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    Bcl-2與卵巢顆粒細(xì)胞凋亡相關(guān)性研究

    2015-04-07 09:35:43藺會(huì)蘭孫曉慧劉俊霞金立娟田碩張藝瑋楊尊會(huì)鐔麗霞
    河北醫(yī)藥 2015年9期
    關(guān)鍵詞:顆粒細(xì)胞卵母細(xì)胞卵泡

    藺會(huì)蘭 孫曉慧 劉俊霞 金立娟 田碩 張藝瑋 楊尊會(huì) 鐔麗霞

    作者單位: 050011河北省石家莊市第一醫(yī)院

    Bcl-2與卵巢顆粒細(xì)胞凋亡相關(guān)性研究

    藺會(huì)蘭孫曉慧劉俊霞金立娟田碩張藝瑋楊尊會(huì)鐔麗霞

    作者單位: 050011河北省石家莊市第一醫(yī)院

    【摘要】目的比較卵巢功能減退患者和卵巢功能正常女性顆粒細(xì)胞凋亡及Bcl-2表達(dá)情況,探討卵巢功能減退的發(fā)病機(jī)制。方法選擇接受體外受精-胚胎移植(IVF-ET)治療的不孕患者48例,其中卵巢功能減退患者23例,卵巢功能正常對(duì)照患者25例。于取卵日收集卵泡液,離心收集顆粒細(xì)胞培養(yǎng),用TUNEL檢測顆粒細(xì)胞凋亡情況。免疫組化分析顆粒細(xì)胞Bcl-2蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果卵巢功能減退組和卵巢功能正常組顆粒細(xì)胞凋亡率分別為(27 ±13) %、(18±8) %,卵巢功能減退組顆粒細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組增高(P<0.05) ;免疫組化分析顯示Bcl-2主要在顆粒細(xì)胞胞漿中表達(dá),卵巢功能減退組Bcl-2蛋白表達(dá)較正常對(duì)照組下調(diào)(P<0.05)。結(jié)論Bcl-2可能通過調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞凋亡情況,影響卵泡發(fā)育及卵巢的功能。

    【關(guān)鍵詞】顆粒細(xì)胞;凋亡; Bcl-2;卵巢功能

    項(xiàng)目來源:石家莊市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展指導(dǎo)計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào): 131462553)

    E-mail: linhl2011bs@163.com

    近年來由于社會(huì)性、醫(yī)源性和自身因素的影響,卵巢功能減退發(fā)病率越來越高。尋找卵巢功能減退的發(fā)病機(jī)制對(duì)改善卵巢功能至關(guān)重要。卵泡由1個(gè)居于核心的卵母細(xì)胞及周圍的顆粒細(xì)胞和卵泡膜細(xì)胞組成。在卵泡發(fā)育過程中,顆粒細(xì)胞的增殖、分化對(duì)卵母細(xì)胞的發(fā)育成熟起重要作用。顆粒細(xì)胞凋亡與卵子閉鎖及卵巢功能減退關(guān)系密切[1]。有學(xué)者認(rèn)為當(dāng)顆粒細(xì)胞凋亡達(dá)10%以上時(shí)該卵泡發(fā)生閉鎖,從而影響卵巢功能[2]。本研究通過比較卵巢功能減退患者和正常女性顆粒細(xì)胞凋亡及Bcl-2表達(dá)情況,探討卵巢功能減退的發(fā)病機(jī)制。

    1 資料與方法

    1.1一般資料選擇我院2012年10月至2013年10月接受體外受精-胚胎移植(IVF-ET/ICSI)治療的不孕患者48例。納入標(biāo)準(zhǔn):年齡25~40歲,月經(jīng)周期25~35 d,B超檢查除外卵巢多囊改變、子宮肌瘤、子宮內(nèi)膜異位癥聲像改變,除外發(fā)熱及炎癥疾病,除外甲狀腺疾病、腎上腺疾病及其他系統(tǒng)腫瘤等?;颊吆炇鹬橥鈺8鶕?jù)基礎(chǔ)FSH值和卵巢基礎(chǔ)竇卵泡數(shù)分為卵巢功能正常對(duì)照組(FSH<8 U/L且竇卵泡數(shù)>5 枚) 25例和卵巢功能減退組(FSH>10 U/L或竇卵泡數(shù)<5枚) 23例。

    1.2控制性超促排卵方案卵巢功能正?;颊卟捎贸R?guī)長方案超促排卵。于前1個(gè)月經(jīng)周期B超監(jiān)測排卵,排卵后7 d(月經(jīng)第21~23天)開始每天皮下注射GnRH激動(dòng)劑曲普瑞林(博福益普生制藥生產(chǎn)) 0.05~0.1 mg,14 d后根據(jù)患者的年齡、AFC及基礎(chǔ)血清FSH、LH、E2水平確定促性腺激素,采用重組人促卵泡素(商品名果納芬,默克雪蘭諾公司)和尿促性激素(HMG,麗珠制藥有限公司)劑量。陰道B超開始監(jiān)測卵泡大小,根據(jù)卵泡發(fā)育情況,調(diào)整用量劑量直至注射人絨毛膜促性腺激素(HCG)日止;卵巢功能減退患者采用短方案促排卵,在超促排卵前即月經(jīng)第2天B超下進(jìn)行竇卵泡計(jì)數(shù)、有無卵巢囊腫,給予GnRH激動(dòng)劑曲普瑞林0.1 mg,1次/d,月經(jīng)的第3天給予促排卵藥物,陰道B超開始監(jiān)測卵泡大小,直至HCG日止當(dāng)1個(gè)主導(dǎo)卵泡平均直徑超過18 mm、2個(gè)主導(dǎo)卵泡平均直徑超過17 mm、3個(gè)主導(dǎo)卵泡平均直徑超過16 mm時(shí)給予人絨毛膜促性腺激素(HCG) 5 000或10 000 U肌內(nèi)注射,36 h后經(jīng)陰道超聲取卵。取卵后第3天超聲引導(dǎo)下行胚胎移植。

    1.3顆粒細(xì)胞凋亡檢測取卵后,顯微鏡下小心剝離卵母細(xì)胞,剩余卵泡液收集于無菌試管中,2 500 r/mi離心10 min,棄上清,收集顆粒細(xì)胞用TUNEL方法進(jìn)行染色:將顆粒細(xì)胞涂片用10%福爾馬林磷酸鹽緩沖液固定30 min后PBS沖洗,放入0.3%H2O2中1 h,加入0.1% TritonX-100,4℃反應(yīng)2 min,加入Tunel反應(yīng)混合物37℃濕盒中反應(yīng)1 h,加入DAB顯色,蘇木素復(fù)染,光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡情況并計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞百分比。凋亡陽性細(xì)胞在光鏡下呈棕黃色,正常細(xì)胞無著色。顯微鏡下任意選取視野,共計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞計(jì)算凋亡率(凋亡率=凋亡陽性的細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%)。

    1.4免疫組化法檢測顆粒細(xì)胞Bcl-2蛋白的表達(dá)吸取上層顆粒細(xì)胞放于PBS溶液中,1 000 r/min×10 min離心;棄上清,用1~2 ml的PBS重懸顆粒細(xì)胞,過300目細(xì)胞篩,即獲取顆粒細(xì)胞的單細(xì)胞懸液,取顆粒細(xì)胞的單細(xì)胞懸液1 ml,用6 ml含有10%胎牛血清的DMEM重懸細(xì)胞,PBS漂洗兩遍后,1% Triton-100室溫孵育30 min破膜; PBS漂洗3遍后,滴加3% H2O2。室溫孵育30 min; PBS漂洗3遍后,滴加封閉液,室溫孵育20 min;移除封閉液后,滴加Ⅰ抗(1∶100) 4℃過夜; PBS漂洗3遍后滴加Ⅱ抗37℃25 min; PBS漂洗3遍后滴加SABC20,37℃20 min,再用PBS漂洗DAB顯色;最后用蘇木精復(fù)染細(xì)胞核,用1%鹽酸酒精分化,用1%氨水返藍(lán),再經(jīng)過乙醇梯度脫水、松節(jié)油透明后即可封片、鏡下觀察和采集圖像。

    1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)量資料以±s表示,采用t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.12組臨床資料比較卵巢功能減退組和卵巢功能正常組患者年齡、促黃體生成素(LH)、睪酮比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05) ;卵巢功能減退組和卵巢功能正常組患者FSH、E2、竇卵泡數(shù)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

    表1 2組臨床資料比較 ±s

    表1 2組臨床資料比較 ±s

    注:與卵巢功能正常組比較,*P<0.05

    指標(biāo) 卵巢功能減退組(n=23) 卵巢功能正常組(n=25)年齡(歲)33.24±4.62 30.82±4.12體重指數(shù)(kg/m2) 21.54±9.72 20.68±9.35不孕年限(年) 4.21±2.17 3.83±1.76 FSH(U/L) 11.48±1.06* 6.28±0.92 LH(U/L) 5.44±1.94 4.55±1.03 E2(pmol/ml) 215.49±57.38* 189.75±71.06 T(pmol/ml) 1.07±0.66 1.18±0.58竇卵泡數(shù)(枚) 6.53±1.88*14.34±3.29

    2.22組顆粒細(xì)胞凋亡率比較卵巢功能減退組顆粒細(xì)胞凋亡率為(27±13) %高于卵巢功能正常組的(18±8) %,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),TUNEL染色卵巢功能減退組顆粒細(xì)胞表現(xiàn)為棕黃色,正常組無著色。

    2.3免疫細(xì)胞化學(xué)檢測bcl-2蛋白的表達(dá)卵巢功能減退患者顆粒細(xì)胞陽性細(xì)胞數(shù)低于正常對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。顆粒細(xì)胞著色深度低于正常對(duì)照組。見圖1。

    3 討論

    圖1 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測bcl-2蛋白表達(dá)(DAB顯色×400)

    卵巢功能減退是婦科常見疾病之一,近年發(fā)病率呈上升趨勢。引起卵巢功能減退的原因可能有遺傳性、免疫性、醫(yī)源性、代謝性因素,環(huán)境污染、毒物接觸及吸煙、抑郁和未產(chǎn)婦長期月經(jīng)紊亂等,其臨床表現(xiàn)主要以閉經(jīng)、不育、雌激素缺乏及促性腺激素水平升高為特征,常伴有圍絕經(jīng)期綜合征的癥狀,如潮熱、多汗、情緒不穩(wěn)定、性欲低下、陰道干澀等。處于生育期的女性提早閉經(jīng),在心理上會(huì)產(chǎn)生沉重包袱,影響婚姻生活質(zhì)量,產(chǎn)生一系列心理和社會(huì)問題。卵巢功能減退的治療方法包括:卵巢組織冷凍、激素替代、中醫(yī)中藥等[3]。

    卵巢中卵泡發(fā)育由始基卵泡、初級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡到成熟卵泡,其中99%的卵泡在不同階段閉鎖。對(duì)發(fā)育卵泡而言,細(xì)胞凋亡的最終表現(xiàn)為卵泡閉鎖,其中顆粒細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致卵泡閉鎖的重要直接原因。卵巢功能減退的主要原因就是卵巢顆粒細(xì)胞凋亡增加,卵泡閉鎖加速,卵母細(xì)胞的凋亡[4]。顆粒細(xì)胞是卵泡表面包裹的一層壁細(xì)胞,其與卵母細(xì)胞間存在復(fù)雜的連接機(jī)制,在卵丘周圍形成一個(gè)多層次的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò),與卵泡進(jìn)行物質(zhì)交換及細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)。顆粒細(xì)胞一方面運(yùn)輸營養(yǎng)物質(zhì)給卵母細(xì)胞,另一方面與卵泡內(nèi)膜細(xì)胞共同作用分泌激素、生長因子等多種物質(zhì),影響卵母細(xì)胞發(fā)育,影響卵巢功能[5]。此外,顆粒細(xì)胞貯存并釋放的某些生長因子和特定蛋白質(zhì)在卵母細(xì)胞成熟及胚胎發(fā)育過程中按一定順序表達(dá)并選擇性地彌散來發(fā)揮調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育的作用[6]。在卵泡周期性發(fā)育過程中,各個(gè)時(shí)期卵泡的閉鎖與顆粒細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[7]。顆粒細(xì)胞凋亡增加可能影響卵母細(xì)胞的成熟,進(jìn)一步影響受精和胚胎的發(fā)育潛能[8]。有研究[9]表明顆粒細(xì)胞的凋亡與卵母細(xì)胞核的成熟、受精有關(guān)。也有研究表明顆粒細(xì)胞凋亡增加可能會(huì)引起卵母細(xì)胞核成熟延遲,導(dǎo)致受精能力下降[10,11]。卵巢顆粒細(xì)胞凋亡是處在一個(gè)非常復(fù)雜內(nèi)環(huán)境控制下完成的,并具有高度協(xié)調(diào)性,它不僅有下丘腦-垂體-卵巢軸調(diào)節(jié)作用,也有卵巢本身的旁分泌和自分泌因子的調(diào)控機(jī)制,也存在其他組織產(chǎn)生的影響細(xì)胞凋亡的物質(zhì)的作用[12]。顆粒細(xì)胞凋亡受卵泡刺激素、黃體生成素、雌孕激素、生長因子及受體和細(xì)胞活素等因素影響。線粒體DNA缺失可能會(huì)使卵泡細(xì)胞凋亡加速而引起卵巢早衰[13]lee等[14]將鼠線粒體與卵巢顆粒細(xì)胞共同培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn),線粒體具有防止顆粒細(xì)胞凋亡的作用,但具體機(jī)制尚不十分清楚。本研究中卵巢功能減退患者顆粒細(xì)胞凋亡率明顯高于卵巢功能正常者。

    參與細(xì)胞凋亡調(diào)控的重要基因有多種,其中B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2原癌基因(Bcl-2)家族對(duì)凋亡起決定作用的。Bcl-2家族位于胞質(zhì)面的線粒體外膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和核膜上,已知的家族成員至少有15個(gè),抑制凋亡發(fā)生的主要成員包括Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-W等。Bcl-2基因是一種細(xì)胞凋亡信號(hào)基因,其家族成員是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)因素。Bcl-2蛋白可存在于免疫、神經(jīng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)等正常組織中,亦存在于人卵巢組織中。有研究發(fā)現(xiàn)對(duì)鼠類卵巢顆粒細(xì)胞凋亡起決定性作用[15]。對(duì)只在卵細(xì)胞表達(dá)Bcl-2而在體細(xì)胞中無表達(dá)的小鼠研究發(fā)現(xiàn)卵細(xì)胞凋亡受抑制,這些小鼠竇前卵泡的閉鎖明顯少于野生型小鼠,說明Bcl-2有保護(hù)竇前卵泡的作用,其作用機(jī)制可能是抑制卵細(xì)胞凋亡[16]。研究表明Bcl-2不僅可以通過直接抑制卵細(xì)胞凋亡或促進(jìn)始基卵泡數(shù)量增多等途徑發(fā)揮其對(duì)卵泡的發(fā)育調(diào)節(jié)作用,其抗凋亡作用還可能通過卵泡內(nèi)顆粒細(xì)胞發(fā)揮作用。卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡通過線粒體途徑介導(dǎo)bax表達(dá),誘導(dǎo)細(xì)胞色素C從線粒體釋放出來,繼而激活Caspase-3、Caspase-9,引發(fā)Caspases級(jí)聯(lián)反應(yīng),導(dǎo)致凋亡[17]。而Bcl-2通過抗氧化途徑起到抑制凋亡的作用[18]。有研究表明Bcl-2可以防止線粒體內(nèi)Ca2+與細(xì)胞色素C向外釋放,降低細(xì)胞代謝過程的活性氧,抑制顆粒細(xì)胞的凋亡[19]。有研究發(fā)現(xiàn)卵巢顆粒細(xì)胞中特異表達(dá)Bcl-2的轉(zhuǎn)基因鼠,排卵數(shù)明顯高于對(duì)照組[20,21]。Bcl-2過表達(dá)可拮抗bax,抑制卵泡膜細(xì)胞及顆粒細(xì)胞的凋亡,促進(jìn)其分泌雌、孕激素,進(jìn)而控制卵母細(xì)胞凋亡,延緩卵泡閉鎖,改善圍絕經(jīng)期綜合征[22,23]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,當(dāng)顆粒細(xì)胞凋亡導(dǎo)致卵泡閉鎖時(shí),在顆粒細(xì)胞內(nèi)幾乎檢測不到凋亡抑制基因的表達(dá)產(chǎn)物Bcl-2蛋白[24]。另外Bcl-2亦可防止一些與凋亡有關(guān)的基因被激活并抑制這些基因表達(dá)產(chǎn)物的功能。本研究利用免疫組化技術(shù)檢測顆粒細(xì)胞Bcl-2蛋白的表達(dá)結(jié)果顯示,Bcl-2蛋白主要在細(xì)胞漿著色,呈棕黃色。在卵巢功能減退患者的顆粒細(xì)胞中,Bcl-2陽性細(xì)胞數(shù)以及著色深度顯著低于正常卵巢的顆粒細(xì)胞。推測Bcl-2可能參與卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡過程,間接影響卵母細(xì)胞的凋亡,在卵巢早衰的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。盡管Bcl-2調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制目前尚不十分清楚,但通過對(duì)Bcl-2基因的研究,并將其導(dǎo)入卵巢組織中,將會(huì)成為是治療卵巢功能減退的一種新方法,也可為臨床診斷確定分子靶點(diǎn)的研究提供參考依據(jù)。

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    (收稿日期:2014-10-11

    通訊作者:孫曉慧,050011河北省石家莊市第一醫(yī)院;

    doi:10.3969/j.issn.1002-7386.2015.09.010

    【文章編號(hào)】1002-7386(2015) 09-1316-04

    【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

    【中圖分類號(hào)】R 7111.75

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