醉馬草揮發(fā)油對(duì)多年生黑麥草種子萌發(fā)及幼苗生理變化的影響

夏 超，鐘 睿，張興旭，南志標(biāo)

（草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州730020）

化感作用（Allelopathy）是指植物通過(guò)向自身所處的外界環(huán)境中釋放某些化學(xué)物質(zhì)（化感物質(zhì)）進(jìn)而對(duì)周?chē)h(huán)境中的其他植物或微生物產(chǎn)生有利或不利影響，從而使植物在生長(zhǎng)競(jìng)爭(zhēng)中處于有利地位，獲得生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)［1－3］?；形镔|(zhì)（Allelochemical）是一類(lèi)來(lái)源于植物或者微生物的次生代謝產(chǎn)物，一般分子量較小，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，多為酚類(lèi)、萜類(lèi)、甾體類(lèi)和生物堿類(lèi)［4－5］。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)植物化感作用進(jìn)行了大量研究，發(fā)現(xiàn)植物產(chǎn)生的化感物質(zhì)在抑制或者促進(jìn)受體植物的生長(zhǎng)發(fā)育、殺蟲(chóng)和抑菌等方面有重要作用［6－8］?；形镔|(zhì)主要通過(guò)自然揮發(fā)、雨霧淋溶、根分泌和植株分解等途徑釋放到環(huán)境中，進(jìn)而直接或間接地作用于自身或周?chē)渌铮?－11］。

內(nèi)生真菌可以提高宿主植物對(duì)環(huán)境中非生物脅迫和生物脅迫的抗性，已經(jīng)被蘭州大學(xué)團(tuán)隊(duì)近年來(lái)的研究所證實(shí)［12－15］。內(nèi)生真菌的侵染可以提高宿主植物的化感作用［16］，提高其在種群和群落中的競(jìng)爭(zhēng)能力，從而使其能夠在群落演替和物種競(jìng)爭(zhēng)過(guò)程中處于有利地位［17］。有關(guān)內(nèi)生真菌化感作用的研究，目前已見(jiàn)的報(bào)道主要集中于多年生黑麥草（Lolium perenne）［18－20］和高羊茅（Festuca arundinacea）［21－22］。

楊松等［8］通過(guò)發(fā)芽試驗(yàn)和盆栽試驗(yàn)研究了醉馬草（Achnather um inebrians）草粉水浸提液對(duì)3種草坪草的化感作用，發(fā)現(xiàn)E＋和E－草粉均有化感作用，而且內(nèi)生真菌增強(qiáng)了醉馬草對(duì)3種草坪草的化感效應(yīng)［23］。本研究以水蒸氣蒸餾得到的醉馬草揮發(fā)油為試驗(yàn)材料，通過(guò)紙上芽床發(fā)芽試驗(yàn)，結(jié)合形態(tài)學(xué)指標(biāo)和生理生化指標(biāo)，研究帶菌（E＋）和不帶菌（E－）醉馬草揮發(fā)油成分對(duì)多年生黑麥草的化感作用，為進(jìn)一步揭示醉馬草揮發(fā)油成分在植物化感現(xiàn)象中的作用機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 E＋和E－醉馬草揮發(fā)油成分的提取

用于揮發(fā)油成分提取的E＋和E－醉馬草植株于2012年9月植物成熟期收獲自蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院榆中試驗(yàn)地（104°09′E，35°56′N(xiāo)，海拔1 653 m）。割取醉馬草植株地上部分，帶回實(shí)驗(yàn)室，暗室內(nèi)自然陰干后用低溫冷凍干燥機(jī)（LGJ－18型冷凍干燥機(jī)，北京四環(huán)科學(xué)儀器廠(chǎng)制造）于－60 ℃干燥24 h后，取出后用植物微型粉碎機(jī)（FZ102，天津泰斯特儀器公司制造）粉碎成細(xì)粉狀，經(jīng)0.85 mm直徑篩孔篩選后低溫保存，準(zhǔn)備提取揮發(fā)油。

分別取E＋和E－醉馬草草粉100 g，在水蒸氣蒸餾裝備中100 ℃條件下持續(xù)4 h。蒸餾得到的揮發(fā)性物質(zhì)用乙醚（天津市富宇精細(xì)化工有限公司）自冷凝水中萃取，然后用無(wú)水硫酸鈉（天津市力強(qiáng)化學(xué)試劑二廠(chǎng)）干燥，保存在棕色小瓶中，用聚乙烯封口膜（Parafil mT M，USA）密 封 后4 ℃冰 箱（BCD－240 G／C Haier冰箱，青島海爾股份有限公司）低溫冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 揮發(fā)油對(duì)禾草種子萌發(fā)的抑制作用

凱蒂沙多年生黑麥草（L.perenne cv.Caddieshack）種子采購(gòu)于蘭州市華豐園林草坪工程有限公司。將已經(jīng)提取的醉馬草揮發(fā)油（提取率E＋為2.3%，E－為1.2%）用蒸餾水配成濃度為100、200、300、400和500 mg·mL－1的水溶液待用。采用紙上（TP）發(fā)芽床發(fā)芽，參照衛(wèi)東和王彥榮［24］的方法，先用0.01 g·mL－1氯化汞溶液分別對(duì)多年生黑麥草種子進(jìn)行表面消毒，然后用70%（v／v）乙醇處理，隨后用去離子水對(duì)種子徹底沖洗后，浸泡3 h。將種子放入用無(wú)菌過(guò)濾紙鋪成的芽床培養(yǎng)皿中，設(shè)置5 個(gè)揮發(fā)油濃度梯度，依次為100、200、300、400和500 mg·mL－1，以每天加入2 mL 蒸餾水為對(duì)照（CK）。于14 d后對(duì)種子發(fā)芽率和幼苗生長(zhǎng)、生理指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，其中胚根長(zhǎng)度以大于2 mm為準(zhǔn)［25］。每個(gè)培養(yǎng)皿放置100粒種子，每個(gè)處理5次重復(fù)，以肉眼看到種子白色幼根為標(biāo)準(zhǔn)判斷種子是否發(fā)芽，按照《牧草種子檢驗(yàn)規(guī)定GB／T2930－2001》為依據(jù)計(jì)算種子發(fā)芽率［26］，發(fā)芽指數(shù)（GI）用以下公式計(jì)算：

式中，GT表示發(fā)芽試驗(yàn)開(kāi)始第T 天的發(fā)芽種子數(shù)，DT表示發(fā)芽天數(shù)。發(fā)芽試驗(yàn)結(jié)束后，測(cè)量并記錄幼苗的胚芽和胚根長(zhǎng)度并稱(chēng)其鮮重。每皿取20株幼苗于75 ℃條件下烘干至恒重后，稱(chēng)量其干重并記錄，其余新鮮植物樣品保存在－80 ℃冰箱（Theromo，ELECTRON Cor poration，ULT Freezer）以備各項(xiàng)生理指標(biāo)的檢測(cè)。

1.3 超氧化物歧化酶和過(guò)氧化物酶活性的測(cè)定

超氧化物歧化酶（SOD）和過(guò)氧化物酶（POD）酶活性的測(cè)定，參考李合生［27］的方法略作修改。取先前保存在－80 ℃冰箱的植物樣品地上部分0.5 g用剪刀剪碎，加入35 mL 50 mmol·L－1的PBS磷酸緩沖液（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司），置于0 ℃冰浴上研磨，濾液于冷凍離心機(jī)（3 K30型，Sigma公司）9 000 r·min－1轉(zhuǎn)速條件下離心15 min，上清液為粗酶液，保存于－20 ℃冰箱中，5 mmol·L－1反應(yīng)液中含有50 mmol·L－1磷酸緩沖液（p H 7.8），13 mmol·L－1蛋氨酸（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司），75μg NBT，0.1 mmol·L－1EDTA 和100μL 酶粗提液。加入2 mmol·L－1核黃素（天津市風(fēng)船化學(xué)試劑有限公司）后在光照下啟動(dòng)反應(yīng)。用UV－2102 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在560 n m 下測(cè)定反應(yīng)液的吸光值。其中，以每克鮮重樣品每小時(shí)所抑制氮藍(lán)四唑（NBT）的光還原量為一個(gè)SOD 酶活性單位。

5 mL反應(yīng)液中含磷酸緩沖液（p H 7.8），60 mmol·L－1愈創(chuàng)木酚（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）、2 mmol·L－1H2O2、加100μL酶提取液，用UV－2102型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在290 n m 下測(cè)定反應(yīng)液的吸光值。其中，以每克鮮重樣品每小時(shí)所抑制愈創(chuàng)木酚的氧化量為一個(gè)POD 酶活性單位。

1.4 電導(dǎo)率值和丙二醛含量的測(cè)定

發(fā)芽試驗(yàn)結(jié)束后測(cè)定電導(dǎo)率和丙二醛（MDA）含量，參照張興旭［28］和李玉榮［29］的方法略有改動(dòng)：分別取E＋和E－醉馬草揮發(fā)油處理的多年生黑麥草幼苗10株稱(chēng)重，重復(fù)3次。用超純水清洗5次，置于100 mL的三角瓶中，加超純水80 mL，用錫箔紙加蓋后在20 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中放置24 h，用DDSJ－308 A 型數(shù)字式電導(dǎo)儀測(cè)定浸出液的電導(dǎo)率。

膜脂過(guò)氧化物——MDA 的測(cè)量采用Esterbauer和Cheeseman［30］的方法略有改進(jìn)。稱(chēng)取0.5 g植物樣品置于5 mL 5%的三氯乙酸（TCA）中，于9 000 r·min－1的轉(zhuǎn)速條件下離心25 min。吸取2 mL的上清液加入2 mL 0.67%的代巴比妥酸（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）溶液置于100 ℃恒溫水浴中加熱30 min，然后將反應(yīng)試管置于冰浴中以終止反應(yīng)。將樣品再次于9 000 r·min－1的轉(zhuǎn)速條件下離心5 min，冷卻后離心去除沉淀物，吸取上清液稀釋相同倍數(shù)后，用UV－2102型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)分別于450、535 和600 n m 下測(cè)量其吸光值，以其含有其他試劑的處理作空白對(duì)照。樣品中MDA－TBA 螯合物（紅色）的濃度通過(guò)如下公式進(jìn)行計(jì)算：

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)均用Microsoft Excel 2003錄入，并作圖。

醉馬草E＋和E－揮發(fā)油成分對(duì)黑麥草種子的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)以及根苗長(zhǎng)和干鮮重，SOD 和POD 活性，電導(dǎo)率和MDA 含量的結(jié)果均用平均值加標(biāo)準(zhǔn)誤表示。采用SPSS 17.0（Ver.17.0，SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）統(tǒng)計(jì)分析軟件分別對(duì)上述指標(biāo)進(jìn)行單因素和雙因素方差分析（ANOVA），采用Duncan法進(jìn)行多重比較差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)

黑麥草發(fā)芽率受內(nèi)生真菌的影響不顯著（P＝0.094），但受揮發(fā)油濃度的影響顯著（P＜0.001），受內(nèi)生真菌及揮發(fā)油濃度互作的影響也顯著（P＜0.01）（表1）。與CK 相比，從E＋和E－醉馬草植株中提取的揮發(fā)油成分均能降低黑麥草種子的發(fā)芽率，而且E＋揮發(fā)油對(duì)黑麥草種子發(fā)芽率的抑制作用要強(qiáng)于E－揮發(fā)油（圖1A）。黑麥草的發(fā)芽率在揮發(fā)油各濃度之間差異顯著（P＜0.05），隨著揮發(fā)油濃度的增加，黑麥草種子的發(fā)芽率呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)。在揮發(fā)油濃度為400和500 mg·mL－1時(shí)，E＋醉馬草提取的揮發(fā)油處理過(guò)的黑麥草種子的發(fā)芽率顯著低于E－醉馬草揮發(fā)油處理的黑麥草種子，分別降低了18.89%和62.96%，其余各濃度之間E＋和E－提取揮發(fā)油處理黑麥草種子后，其發(fā)芽率無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

黑麥草發(fā)芽指數(shù)受內(nèi)生真菌的影響不顯著（P＝0.173），但受揮發(fā)油濃度的影響顯著（P＝0.003），受內(nèi)生真菌及揮發(fā)油濃度互作的影響也顯著（P＜0.01）（表1）。與CK相比，從E＋和E－醉馬草植株中提取的揮發(fā)油成分均能顯著降低黑麥草種子的發(fā)芽指數(shù)（圖1B）。黑麥草的發(fā)芽指數(shù)在各濃度揮發(fā)油之間差異顯著，且隨著揮發(fā)油濃度的增加，呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。當(dāng)揮發(fā)油濃度超過(guò)200 mg·mL－1時(shí)，E＋醉馬草中提取的揮發(fā)油對(duì)黑麥草種子發(fā)芽指數(shù)的抑制作用要顯著強(qiáng)于E－揮發(fā)油處理。

2.2 胚根和胚芽長(zhǎng)

黑麥草胚芽長(zhǎng)受內(nèi)生真菌的影響不顯著（P＝0.072），但受揮發(fā)油濃度的影響顯著（P＝0.002），受內(nèi)生真菌及揮發(fā)油濃度互作的影響也顯著（P＜0.001）（表1）。與CK相比，E＋和E－醉馬草中提取的揮發(fā)油均能降低黑麥草種子的胚芽長(zhǎng)度，揮發(fā)油各濃度之間黑麥草的胚芽長(zhǎng)度差異顯著（P ＜0.05），且隨著揮發(fā)油濃度的增加，黑麥草胚芽長(zhǎng)度呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)（圖2 A）。當(dāng)揮發(fā)油濃度大于200 mg·mL－1時(shí)，E＋和E－醉馬草中提取的揮發(fā)油對(duì)黑麥草胚芽長(zhǎng)度產(chǎn)生顯著影響。在300、400和500 mg·mL－1條件下，E＋提取揮發(fā)油處理黑麥草的胚芽長(zhǎng)較E－提取揮發(fā)油處理黑麥草的胚芽長(zhǎng)分別短9.6%、9.8%和28.57%。

表1 內(nèi)生真菌與揮發(fā)油濃度互作對(duì)黑麥草生長(zhǎng)指標(biāo)的影響Table 1 Two－way ANOVA analysis for effects of endophyte（E）and concentr ate of volatile oils（C）on gr owth index of Lolium perenne

圖1 不同濃度醉馬草揮發(fā)油水溶液對(duì)黑麥草發(fā)芽率（A）和發(fā)芽指數(shù)（B）的影響Fig.1 Effects of volatile oils with different concentr ations on ger mination rate（A）and ger mination index（B）of Lolium perenne

黑麥草胚根長(zhǎng)受內(nèi)生真菌的影響顯著（P＜0.001），且 受 揮 發(fā) 油 濃 度 的 影 響 也 顯 著（P ＝0.001），同時(shí)，受內(nèi)生真菌及揮發(fā)油濃度互作的影響亦顯著（P＜0.001）（表1）。與CK 相比，E＋和E－醉馬草中提取的揮發(fā)油均能降低黑麥草的胚根長(zhǎng)度，揮發(fā)油各濃度之間的黑麥草的胚根長(zhǎng)度差異顯著（P＜0.05），且隨著揮發(fā)油濃度的增加，黑麥草胚根長(zhǎng)度呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)（圖2B）。當(dāng)揮發(fā)油濃度大于100 mg·mL－1時(shí)，E＋和E－醉馬草中提取的揮發(fā)油對(duì)黑麥草胚根長(zhǎng)度即會(huì)產(chǎn)生顯著影響。在200、300、400和500 mg·mL－1濃度條件下，E＋提取揮發(fā)油處理黑麥草的胚根長(zhǎng)較E－提取揮發(fā)油處理的分別短10.59%、10.19%、14.92%和30.82%。

2.3 鮮重和干重

圖2 不同濃度醉馬草揮發(fā)油水溶液對(duì)黑麥草胚芽（A）及胚根（B）長(zhǎng)的影響Fig.2 Effects of volatile oils with different concentrations on seedling height（A）and the length of root（B）of Lolium perenne

黑麥草苗鮮重受內(nèi)生真菌的影響不顯著（P＝0.115），但受揮發(fā)油濃度的影響顯著（P＝0.001），受內(nèi)生真菌與揮發(fā)油濃度互作的影響也顯著（P＜0.001）（表1）。與CK 相比，從E＋和E－植株中提取的揮發(fā)油成分均能降低黑麥草幼苗的鮮重（圖3 A）。不同濃度條件下，黑麥草幼苗的鮮重之間差異顯著（P＜0.05），在100和200 mg·mL－1條件下，經(jīng)E＋和E－提取揮發(fā)油處理的黑麥草幼苗之間鮮重差異不顯著（P＞0.05），但在300、400和500 mg·mL－1的濃度條件下，經(jīng)E＋和E－提取揮發(fā)油處理的黑麥草幼苗鮮重之間的差異顯著（P ＜0.05），經(jīng)E＋提取揮發(fā)油處理的黑麥草幼苗鮮重較E－提取揮發(fā)油處理的黑麥草幼苗鮮重分別低13.16%、34.99%和58.64%。

黑麥草苗干重受內(nèi)生真菌的影響不顯著（P＝0.115），但受揮發(fā)油濃度的影響顯著（P＜0.001），受內(nèi)生真菌與揮發(fā)油濃度互作的影響也顯著（P＜0.001）（表1）。與CK 相比，從E＋和E－植株中提取的揮發(fā)油成分均能降低黑麥草幼苗的干重（圖3B）。不同濃度條件下，黑麥草幼苗的干重之間差異顯著（P＜0.05），在100和200 mg·mL－1條件下，經(jīng)E＋和E－提取揮發(fā)油處理的黑麥草幼苗之間干重差異不顯著（P＞0.05），而在300、400和500 mg·mL－1的濃度條件下，經(jīng)E＋和E－提取揮發(fā)油處理的黑麥草幼苗干重之間的差異顯著（P ＜0.05），經(jīng)E＋提取揮發(fā)油處理的黑麥草幼苗鮮重較E－提取揮發(fā)油處理的黑麥草幼苗干重偏低。

2.4 電導(dǎo)率和丙二醛含量的變化

黑麥草電導(dǎo)率受內(nèi)生真菌的影響顯著（P＝0.017），且受揮發(fā)油濃度的影響也顯著（P ＝0.006），同時(shí)，受內(nèi)生真菌與揮發(fā)油濃度互作的影響亦顯著（P＜0.001）（表2）。與CK 相比，從E＋和E－植株中提取的揮發(fā)油成分均能提高黑麥草葉片的電導(dǎo)率（圖4A）。不同揮發(fā)油水溶液濃度條件下，黑麥草葉片的電導(dǎo)率之間差異顯著（P＜0.05），在100 mg·mL－1條件下，經(jīng)E＋和E－提取揮發(fā)油處理的黑麥草葉片電導(dǎo)率之間差異不顯著（P＞0.05），但當(dāng)揮發(fā)油濃度大于100 mg·mL－1時(shí)，經(jīng)E＋和E－提取揮發(fā)油處理的黑麥草葉片電導(dǎo)率之間均呈現(xiàn)顯著差異，經(jīng)E＋提取揮發(fā)油處理的黑麥草葉片的電導(dǎo)率較E－提取揮發(fā)油處理的黑麥草葉片的電導(dǎo)率高，分 別 高 出13.36%、15.64%、14.02% 和14.22%。

圖3 不同濃度醉馬草揮發(fā)油水溶液對(duì)黑麥草干重（A）和鮮重（B）的影響Fig.3 Effects of volatile oils with different concentrations on fresh weight（A）and dry weight（B）of Lolium perenne

表2 內(nèi)生真菌與揮發(fā)油濃度互作對(duì)黑麥草生理指標(biāo)的影響Table 2 Two－way ANOVA analysis f or the effects of endophyte（E）and concentrate of volatile oils（C）on physiological index of Lolium perenne

圖4 不同濃度醉馬草揮發(fā)油水溶液對(duì)黑麥草幼苗電導(dǎo)率（A）和丙二醛（B）含量的影響Fig.4 Effects of volatile oils with different concentrations on electrical conductivity（A）and the content of MDA（B）of Loliu m perenne under

黑麥草MDA 受內(nèi)生真菌的影響不顯著（P＝0.128），但受揮發(fā)油濃度的影響顯著（P＝0.031），受內(nèi)生真菌與揮發(fā)油濃度互作的影響也顯著（P＜0.001）（表2）。與CK相比，除100 mg·mL－1濃度E＋外，從E＋和E－醉馬草植株中提取的揮發(fā)油成分均能顯著（P＜0.05）提高黑麥草幼苗中MDA 的含量（圖4B）。其中，在100 mg·mL－1濃度條件下，經(jīng)E－提取揮發(fā)油處理的幼苗中MDA 含量顯著高于經(jīng)E＋提取揮發(fā)油處理的幼苗；200 mg·mL－1濃度條件下，經(jīng)E＋和E－提取揮發(fā)油處理的幼苗中MDA 含量差異不顯著（P＞0.05）外，其余各濃度條件下，經(jīng)E＋提取揮發(fā)油處理的幼苗中MDA 的含量顯著（P＜0.05）高于經(jīng)E－提取揮發(fā)油處理的幼苗，分別高出27.72%、24.27和26.04%。

2.5 超氧化物歧化酶和過(guò)氧化物酶活性變化

黑麥草SOD 受內(nèi)生真菌的影響不顯著（P＝0.067），但受揮發(fā)油濃度的影響顯著（P＝0.012），受內(nèi)生真菌與揮發(fā)油濃度互作的影響也顯著（P＜0.001）（表2）。與CK 相比，E＋和E－揮發(fā)油成分均能顯著增加黑麥草幼苗體內(nèi)SOD 的含量（P＜0.05）（圖5 A）。除100和200 mg·mL－1外，其他濃度條件下，經(jīng)E＋和E－醉馬草揮發(fā)油處理的黑麥草幼苗體內(nèi)SOD 的含量之間均存在顯著性差異，且經(jīng)E＋揮發(fā)油處理的黑麥草幼苗體內(nèi)SOD 含量均大于經(jīng)E－揮發(fā)油處理的黑麥草幼苗的，分別高出21.18%、28.64%和26.44%。另外，從揮發(fā)油水溶液濃度來(lái)看，100和200 mg·mL－1與其他濃度之間存在顯著差異。

POD 受內(nèi)生真菌的影響顯著（P＝0.024），且受揮發(fā)油濃度的影響也顯著（P＝0.001），同時(shí)，受內(nèi)生真菌與揮發(fā)油濃度的影響亦顯著（P＜0.001）（表2）。與對(duì)照相比，E＋和E－揮發(fā)油成分均能增加黑麥草幼苗體內(nèi)POD 的含量（圖5B）。除100 mg·mL－1外，其他濃度條件下，經(jīng)E＋和E－醉馬草揮發(fā)油處理的黑麥草幼苗體內(nèi)POD 的含量之間差異均顯著（P＜0.05），且經(jīng)E＋揮發(fā)油處理的黑麥草幼苗體內(nèi)POD 含量均低于經(jīng)E－揮發(fā)油處理的黑麥草幼苗，分別低了16.90%、23.38%、16.66%和14.54%。

圖5 不同濃度醉馬草揮發(fā)油水溶液對(duì)黑麥草幼苗超氧化物歧化酶（A）和過(guò)氧化物酶（B）活性的影響Fig.5 Effects of volatile oils with different concentrations on SOD activity（A）and POD activity（B）of Lolium perenne

3 討論

本研究首次以E＋和E－醉馬草揮發(fā)油為材料，通過(guò)紙上芽床發(fā)芽試驗(yàn)，研究了醉馬草揮發(fā)油對(duì)黑麥草的化感作用，結(jié)果表明醉馬草揮發(fā)油對(duì)黑麥草種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)具有一定的抑制作用。

關(guān)于內(nèi)生真菌化感作用的研究，最初Sut herland等［20］的研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生真菌產(chǎn)生的黑麥草堿可以降低周?chē)兹~（Trif oliu m repens）的密度。Quigley等［19］用黑麥草－內(nèi)生真菌共生體提取液來(lái)處理豆科植物就發(fā)現(xiàn)，提取液對(duì)豆科植物的根系發(fā)育具有明顯的抑制作用。張穎和韓建國(guó)［18］分析認(rèn)為，黑麥草－內(nèi)生真菌共生體能夠產(chǎn)生化感物質(zhì)來(lái)提高宿主黑麥草的競(jìng)爭(zhēng)能力，從而使其在種間和種內(nèi)競(jìng)爭(zhēng)中處于有利地位。Tan 和Zou［31］的研究也表明，內(nèi)生植物真菌能夠通過(guò)提高寄主植物對(duì)其他植物的化感作用，來(lái)競(jìng)爭(zhēng)更多的營(yíng)養(yǎng)和空間。還有研究結(jié)果表明，植物間的化感作用廣泛存在并且影響種子萌發(fā)、幼苗存活、植物物種的分布以及種群的結(jié)構(gòu)和演替［2］。本研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生真菌影響了醉馬草揮發(fā)油對(duì)黑麥草種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的作用。與E－揮發(fā)油相比，在種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)過(guò)程中，E＋揮發(fā)油成分對(duì)多年生黑麥草的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、根苗長(zhǎng)以及苗干鮮重具有更強(qiáng)的抑制作用，這樣的結(jié)果不僅表明了醉馬草揮發(fā)油對(duì)黑麥草種子的萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)具有一定的抑制作用，還說(shuō)明內(nèi)生真菌的存在增強(qiáng)了醉馬草－內(nèi)生真菌共生體揮發(fā)油的化感作用。這與Sut herland 等［20］以?xún)?nèi)生真菌N.lolii侵染的多年生黑麥草和Springer［21］以?xún)?nèi)生真菌N.coenphianum 侵染的高羊茅對(duì)三葉草的化感作用的研究結(jié)果基本一致。另有研究表明，內(nèi)生真菌還可以通過(guò)影響宿主植物的生理生化特性而改變對(duì)其伴生種的影響［32－33］。

內(nèi)生真菌侵染的高羊茅通過(guò)根際分泌到土壤中的生物堿可以抑制意大利黑麥草（L.multif lor u m）種子萌發(fā)［22］。野大麥（Hor deu m brevisubl atu m）草粉在種子萌發(fā)試驗(yàn)中對(duì)多年生黑麥草、高羊茅和草地早熟禾（Poa pr atensis）這3種草坪草具有抑制作用，但是在盆栽條件下，野大麥草粉卻又對(duì)這3種草坪草的幼苗生長(zhǎng)均具有一定的促進(jìn)作用［34］，這可能是因?yàn)樵诎l(fā)芽試驗(yàn)中，影響種子萌發(fā)的物質(zhì)均處于培養(yǎng)皿中，而盆栽試驗(yàn)中可能由于澆水導(dǎo)致這些活性物質(zhì)下滲至土壤深層或者直接流失從而未對(duì)植物的生長(zhǎng)造成影響［35］。也有可能盆栽試驗(yàn)施用的草粉用量較低，未達(dá)到抑制植物生長(zhǎng)的濃度［6］，從而表現(xiàn)出了低濃度促進(jìn)、高濃度抑制的結(jié)果［36］。用于植物培養(yǎng)的土壤介質(zhì)中本來(lái)就含有醛類(lèi)和有機(jī)酸等一些化合物，能夠和草粉中的元素和物質(zhì)產(chǎn)生特異性反應(yīng)，降低草粉成分的濃度和含量，從而降低了抑制作用［37］。這說(shuō)明揮發(fā)油對(duì)植物的影響除與其成分有關(guān)，還與濃度和培養(yǎng)基質(zhì)有一定的關(guān)系。本研究也表明，隨著揮發(fā)油水溶液濃度的提高，黑麥草幼苗各項(xiàng)生長(zhǎng)指標(biāo)受到的抑制作用也越大，且經(jīng)E＋、E－不同揮發(fā)油處理的黑麥草幼苗之間的差異也越來(lái)越明顯。這可能是因?yàn)殡S著揮發(fā)油水溶液濃度的增大，E＋和E－植株本身提取出的揮發(fā)油之間的差別也被逐步放大，最終導(dǎo)致受不同濃度E＋、E－提取揮發(fā)油水溶液處理的黑麥草幼苗的不同生理指標(biāo)之間的差異也越來(lái)越大。

電導(dǎo)率是一個(gè)間接評(píng)定質(zhì)膜完整性及細(xì)胞膜滲透性的指標(biāo)，其高低的變化反映了植物細(xì)胞膜是否遭到了破壞［38－40］。MDA作為機(jī)體受到逆境脅迫 后膜脂過(guò)氧化的產(chǎn)物，其含量的高低反映著機(jī)體細(xì)胞受傷害的程度［41］。本研究結(jié)果顯示，隨著揮發(fā)油水溶液濃度的升高，黑麥草幼苗的電導(dǎo)率和MDA 含量都隨之升高，且經(jīng)E＋提取揮發(fā)油處理幼苗的指標(biāo)普遍高于E－提取揮發(fā)油處理幼苗的指標(biāo)值。這可能是因?yàn)殡S著揮發(fā)油水溶液濃度的升高，黑麥草幼苗細(xì)胞膜受到的破壞程度逐漸增大，且內(nèi)生真菌的存在增強(qiáng)了醉馬草揮發(fā)油的化感作用［18－21］，使得經(jīng)E＋揮發(fā)油處理的黑麥草幼苗遭到比E－揮發(fā)油處理的幼苗更加嚴(yán)重的破壞。醉馬草和披堿草（El y mus dahuricus）草粉對(duì)多年生黑麥草、高羊茅和草地早熟禾的種子萌發(fā)均具有一定的抑制作用，而內(nèi)生真菌顯著增強(qiáng)了化感作用［8，23］，對(duì)E＋和E－野大麥草粉的研究也得到了相類(lèi)似的結(jié)論［34］。異株相克是研究植物間化感作用的基本依據(jù)，即一種生物釋放出對(duì)另一種生物有促進(jìn)或抑制作用的物質(zhì)［1］。Springer［21］認(rèn)為，可能是由于內(nèi)生真菌在寄主體內(nèi)產(chǎn)生了生物堿、多酚類(lèi)物質(zhì)、有機(jī)酸、脂肪族類(lèi)和醌類(lèi)等活性物質(zhì)，而這些次生代謝產(chǎn)物參與到了植物的化感作用當(dāng)中，并且發(fā)揮了積極的作用，使帶菌禾草的化感作用加強(qiáng)，從而使帶菌禾草在植物競(jìng)爭(zhēng)中處于有利地位。

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