超微粉碎對靈芝中多糖、三萜的影響

吳長輝

（福州大學化學學院，福建 福州 350116；福建仙芝樓生物科技有限公司，350002）

超微粉碎對靈芝中多糖、三萜的影響

吳長輝

（福州大學化學學院，福建 福州 350116；福建仙芝樓生物科技有限公司，350002）

目的：考察將靈芝粉碎成300目的超微粉，對靈芝中多糖、三萜的影響。方法：選擇靈芝主要有效成分靈芝多糖、靈芝三萜的提取得率和液相圖譜為考察指標，采用紫外分光光度法（UV）、高效液相色譜-二極管陣列檢測器法（HPLC-PDA）、高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器法（HPLC-ELSD），比較10目靈芝粉、80目靈芝細粉與300目超微粉中靈芝多糖、靈芝三萜的提取得率和液相圖譜的變化。結(jié)果：靈芝經(jīng)超微粉碎成300目的超微粉后，超微粉30 min的提取得率為10目粉90 min的2.3倍，為80目粉90 min的1.3倍；但從HPLC-ELSD圖譜來看，超微粉碎后，高分子量靈芝多糖的溶出量并沒有增加，在接近一萬分子量部位的多糖反而減少。300目超微粉中靈芝三萜和甾醇與10目粉、80目粉相比，提取得率變化不大，液相圖譜峰形也基本沒有變化。結(jié)論：將靈芝粉碎成300目的超微粉，靈芝總多糖的提出率和溶出速度大幅提高，且對靈芝三萜基本沒有影響，超微粉碎可顯著提高靈芝的生物利用度。

超微粉碎；靈芝；多糖；三萜

中藥行業(yè)引進微粉化技術始于20世紀90年代末，雖然該技術在我國中藥現(xiàn)代化的應用研究剛起步，但作為中藥現(xiàn)代化突破口之一，已成為近幾年來中藥界的研究熱點[1]。

靈芝為多孔菌科真菌赤芝（Ganoderma lucidum（Leyss.ex Fr.）Karst.）或紫芝（Ganoderma sinense Zhao，Xu et Zhang）的干燥子實體[2]。大量藥理研究表明，靈芝具有調(diào)節(jié)免疫、保肝、抗腫瘤、抗衰老、提高機體耐缺氧能力等活性[3]。靈芝傳統(tǒng)的炮制方法為切厚片[4]，然后用水煎煮進行服用，該方法的有效成分使用率極低，因為靈芝的纖維性強，水溶性浸出物只有3%左右，而超微粉碎可以提高中藥材的生物利用度，本試驗對 300目靈芝超微粉、10目粉和80目粉中的靈芝多糖、靈芝三萜等主要有效成分的提取得率和液相圖譜的變化進行研究。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LS230激光粒度分析儀（美國貝克曼庫爾特有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申生科技有限公司）；UV2450紫外可見分光光度計（日本島津）；TDL-40B離心機（上海安亭科學儀器有限公司）；LC20A高效液相色譜儀（日本島津）；Alltech 3300蒸發(fā)光散射檢測器；十萬分之一分析天平（塞多利斯）；WZJ-610振動式藥物超微粉碎機（濟南倍力粉工程技術有限公司）。

1.2 試藥

靈芝（批號：GC-L6-1309020，DB131104，GC-L6-131116，均由福建仙芝樓生物科技有限公司提供）；葡聚糖對照品（西格瑪）；乙腈，乙醇乙酯，無水乙醇，甲醇（均由廣東光華科技股份有限公司提供）；靈芝酸 A，靈芝酸 B，靈芝酸 C，靈芝酸 C1，靈芝酸C2，靈芝酸E，靈芝酸G，靈芝酸H，靈芝酸I（由中國醫(yī)學科學院藥物研究所提供）。

2 方法與結(jié)果

2.1 靈芝超微粉的制備

先將靈芝藥材粗粉碎，干燥至水分約為5%，設定粉碎溫度為-5～ 10℃，進行超微粉碎45 min。經(jīng)測定D90＜ 45 μm，細度達300目。

2.2 不同提取時間總多糖提出率的測定

參照《中華人民共和國藥典》2010年版第二增補版靈芝項下多糖測定法進行檢測[5]。

對照品溶液的制備：取無水葡萄糖對照品適量，精密稱定，加水制成每1 mL含 0.14 mL溶液，即得。

標準曲線的制備：精密量取對照品溶液0.2， 0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mL，分別置試管中，各加水至2.0 mL，迅速精密加入硫酸蒽酮溶液（精密稱取蒽酮0.1 g，加硫酸100 mL使溶解，搖勻）6 mL，立即搖勻，放置15 min后，立即置冰水浴中冷卻15 min，取出，以相應的試劑為空白，照紫外-可見分光光度法（《中華人民共和國藥典》2010年版一部附錄ⅤA），在625 nm波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線，見圖1。

圖1 無水葡萄糖對照品標準曲線

供試品溶液的制備：分別取300目靈芝超微粉、10目粉、80目粉各3份，每份約 2 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加水100 mL，每種規(guī)格的靈芝粉分別按30，60，90 min加熱回流，趁熱抽濾，濾液置水浴上蒸干，殘渣用水5 mL溶解，邊攪拌邊緩慢滴加乙醇75 mL，搖勻，在4℃放置12 h，離心，棄去上清液，沉淀物用水溶解并轉(zhuǎn)至50 mL容量瓶中，搖勻，取溶液適量，離心，精密吸取上清液3 mL，置25 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得。

測定法：精密量取供試品溶液2 mL，置試管中，照標準曲線制備項下的方法，自“迅速精密加入硫酸蒽酮溶液 6 mL”起，同法操作，測定吸光度，按回歸方程求出供試品的多糖提取得率，結(jié)果見表1。

表1 靈芝粉（10目、80目）、靈芝超微粉（300目）提取得率測定結(jié)果

2.3 三萜及甾醇的測定

按《中華人民共和國藥典》2010年版第二增補版靈芝項下三萜及甾醇含量測定法進行測定[5]，結(jié)果見表2。

2.4 靈芝多糖相對分子量分布的分析

照高效液相色譜法（《中華人民共和國藥典》2010年版一部附錄ⅥD）測定。

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗：凝膠色譜柱TSK-GEL G4000 PWXL（10 μm，7.8 mm×30 cm）；乙腈-水（5∶90）為流動相；使用蒸發(fā)光散射檢測器，漂移管溫度60℃，氣體流量1.5 mL/min。

表2 三萜及甾醇提取得率測定結(jié)果

對照品溶液的制備：分別取分子量為MW= 5.0×105，MW=1.10× 105，MW=6.06×104，MW=1.26×104的葡聚糖對照品0.053 0，0.053 9， 0.060 0，0.051 6 g定容至10 mL，分別制成濃度為5.3，5.39，6.0，5.16 mg/mL對照品溶液。

供試品溶液的制備：分別取靈芝超微粉、10目粉、80目粉各1 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加水100 mL，回流提取1 h，趁熱抽濾，濃縮定容至10 mL。

測定法：精密吸取對照品溶液、供試品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，測定。結(jié)果見圖2～ 5。

2.5 靈芝酸的測定及靈芝三萜液相圖譜

照高效液相色譜法《中華人民共和國藥典》2010年版一部附錄ⅥD）測定。

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗：XDB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），波長254 nm，流速1.0 mL/min，以甲醇、乙腈、0.04%的甲酸為流動相進行梯度洗脫。

對照品溶液的制備：稱取靈芝酸A，B，C，C1，C2，E，F(xiàn)，I各5 mg，精密稱定，用甲醇定容至10 mL，然后各取1 mL，置10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度。

供試品溶液的制備：分別稱取10目、80目、超微粉樣品各約1 g，精密稱定，加乙酸乙酯50 mL超聲提取30 min，過濾、蒸干，加甲醇轉(zhuǎn)移定容至10 mL。

圖2 4種葡聚糖對照品

圖3 靈芝粉與葡聚糖對照品

圖4 靈芝粉（DB131104，10目、300目）

圖5 靈芝粉（GC-L6-131116，10目、300目）

測定法：精密吸取對照品溶液、供試品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，測定，并計算靈芝酸 A的含量。測定結(jié)果見圖6～ 9，靈芝酸的測定結(jié)果見表3。

圖6 8種靈芝酸對照品

圖7 靈芝粉（GC-L6-1309020，10目）

圖8 靈芝粉（GC-L6-1309020，80目）

圖9 靈芝粉（GC-L6-1309020，300目）

表3 3種規(guī)格靈芝粉中靈芝酸A，B，C1的測定結(jié)果

3 討論

從不同提取時間靈芝多糖提取得率試驗可以看出，超微粉碎后，靈芝總多糖的提取得率和溶出速度均大幅增加，超微粉30 min的提取得率為10目粉90 min的2.3倍，為80目粉90 min的1.3倍。但從HPLC-ELSD圖譜來看，超微粉碎后，靈芝多糖的溶出量并沒有增加，而是在接近一萬分子量部位的多糖反而減少了，這表明，在超微粉碎過程中，這部分多糖部分被破壞。靈芝多糖的分子量分布較廣，從1萬左右至50萬以上，在常規(guī)細粉中不易溶出，將靈芝粉碎成300目的細粉，細胞壁破裂，多糖比較容易溶出。

從三萜及甾醇的含量測定來看，3種規(guī)格的靈芝粉提取得率變化不大，這可能是由于靈芝三萜為小分子物質(zhì)，比較容易被溶出來，與細度關系不大。從靈芝三萜的液相圖譜來分析，3種規(guī)格靈芝粉的峰形和峰高基本一致，從靈芝酸A、靈芝酸B、靈芝酸 C1的含量測定結(jié)果來看，10目粉、80目粉、300目粉的靈芝酸的含量也基本一致。如將靈芝粉碎成比300目更細的靈芝粉，是否會對三萜有很大的影響，需作進一步的研究。

4 結(jié)論

將靈芝粉碎成300目的超微粉，靈芝總多糖的提出率和溶出速度大幅提高，且對靈芝三萜基本上沒有影響，超微粉碎可顯著提高靈芝的生物利用度，靈芝是我國醫(yī)藥保健品中應用最多和最廣泛的中藥材之一，進行超微粉碎可為深加工產(chǎn)業(yè)和新產(chǎn)品開發(fā)提供新的技術支撐。

[1] 徐月紅，王寧生.中藥微粉化的現(xiàn)狀與分析[J].中國中藥雜志，2004，29（6）：497-500.

[2] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：174-175.

[3] 張曉云，楊春清.靈芝的化學成分和藥理作用[J].國外醫(yī)藥：植物藥分冊，2006，21（4）：152-155.

[4] 福建省食品藥品監(jiān)督管理局.福建省中藥飲片炮制規(guī)范[M].福建：福建科學技術出版社，2013：108-109.

[5] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（第二增補本）[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2013：93-94.

Effects of Superfine Grinding on Ganoderma Lucidum Polysaccharide and Triterpenes

Wu Changhui （College of Chemistry of Fuzhou University，F(xiàn)ujian Fuzhou 350116，China；Fujian Xianzhilou Biological Technology Co.，Ltd.，350002）

Objective:To investigate the effects of superfine grinding on ganoderma lucidum polysaccharide and triterpenes by crushing ganoderma lucidum into 300 mesh superfine powder.Methods:The extracting yields of ganoderma lucidum polysaccharides and ganoderma lucidum triterpenes and HPLC maps were used as the study indexes，and comparison was made on the changes of extracting yields of ganoderma lucidum polysaccharides and triterpenes and HPLC maps among 10 mesh powder，80 mesh fine powder and 300 mesh superfine powder by UV，HPLC-PDA and HPLC-ELSD.Results:The extracting yield of 300 mesh superfine powder extracted for 30 min was 2.3 times of 10 mesh powder extracted for 90 min，and 1.3 times of 80 mesh powder extracted for 90 min. Using the maps of HPLC-ELSD，the dissolved quantity of the superfine powder of ganoderma lucidum polysaccharides did not increase，but the polysaccharides decreased when closing to ten thousand molecular weight.Comparing with 10 mesh powder and 80 mesh fine powder of ganoderma lucidum，the extracting yields of ganoderma lucidum triterpenes and sterol in 300 mesh superfine powder had no big changes，and no big change was found onthe HPLC peak.Conclusion:When ganoderma lucidum was smashed into 300 mesh superfine powder，the extraction rate and dissolution rate of ganoderma lucidum polysaccharides increased greatly while there was basically no impact on ganoderma lucidum triterpenes.Superfine grinding can significantly increase the bioavailability of ganoderma lucidum.

Superfine Grinding；Ganoderma Lucidum；Polysaccharides；Triterpenes

10.3969/j.issn.1672-5433.2015.08.005

2015-04-19）

吳長輝，男，在讀碩士，副主任藥師。主要從事藥品、保健食品的質(zhì)量控制和制劑研究工作。E-mail：87974413@qq.com