巨菌草誘導培養(yǎng)基的篩選及優(yōu)化

黃 靜，顏海鋒，鄭 燕

（1.國家菌草工程技術(shù)中心，福建 福州350002；2.福建農(nóng)林大學生命科學學院，福建 福州350002）

巨菌草（Pennisetum sp.）原產(chǎn)于北非地區(qū)，1983年引入中國，是一種單子葉禾本科狼尾草屬植物。莖直立，叢生，根系非常發(fā)達，植株高大，一般為3～5 m，最高的可達7.08 m。巨菌草喜溫暖濕潤條件，適宜在亞熱帶、熱帶和溫帶生長；屬于C4植物，具有很高的光合效率，抗逆性很強，產(chǎn)量很高，達300～500 t·h m－2［1－2］。近幾年，巨菌草在我國南方地區(qū)的種植面積逐步擴大，應用也越來越廣泛，除了作為動物飼料和保持水土的優(yōu)良品種［3］，也用作栽培靈芝和平菇、猴頭菇等食用菌的培養(yǎng)料［4］。此外，還可用作生物能源，用于生物發(fā)電和制造燃料［5－6］。

然而，巨菌草不耐寒，在北方寒冷地區(qū)自然難以越冬。我國北方大部分地區(qū)通過扦插進行無性繁殖；也可用種子進行有性繁殖，但發(fā)芽率很低［7］，如遇冰雪和霜凍天氣很容易死亡，這種特性使其在北方地區(qū)的推廣嚴重受到限制，傳統(tǒng)的育種技術(shù)無法解決此難題。生物技術(shù)如轉(zhuǎn)基因、體細胞雜交等是改良巨菌草耐寒性的有效途徑，但必須首先建立巨菌草的組織培養(yǎng)技術(shù)體系及轉(zhuǎn)基因體系。而有關(guān)巨菌草組織培養(yǎng)方面的研究在國內(nèi)外尚沒有相關(guān)的報道?；诖耍狙芯恳跃蘧莸那o尖分生組織作為外植體，對巨菌草的愈傷組織誘導進行探索，以期為巨菌草組織培養(yǎng)體系建立和生物技術(shù)遺傳改良奠定基礎，同時為巨菌草的組培育苗提供技術(shù)支持，促進在更大范圍利用和推廣巨菌草。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為巨菌草幼莖，在福建農(nóng)林大學國家菌草工程技術(shù)中心菌草種植基地種植，由于巨菌草不斷地分蘗，可隨時取到比較幼嫩的莖。

1.2 方法

1.2.1 外植體準備 選取幼嫩且生長良好的巨菌草莖桿，剝除葉鞘，用刀切下莖尖部分［8－9］。

1.2.2 培養(yǎng)基的制備 以MS＋30 mg·L－1蔗糖＋2.5 mg·L－1植物膠＋1 mg·L－1聚乙烯吡咯烷酮為基本培養(yǎng)基，p H 為5.8。

1.2.3 外植體的消毒接種 將外植體分別置于75%的乙醇中處理0、30、60 s和2%的次氯酸鈉溶液中處理10、15、20 min，用無菌水沖洗3～5次，在無菌濾紙上吸干水分，用手術(shù)刀切成0.1～0.2 c m厚的小薄片，接種于MS基本培養(yǎng)基上，每瓶接種6塊外植體，每次接種6瓶，3次重復。然后置于26～28 ℃的暗培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，7 d 后統(tǒng)計外植體污染率［10－11］。

1.2.4 愈傷組織誘導

1）將外植體材料接種含2，4－D 濃度分別為0、1.0、2.0、3.0、4.0 mg·L－1的MS 培養(yǎng)基中，觀察愈傷組織生長狀況，選取愈傷組織生長最好的濃度為最佳濃度［12－14］。

2）在最佳2，4－D 濃度的基礎上，在MS培養(yǎng)基中添加0.1、0.2、0.3、0.4 mg·L－1的NAA 或IAA與2，4－D 組合，選擇愈傷組織生長最好的濃度組合［15－16］。

3）在最佳2，4－D 和最佳IAA 或NAA 的濃度組合上，在MS 培養(yǎng)基上添加0.5、1.0、1.5 mg·L－1細胞分裂素6－BA 或KT，選擇愈傷組織生長最好的濃度組合。

以上各階段愈傷組織的誘導均在暗培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為26～28 ℃［15］，每個處理接種6瓶，每瓶接種4～6塊外植體，3次重復（即重復18瓶），接種20 d后統(tǒng)計愈傷組織誘導率。

1.3 數(shù)據(jù)分析

愈傷組織誘導率＝產(chǎn)生愈傷組織的外植體／接種的外植體總數(shù)×100%。

以上各處理的3 次重復數(shù)據(jù)平均值為結(jié)果數(shù)據(jù)，運用Excel 2010和統(tǒng)計分析軟件DPS 6.0進行數(shù)據(jù)的顯著性測驗和分析。

2 結(jié)果

2.1 外植體的消毒方式

該組處理編號為A1到A11，共11種組合，結(jié)果如表1所示。

外植體的污染率在0～28%，最低的為只用次氯酸鈉消毒10、20 min和只用乙醇30、60 s，污染率都為0。污染率最高的為用乙醇消毒30 s然后再用次氯酸鈉消毒20 min，污染率為28%。

表1 不同消毒劑對外植體處理不同時間后的污染情況Table 1 Contamination r ate of explants after disinfecting by different disinfectants with different ti mes

2.2 不同濃度2，4－D 對巨菌草愈傷組織誘導的影響

表2 不同濃度的2，4－D對巨菌草愈傷組織誘導的影響Table 2 Different concentrations of 2，4－D effects on Pennisetum sp.callus induction

與不加入2，4－D 的對照相比（表2），不同濃度的2，4－D 均能誘導出巨菌草的愈傷組織（圖1）。從1.0～4.0 mg·L－14個濃度梯度中，巨菌草的出愈率并沒有顯著差異，在51.000%～56.000%。

圖1 巨菌草莖尖的愈傷組織Fig.1 Pennisetum sp.stem tip callus

2.3 不同濃度的IAA、NAA 與2，4－D 組合對巨菌草愈傷組織誘導的影響

以MS＋3.0 mg·L－12，4－D 作為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的IAA 和NAA，以不添加生長素為對照，共9個處理（表3）。

與對照相比，加入IAA 或NAA 之后，巨菌草的出愈率均有明顯的提高，除C5 外其余處理與對照間差異均極顯著（P＜0.01）（表3）。出愈率隨著IAA 濃度的增高而呈先升高再降低的趨勢，在濃度為0.2 mg·L－1時達到最高水平，此時出愈率為76%，與其他濃度間差異極顯著。而4 個濃度的NAA均能增加出愈率，但無顯著差異（P＞0.05），

以MS作為基本培養(yǎng)基，分別添加不同濃度的2，4－D，以不添加2，4－D 作為對照（CK），共5 個處理，結(jié)果如表2所示。出愈率都在60%左右。

表3 不同濃度的IAA、NAA與2，4－D組合對巨菌草愈傷組織誘導的影響Table 3 Influence of different concentrations combination of IAA，NAA and 2，4－D on Pennisetum sp.callus induction

2.4 不同濃度細胞分裂素對巨菌草愈傷組織誘導的影響

以MS＋3.0 mg·L－12，4－D＋0.2 mg·L－1IAA 為基本培養(yǎng)基（記為D），添加不同濃度的細胞分裂素，6－BA 或KT，以不添加細胞分裂素為對照，共有7個處理組合（表4）。

不加細胞分裂素的對照組出愈率為68%，加入細胞分裂素之后，出愈率為66.000%～71.000%，與對照相比差異不顯著（P＞0.05）。

表4 不同濃度細胞分裂素對巨菌草愈傷組織誘導的影響Tabel 4 Effects of different concentration of cytokinin on Pennisetum sp.callus induction

3 討論與結(jié)論

在植物組織培養(yǎng)試驗中，外植體消毒是試驗的第一步也是很關(guān)鍵的一步，如果消毒處理效果不好，將會產(chǎn)生大范圍的污染，導致以后的步驟無法繼續(xù)進行［17］。然而，影響消毒效果的因素很復雜，所以污染是普遍發(fā)生的問題。由于外植體比較幼嫩，酒精穿透力又很強，所以用酒精造成的褐化比較嚴重，導致外植體活力大大降低［8］。對外植體用不同的消毒劑組合及不同時間處理后發(fā)現(xiàn)，只用2%次氯酸鈉或只用75%酒精處理外植體的效果最好，沒有發(fā)現(xiàn)污染情況，但是用75%的酒精處理后褐化會非常嚴重，導致外植體的生長活力不強。如果用酒精處理后再用次氯酸鈉處理染菌率反而增高，可能是出現(xiàn)交叉污染的狀況，這與謝妤和張子雯［10］對雜交狼尾草（Pennisetu m al opecuroides）的研究結(jié)果一致的。由于本研究中用的外植體都是非常幼嫩的莖，酒精和次氯酸鈉都會在一定程度上損害外植體，所以在保證無污染的情況下，消毒劑的處理時間越短越好。鑒于本研究的材料為有很多帶絨毛的葉鞘，為了盡量降低污染率，又保持外植體較高的活力，先用75%酒精擦拭剝除較老的葉鞘，然后用2%的次氯酸鈉溶液消毒處理10 min，從而達到了理想的消毒效果。

在甘蔗（Sacchar um）組織培養(yǎng)試驗中，2，4－D被認為是外植體脫分化產(chǎn)生愈傷組織的關(guān)鍵因素［15］。在不含2，4－D 的培養(yǎng)基中，甘蔗外植體不能脫分化產(chǎn)生愈傷組織，這與本研究巨菌草愈傷組織的誘導結(jié)果是一致的。但是巨菌草誘導愈傷組織對濃度要求不高，2，4－D 濃度在1.0～4.0 mg·L－1的范圍內(nèi)都可以誘導出愈傷組織，且各濃度間差異不顯著。由于前人對禾本科的組織培養(yǎng)結(jié)果都表明3.0 mg·L－1的2，4－D 是最佳濃度［16，18］，3.0 mg·L－1的2，4－D 也是誘導絨毛狼尾草（Pennisetu m setaceum ）幼穗愈傷組織的最適濃度［12］，此外，本研究中雖然各個濃度2，4－D 都能誘導出愈傷組織，且出愈率差異不顯著，但從愈傷組織的硬度和顏色看，3.0 mg·L－1濃度下誘導的愈傷組織長勢最好，故本研究中采用3.0 mg·L－1為最佳濃度。

生長素NAA 和IAA 都能促進愈傷組織的誘導，但是濃度對其的影響差別相對比較大；雖然二者的影響均達到顯著水平，但是IAA 比NAA 的效果更好，且在濃度為0.2 mg·L－1時能發(fā)揮最好的效果，誘導率高達76%。在甘蔗組織培養(yǎng)中，細胞分裂素KT 和6－BA 也能促進愈傷組織的誘導［15］。對象草（Pennisetu m pur pureu m）幼穗的研究表明，KT 濃度為0.05 mg·L－1或0.10 mg·L－1時，顆粒狀愈傷組織的誘導率較高［19］。但是在本研究中，這兩種細胞分裂素的效果不是很明顯，所以在巨菌草的愈傷組織誘導中沒有必要加入KT 或6－BA。

綜上，巨菌草的組織培養(yǎng)體系與其他禾本科植物存在一定差異。巨菌草愈傷組織誘導的最佳培養(yǎng)基配方是MS＋2，4－D（3.0 mg·L－1）＋IAA（0.2 mg·L－1）。

4 展望

巨菌草愈傷組織誘導是組織培養(yǎng)中關(guān)鍵的一步，愈傷組織誘導的成功對于組織培養(yǎng)或體細胞雜交，甚至轉(zhuǎn)基因在巨菌草上的應用都具有重要的意義。因此，在本研究基礎上進一步對其愈傷組織分化成苗的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件進行研究，為推廣巨菌草提供更多的技術(shù)支持。

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