乳制品中異種蛋白摻假檢測的研究進展

金萍，丁洪流，陳英，李培

（蘇州市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所，江蘇蘇州215128）

乳制品中異種蛋白摻假檢測的研究進展

金萍，丁洪流，陳英，李培

（蘇州市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所，江蘇蘇州215128）

乳品摻假已成為困擾我國乳品工業(yè)發(fā)展的一個突出問題，本文闡述了乳制品中異種蛋白質(zhì)摻假的常見手段，并綜述了目前針對各種摻假手段的檢測方法，如紅外光譜法、高效液相色譜法、電泳法、比色法以及PCR方法等。

乳制品；摻假；檢測

各種各樣的乳及乳制品（如牛奶、酸奶、奶酪以及目前廣受歡迎的羊奶粉）因其豐富的營養(yǎng)、美味的口感而廣受大眾的歡迎，然而一些不良商販在非法利潤的驅(qū)使下和越來越先進的檢測技術(shù)的追迫下，不斷改變和提高摻假手段，乳品摻假已成為困擾我國乳品工業(yè)發(fā)展的一個突出問題。乳品的蛋白質(zhì)含量往往被用來評判質(zhì)量的最重要的依據(jù)，因此乳品蛋白質(zhì)摻假層出不窮，乳品蛋白質(zhì)摻假不僅可以給眾多消費者造成不可逆轉(zhuǎn)的傷害，亦可重創(chuàng)中國制造商品信譽。

蛋白質(zhì)摻假物根據(jù)性質(zhì)不同可以分為假蛋白摻假物以及真蛋白摻假物，假蛋白摻假物其本質(zhì)是一些非蛋白含氮物，如三聚氰胺。真蛋白摻假物根據(jù)來源還可分為植物源性蛋白摻假物（如大豆蛋白）以及動物源性蛋白摻假物。乳品中假蛋白摻假物的檢測方法已經(jīng)趨于成熟，形成規(guī)范的標(biāo)準(zhǔn)［1-3］，假蛋白摻假物的摻入已不能為摻假者賺取非法利潤，反而有被查處的風(fēng)險，這使摻假者去尋找新的摻假物來取代假蛋白摻假物，廉價的外源真蛋白必將會成為首選的摻假物，主要的摻入物有皮革水解蛋白、大豆蛋白、植物水解蛋白以及在高價的羊乳中添加牛乳等，真蛋白摻假物其本質(zhì)是真蛋白，檢測難度大。本文綜述各類乳制品中真蛋白摻假檢測方法的最新研究進展，旨在為后續(xù)的真蛋白摻假檢測方法研究提供參考。

1乳及乳制品中植物源性蛋白摻假物的檢測

目前最常摻入的植物源性蛋白有摻豆?jié){（大豆蛋白粉）、植物水解蛋白等，相較于牛羊乳比較廉價，但其這種行為一方面損害了消費者的權(quán)益，另一方面也是一種食品安全隱患，摻假乳標(biāo)簽上并不會注明，這容易使得一些大豆蛋白過敏者誤食而引起不良后果，如嘔吐、腹痛、腹瀉，甚至過敏性休克。

1.1通過檢測皂角素鑒別是否摻豆?jié){［4］

摻入豆?jié){的同時也引入了大豆中特有的皂角素。皂角素能溶于熱水或熱酒精，并與NaOH作用生成黃色，若有黃色出現(xiàn)則證明摻有豆?jié){。此方法簡單快速，可以用于原料乳收奶現(xiàn)場的摻假檢測。

1.2電泳法檢測乳及乳制品中摻加的大豆蛋白

大豆蛋白和乳蛋白分子間帶電性以及量存在區(qū)別，張東送［5］等根據(jù)蛋白分子帶電性的差異利用毛細(xì)管電泳技術(shù)進行奶粉中大豆蛋白摻假的應(yīng)用研究，實驗結(jié)果表明，添加大豆蛋白的奶粉圖譜上出現(xiàn)新的特征峰，而且大豆蛋白特征峰面積與添加量成正比。

吳茹怡［6］則根據(jù)大豆蛋白和乳蛋白分子量的區(qū)別，利用SDS-PAGE方法來檢測牛奶中的豆奶成分。將牛奶和豆奶分別進行SDS-PAGE分析，SDS-PAGE電泳譜圖上可看到7條牛奶蛋白帶和13條豆奶蛋白帶，牛奶中摻雜的豆奶體積分?jǐn)?shù)為5%時即可被檢測到。

1.3近紅外光譜檢測乳制品中摻加的水解植物蛋白

王右軍［7］等研究利用近紅外光譜快速定量檢測牛奶中摻假物質(zhì)的可行性，采用偏最小二乘法建立近紅外光譜與牛奶中摻假物質(zhì)含量之間的定量模型。結(jié)果表明對摻入的水解植物蛋白粉的定量預(yù)測準(zhǔn)確度較高，相關(guān)系數(shù)為0.969，預(yù)測標(biāo)準(zhǔn)差為0.456 g/kg，可以滿足定量檢測的需要。

1.4PCR方法檢測乳制品中植物成分

覃芳芳［8］等建立了應(yīng)用PCR技術(shù)鑒別牛奶飲料中植物成分的方法，方法設(shè)計合成了針對線粒體tRNA Leu基因的引物，擴增牛奶中的植物成分，該方法可檢測到牛奶中摻入的植物成分低至0.1%。模擬樣品檢測顯示該方法準(zhǔn)確性高，實際應(yīng)用能力強。

2乳及乳制品中動物源性蛋白摻假物的檢測

2.1乳及乳制品中摻入皮革水解蛋白粉的檢測方法

“三聚氰胺奶”事件后，農(nóng)業(yè)部于2009年開始在全國范圍內(nèi)進行生鮮乳質(zhì)量安全監(jiān)測工作。在三聚氰胺成為嚴(yán)打的對象后，一些不法企業(yè)和奶站便將目光鎖定在“皮革水解蛋白”。2009年2月初，我國食品安全綜合協(xié)調(diào)與衛(wèi)生監(jiān)督局所印發(fā)的《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑品種名單（第二批）》公布后僅一個月左右，浙江金華市晨園乳業(yè)被查出仍頂風(fēng)作案，生產(chǎn)“皮革奶”，因此而被查封。那之后，皮革水解蛋白也被列入了生鮮乳制品的檢測項目中。

皮革水解蛋白粉就是利用皮革下腳料甚至動物毛發(fā)等物質(zhì)（類似于又粘又稠半透明狀液體），經(jīng)水解而生成的一種粉狀物。因其氨基酸、明膠或者說蛋白含量較高，故人們稱之為“皮革水解蛋白粉”。

皮革奶，就是通過添加皮革水解蛋白從而提高牛奶含氮量，達到提高其蛋白質(zhì)含量檢測指標(biāo)的牛奶。由于這種皮革水解蛋白中含有嚴(yán)重超標(biāo)的重金屬等有害物質(zhì)，致使牛奶有毒有害，嚴(yán)重危害消費者的身體健康甚至生命安全。

2.1.1比色法檢測乳制品中摻加的水解膠原蛋白

皮革水解蛋白屬于膠原蛋白，含有膠原蛋白所特有的氨基酸-羥脯氨酸（hydroxyproline，Hyp），Hyp在正常膠原蛋白中含量約為13.4%，而在其他蛋白質(zhì)中則不存在［1］。李景紅等［2-3］用比色法對乳制品中的羥脯氨酸進行檢測，研究表明摻加量在1%以上就可以檢測得到。具體方法：1）先將樣品進行酸化，水解膠原蛋白，游離羥脯氨酸；2）再用氯胺-T氧化羥脯氨酸生成含吡咯環(huán)的物質(zhì)，加入對-二甲基氨基苯甲醛溶液顯色；3）558 nm波長處測吸光度，用標(biāo)準(zhǔn)曲線算得羥脯氨酸的質(zhì)量濃度，由測得的羥脯氨酸換算得出乳中摻加的動物膠原水解蛋白的量。此方法所用儀器操作簡便、經(jīng)濟，且操作方法步驟簡單，檢出限為9.00 μg/mL。

2.1.2色譜法檢測乳制品中摻加的水解膠原蛋白

李景紅等采用陰離子交換色譜-積分脈沖安培法［3］以及2，4-二硝基氟苯柱前衍生反相高效液相法［3，9］檢測牛乳中的羥脯氨酸，由測得的羥脯氨酸含量推算得到牛乳中摻加的膠原水解蛋白量。陰離子交換色譜-積分脈沖安培法無需衍生處理，可直接對羥脯氨酸進行測定，檢出限為1.0 μg/mL。高效液相法最低檢出限為2.5 μg/mL。

水解動物蛋白不同于乳酪蛋白，不同的蛋白質(zhì)分子具有不同的氨基酸組成比例，劉婷［10］等利用蛋白質(zhì)的氨基酸組成差異性檢測牛奶中摻入的水解蛋白，利用高效液相離子交換色譜法對乳粉和水解動物蛋白中的17種氨基酸進行分離測定以及篩選比較，發(fā)現(xiàn)其中6種氨基酸的含量差別較大：甘氨酸、丙氨酸、精氨酸、谷氨酸、賴氨酸和亮氨酸。摻入水解動物蛋白的乳粉其前3種氨基酸含量比例升高，后3種氨基酸含量比例下降。依據(jù)此6種氨基酸建立乳粉中水解動物蛋白的模擬檢測，將實際檢測中的數(shù)據(jù)與模擬檢測數(shù)據(jù)進行對照半定量地檢測出樣品中水解動物蛋白的添加比例范圍。

2.1.3氨基酸自動分析儀檢測乳制品中摻加的水解膠原蛋白

曾暖茜等［11］利用日立835-50型氨基酸自動分析儀對氨基酸直接進行分析，羥脯氨酸與茚三酮反應(yīng)后生成黃色產(chǎn)物，在儀器的第二通道波長440 nm有最大吸收，且保留時間不與其他氨基酸重迭，因此可用于測定乳制品中羥脯氨酸含量，氨基酸自動分析儀操作簡單，自動化程度高，但要求具有相關(guān)的儀器。

2.2乳制品物種判別檢測方法

奶食品除了牛奶，還有馬奶、羊奶等。在歐美國家羊奶被視為乳品中精品，稱作“貴族奶”。國際學(xué)界譽為“奶中之王”。羊奶與牛奶的主要組成相近，而某些營養(yǎng)素比牛奶高出很多。含有牛奶不具備的一些特殊物質(zhì)，如：EGF表皮生長因子，免疫球蛋白。不含牛奶引起的過敏物質(zhì)α-S1的酪蛋白。國際乳品聯(lián)合會原中國專家委員會委員金世琳在《金世琳乳品科技文選》中說過：“如今，在美國山羊奶被放在藥房和超級市場銷售……從全世界范圍來看，山羊乳在全部乳類中有迅速發(fā)展的趨勢［12］。

山羊奶是繼牛奶、水牛奶之后的第三大奶類資源，占總奶量的2.07%，世界上所產(chǎn)的山羊奶大部分以液態(tài)奶形式出售，也用于加工干酪、奶油、糖果等。山羊奶產(chǎn)品的成本要比牛奶高，在歐美其價格比牛奶高很多，在美國兩者價格比為2∶1。因此，向羊奶中摻加牛奶可降低成本，獲得更高的利潤，但長此以往不利于乳業(yè)市場的發(fā)展；而對于一些牛奶過敏者則可能造成致命性的傷害。

2.2.1酶聯(lián)免疫方法（ELISA）檢測羊乳中的牛乳成分

ELISA方法的核心在于特異性抗體，抗體的專一性越高，檢測的可信度就越高。抗體分多克隆抗體和單克隆抗體，一般單克隆抗體的專一性高于多克隆抗體。Anguita等［13］和Hurley等［14］分別用牛β-酪蛋白以及牛IgG制備牛源性單克隆抗體，建立間接ELISA反應(yīng)體系，專一性結(jié)合乳中牛源性蛋白成分，檢測下限可達0.5%。

2.2.2毛細(xì)管電泳在乳蛋白質(zhì)摻假檢測上的應(yīng)用

Cartoni等［15］利用毛細(xì)管區(qū)帶電泳檢測羊奶產(chǎn)品中摻入的牛乳成分。以特異性乳清蛋白為檢測物質(zhì)，檢測峰具有很高的分辨率，制作相對校準(zhǔn)曲線，牛乳的最小檢出量在乳混合物中體積分?jǐn)?shù)2%，在奶酪中體積分?jǐn)?shù)為4%。

石燕［16］、Brabant［17］、張東送等［5］在研究毛細(xì)管電泳在乳品蛋白質(zhì)摻假檢測上的應(yīng)用時，檢測牛乳中添加雜蛋白的檢測情況，發(fā)現(xiàn)不同物種間乳的電泳圖譜具有差異性，牛乳、綿羊乳和山羊乳具有不同表型的β-乳球蛋白、αs1-、αs2-、β-和κ-酪蛋白，可以鑒別不同物種間乳的互相摻假現(xiàn)象。

2.2.3PCR檢測分析在乳蛋白質(zhì)摻假檢測上的應(yīng)用

ELISA方法、電泳法、色譜法等主要依賴于乳中蛋白質(zhì)或氨基酸的差異，這些技術(shù)已成功應(yīng)用于生乳或者鮮乳等，但是市場上諸多的奶制品經(jīng)過了高溫高壓的處理，并添加有各種各樣的食品添加劑。而蛋白質(zhì)經(jīng)過這些加工處理可能改變了其結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性，從而破壞物種特有的蛋白質(zhì)或抗原決定部位。加之牛乳與羊乳間大部分的主要成分相似，因此這些方法在市場加工樣品的檢測上比較困難?；谏鲜鲞@些原因，以核酸為基礎(chǔ)的分析法顯示了其優(yōu)勢，乳中外源蛋白質(zhì)的摻入會引入該外源有機體的種屬特異性遺傳物質(zhì)-DNA，核酸能夠耐高溫，檢測時是基于其特定的片段，DNA的斷裂對檢測影響不大，可通過檢測種屬特異性DNA片段來間接檢測外源蛋白。因此，基于核酸檢測的PCR技術(shù)（包括實時熒光定量PCR）、分子雜交以及基因測序等是進行乳制品中物種判別的最佳方法。

López-Calleja等［18］使用PCR技術(shù)特異性檢測綿羊和山羊乳中摻入的牛乳，PCR使用了針對線粒體中12S rRNA基因的引物以達到種屬特異性。上游引物與一個保守DNA片段互補結(jié)合，下游引物與牛的特異DNA片段結(jié)合，這樣就擴增出一個223 bp的牛乳中DNA片段，而綿羊和山羊的DNA片段不會得到擴增。這個技術(shù)被用在生鮮乳、巴氏殺菌乳和滅菌后的牛-綿羊和牛-山羊混合乳的檢測，它能夠很好的檢測出混合物中的牛乳，具有靈敏的檢測限體積分?jǐn)?shù)0.1%。

López-Calleja等［19］使用PCR技術(shù)特異性檢測綿羊乳中摻入的山羊乳，PCR使用了針對線粒體中12S rRNA基因的引物以達到種屬特異性。這個山羊種屬特異性引物的使用能擴增出一個122 bp的山羊乳DNA片段，而綿羊、母牛和水牛的DNA片段不會得到擴增。這個PCR分析技術(shù)被用在由山羊和綿羊二元混合的生鮮乳、高溫處理乳的特異性檢測上，它能夠很好的檢測出混合物中的山羊乳，最低檢測限為體積分?jǐn)?shù)0.1%。

Kotowicz等［20］采用雙重PCR檢測山羊乳中的牛乳，該雙重PCR使用兩對能識別線粒體D環(huán)片段序列的引物。該PCR檢測具有很高的特異性和靈敏性，它能檢測到羊奶中體積分?jǐn)?shù)不到1%的牛奶成分。一對引物是特異性識別牛線粒體DNA片段，另一對引物可識別山羊和牛的線粒體DNA片段以阻止假陰性的發(fā)生。

3結(jié)論

隨著人民生活水平的提高，消費者對食品的安全也越來越關(guān)注，面對牛奶摻假屢禁不絕的現(xiàn)象，建立奶類食品摻假的檢測體系，可為食品安全提供保障，提高食品質(zhì)量安全事故的應(yīng)急反應(yīng)，為食品安全法正確執(zhí)行和實施提供先進、高效的技術(shù)手段，其應(yīng)用也可促進食品工業(yè)健康穩(wěn)定的發(fā)展。文中綜述了對乳制品摻假鑒別的各種手段，如紅外光譜法、高效液相色譜法、電泳法、比色法以及PCR方法等，這些方法檢測的出發(fā)點在于所摻入的蛋白質(zhì)與原有蛋白質(zhì)之間存在差異性（帶電性、等電點、氨基酸組成、蛋白分子的抗原決定簇、外來帶入物質(zhì)等）。乳品中蛋白質(zhì)摻假物檢測的實現(xiàn)離不開這些差異性，沒有任何差異性作為檢測依據(jù)的乳品蛋白摻假檢測方法是不可能實現(xiàn)的。乳品蛋白摻假方法的建立一定要以某一特定的蛋白質(zhì)差異性為依據(jù)。目前，乳制品中真蛋白摻假檢測主要基于這些差異點建立起來的，其涉及了色譜、質(zhì)譜、免疫、PCR、電泳、光譜學(xué)、分析化學(xué)等技術(shù)領(lǐng)域。

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Research Progress on Detection Methods of Protein Adulteration in Milk Products

JIN Ping，DING Hong-liu，CHEN Yin，LI Pei
（Suzhou Products Quality Supervision and Inspection Institute，Suzhou 215128，Jiangsu，China）

Milk adulteration has become a prominent problem in the dairy industry development in our country. This paper presents the common means of protein adulteration in milk products，and summarizes the adulteration detection method for various means，such as infrared spectroscopy，high-performance liquid chromatography，electrophoresis method，colorimetric method and PCR method，etc.

milk products；adulteration；detection

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.12.035

2013-05-15

蘇州市科技計劃支撐項目（SS201126）；江蘇省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局科技項目（KJ122726）

金萍（1986—），女（漢），助理工程師，碩士，研究方向：營養(yǎng)與食品安全。