié)作用。

研究顯示［18］，不同個體和性別間腸道微生物也存在一定的差異，但是相對比較穩(wěn)定；不同飼養(yǎng)環(huán)境也可導致小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的差異，但是這些影響因素較以上因素顯得不太重要。

2.4菌群對小鼠的免疫系統(tǒng)的影響

近幾十年來利用小鼠模型的研究表明［19］，微生物菌群對免疫系統(tǒng)的發(fā)展和維護具有重要作用。飲食的不規(guī)律以及抗生素的廣泛使用，導致糖尿病、哮喘病和過敏癥發(fā)病率明顯提高［20］。因此，利用這些動物模型來進行腸道微生物的研究十分重要，前期的研究也證明了微生物菌群對調(diào)節(jié)免疫應答的確具有很重要的作用［21］。

腸道益生菌能夠活化巨噬細胞或淋巴細胞，產(chǎn)生細胞因子，從而促進免疫細胞的增殖、分化或增強免疫反應［22］。有研究報道［23］，腸道益生菌能夠直接影響宿主的免疫系統(tǒng)，誘發(fā)腸道免疫；活化腸黏膜內(nèi)相關淋巴組織，使分泌型免疫球蛋白A生物合成增加，從而提高消化道黏膜的免疫功能。Kim等［24］在實驗組用益生菌鮮奶酪灌喂小鼠，結(jié)果顯示在大腸和小腸中CD4+/CD8+T細胞數(shù)量比率升高，說明益生菌可以促進淋巴細胞的增殖，淋巴細胞在局部產(chǎn)生細胞因子，可以防御外來病菌的侵襲。另外，Paturi等［25］用乳桿菌灌喂小鼠，結(jié)果顯示小鼠小腸中分泌型免疫球蛋白A分泌增多，相關細胞因子的量也增多，表明乳桿菌能提高小鼠免疫系統(tǒng)功能。腸道微生物組與肥胖的形成也有一定關系，已引起廣泛關注。Upadhyay等［26］研究顯示，體質(zhì)量增加不僅需要增加熱量攝入，而且需要腸道微生物和免疫應答之間的調(diào)節(jié)和傳遞。

3　GF小鼠與腸道微生物

近年來，相繼有研究報道［27-30］腸道正常菌群與機體生理狀態(tài)的維持關系緊密，但由于腸道菌群組成和作用的復雜，其具體作用機理仍需要更深入的探索研究；因此，需要一種理想的模型來研究腸道菌群對宿主的作用及相關機制，而GF動物的出現(xiàn)為進一步的研究提供了可能。

GF動物是指其體內(nèi)不存在任何包括細菌、病毒、真菌、原蟲、支原體、衣原體、螺旋體、立克次體在內(nèi)的活的生命體的動物，這一動物模型獨特的生物學特性為研究和驗證腸道微生態(tài)和宿主正常生理及病理感染狀態(tài)下的相互關系提供材料。GF動物的免疫系統(tǒng)如淋巴系統(tǒng)、抗體形成系統(tǒng)等均發(fā)育不良，當GF動物處于正常有菌條件下，其各種生理指標都得到了不同程度的改善，表明正常胃腸道微生物菌群在刺激機體免疫器官的分化發(fā)育，增強機體免疫等方面具有重要作用。與SPF級小鼠相比，GF小鼠體內(nèi)的免疫球蛋白IgG、IgA、IgM表達量顯著下降，其免疫細胞的表達量也較少，當重新定植菌群時，這些生理指標得到逆轉(zhuǎn)，表明腸道微生物對機體整個免疫系統(tǒng)的發(fā)育和功能發(fā)揮都是十分重要的［31,32］。1945年，美國Notre Dame大學Lobund實驗室的Reynier等首次成功培育出GF大鼠并隨后成功繁殖和建群，證實了動物可以在GF環(huán)境下生存。腸道內(nèi)的菌種多具有強大的消化多糖類物質(zhì)的能力，Backhed等［9］在GF小鼠體內(nèi)灌注常規(guī)飼養(yǎng)小鼠的小腸末端的微生物群，顯示GF小鼠在14 d內(nèi)體內(nèi)脂肪含量增加了60%。GF動物和完整的胃腸道微生物群系的普通動物相比更易感染疾病, 研究表明, 給GF小鼠灌服10個沙門氏菌就可致死，而正常小鼠則需要106個同等細菌，因此動物胃腸道微生物群系對于維護動物的健康具有重要作用。腸道微生物組與癌癥的關系近年受到關注，Arthur等［33］研究顯示，大部分結(jié)腸癌和腸易激綜合征患者的體內(nèi)均存在大腸桿菌突變株。有研究將大腸桿菌突變株注入小鼠，結(jié)果小鼠體內(nèi)形成腫瘤； 而將大腸桿菌基因組中涉及DNA損傷的區(qū)域除去后，大腸桿菌引發(fā)腫瘤的能力大幅降低。表明腸道微生物紊亂擾亂了腸道生態(tài)系統(tǒng)，使病原體能夠入侵腸道，損害宿主細胞，從而提高患結(jié)腸癌的風險。

4　小結(jié)

隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展和科技的進步, 以及與傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)技術(shù)相結(jié)合的微生物非培養(yǎng)分子生物技術(shù)的產(chǎn)生和應用, 從傳統(tǒng)的純培養(yǎng)技術(shù)到非培養(yǎng)微生物技術(shù)的發(fā)展為探討腸道微生物的種類、多樣性, 以及腸道微生物分子水平的研究提供了技術(shù)支持, 也為實驗小鼠腸道微生物的深入研究提供了很好的平臺。最近幾年，腸道菌群相關的研究急劇增多，這些研究為探究腸道菌群和宿主健康的關系提供了依據(jù)，但是關于實驗小鼠腸道微生物的研究還有待深入，研究不同環(huán)境條件下動物腸道微生物區(qū)系變化規(guī)律、信號通路及相應的機制, 進而通過改變腸道微生物的組成和增加優(yōu)勢菌群量等措施來預防和治療某些腸道疾病將成為今后研究的熱點。

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The Current Research Status of Gut Microbes in Mice

JING Ya-xing1, BAI Lu2, GAO Huan-yun2, ZHENG Zhen-yu1,2
（1. College of Life Science； 2. College of Husbandry and Veterinary，Henan Agricultural University， Zhengzhou 450002， China）

The current research status on factors influencing gut microflora in mice and gut microflora by using germ free mice were reviewed. Those may be provide

for futurestudy on gut microbiota in human andanimals.

Gut microbes； Modern biotechnology； Germ free mice

Q95-33

A

1674-5817（2015）05-0421-04

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.05.017

2014-12-30

景亞星（1989-）, 女, 碩士研究生, 主要從事動物遺傳工程方面的研究。E-mail： 358142889@qq.com［通訊作者］ 鄭振宇, 男, 教授, 主要從事分子遺傳學和動物遺傳工程方面的研究。E-mail： cbuniv@126.com