FOXP3及ROR-γ轉(zhuǎn)錄因子在非重型再生障礙性貧血的意義及與腎虛證的相關(guān)性

胡明輝，胡令彥，周永明，陳海琳

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，上海200437)

·學(xué)術(shù)探討·

FOXP3及ROR-γ轉(zhuǎn)錄因子在非重型再生障礙性貧血的意義及與腎虛證的相關(guān)性

胡明輝，胡令彥，周永明，陳海琳

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，上海200437)

目的 研究FOXP3、ROR-γ轉(zhuǎn)錄因子在非重型再生障礙性貧血(NSAA)中的意義及與腎虛分型的相關(guān)性。 方法 收集CAA患者102例，用RT-PCR方法檢測(cè)FOXP3及ROR-γ轉(zhuǎn)錄因子水平，與正常對(duì)照組比較。 結(jié)果 與正常對(duì)照組比較，F(xiàn)OXP3mRNA、ROR-γtmRNA表達(dá)水平高于正常對(duì)照組； ROR-γt mRNA在腎虛組間比較有差異，腎陰虛組>腎陽(yáng)虛組>腎陰陽(yáng)兩虛組(P<0.05)；ROR-γt mRNA與腎虛分型有相關(guān)性，P<0.01。 結(jié)論 FOXP3、ROR-γ轉(zhuǎn)錄因子與NSAA發(fā)病有一定相關(guān)性，主要異常發(fā)生在ROR-γ轉(zhuǎn)錄因子之間的調(diào)控，中醫(yī)腎虛分型與轉(zhuǎn)錄因子有相關(guān)性。

非重型再生障礙性貧血； FOXP3轉(zhuǎn)錄因子； ROR-γ轉(zhuǎn)錄因子； 腎虛證

再生障礙性貧血(aplastic anemia，AA)是由各種原因引起的骨髓造血功能的衰竭，其特征為全血細(xì)胞減少。T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫是AA重要發(fā)病機(jī)制，AA患者活化狀態(tài)T細(xì)胞的增加是其免疫病理機(jī)制的生物學(xué)基礎(chǔ)[1]。近年新發(fā)現(xiàn)Th17/CD4+CD25+Treg失衡在再障免疫發(fā)病過(guò)程中的地位日益顯著[2]，而其失衡的表現(xiàn)并不能單以Th17及Treg細(xì)胞水平來(lái)表達(dá)，其對(duì)免疫紊亂的作用較大程度取決于其轉(zhuǎn)錄因子水平的變化。我們就Th17及Treg細(xì)胞的相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子FOXP3及ROR-γ在NSAA中的影響作一研究，并分析其與中醫(yī)腎虛分型的相關(guān)性。

1 臨床資料

1.1 病例選擇標(biāo)準(zhǔn)

1.1.1 西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]① 血常規(guī)檢查：全血細(xì)胞減少，校正后的網(wǎng)織紅細(xì)胞比例

1.1.2 AA分型 重型AA診斷標(biāo)準(zhǔn)(Camitta標(biāo)準(zhǔn))：① 骨髓細(xì)胞增生程度<正常的25%；如≥正常的25%但<50%，則殘存的造血細(xì)胞應(yīng)<30%。② 血常規(guī)：需具備下列3項(xiàng)中的2項(xiàng)：ANC<0.5×109/L；校正的網(wǎng)織紅細(xì)胞<1%或絕對(duì)值<20×109/L；BPC<20×109/L。③ 若ANC<0.2×109/L為極重型AA。非重型AA診斷標(biāo)準(zhǔn)(NSAA)：未達(dá)到重型標(biāo)準(zhǔn)的AA。

1.1.3 中醫(yī)證候分型標(biāo)準(zhǔn) 按照1989年6月在大連召開(kāi)的中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合研究會(huì)血液病專(zhuān)業(yè)委員會(huì)第三屆第二次學(xué)術(shù)座談會(huì)制訂的辨證分型標(biāo)準(zhǔn)。① 腎陰虛證：主癥：心悸，頭暈，周身乏力，面色口唇指甲蒼白，盜汗，出血，次癥：低熱，手足心熱，口渴思飲，大便干結(jié)，舌質(zhì)淡或舌尖紅，苔薄，脈細(xì)數(shù)。② 腎陽(yáng)虛證：主癥：心悸，頭暈，周身乏力，面色口唇指甲蒼白，形寒肢冷，腰膝酸軟。次癥：性功能減退，大便溏，多無(wú)出血或出血輕微，舌質(zhì)淡，脈沉細(xì)或虛大。③ 腎陰陽(yáng)兩虛證：除有血虛證侯外，兼有以上腎陰虛及腎陽(yáng)虛證候。

1.2 一般資料 選擇上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院2011年3月-2013年3月的門(mén)診和住院NSAA者102例，辨證分為腎陰虛型、腎陽(yáng)虛型、腎陰陽(yáng)兩虛3組，見(jiàn)表1。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)方法 FOXP3、ROR-γ轉(zhuǎn)錄因子采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)，由上海博彩生物公司提供的引物DEPC、NTP。分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(BMMNC)，進(jìn)行總RNA的提取，對(duì)所提取RNA進(jìn)行鑒定。TRIzol抽提細(xì)胞總RNA，按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物保存于-20°冰箱備用。PCR引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司設(shè)計(jì)合成。PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上110V電壓條件下電泳45min，溴化乙錠染色，數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)作條帶密度掃描，結(jié)果以bcl-6與內(nèi)參照的灰度比值表示。

表1 3組一般情況

3 結(jié) 果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果 見(jiàn)表2、表3。

表2 2組FOXP3mRNA、ROR-γtmRNA水平比較

注：與正常組比較，1)P<0.05。

表3 3組FOXP3mRNA，ROR-γtmRNA水平比較

注：與腎陰虛組比較，1)P<0.05。

3.2 ROR-γt mRNA 與FOXP3 mRNA比值 Th17與Treg的特異性轉(zhuǎn)錄因子ROR-γt mRNA 與FOXP3 mRNA在NSAA患者中均有升高，但二者比值NSAA組ROR-γt mRNA/FOXP3 mRNA較正常組明顯升高。

3.3 腎虛分型與轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)性 為探索NSAA腎虛分型與轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)性，行Spearman相關(guān)性分析，結(jié)果提示ROR-γt mRNA與腎虛分型有相關(guān)性，r=-0.286，P<0.01。FOXP3 mRNA轉(zhuǎn)錄因子與腎虛分型無(wú)相關(guān)性。

4 討 論

4.1 Th17/Treg免疫失衡與NSAA免疫發(fā)病關(guān)系被很多研究所證實(shí)。Treg的免疫表型為表達(dá)細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子FOXP3，有研究證實(shí)AA患者胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子FOXP3表達(dá)也明顯下調(diào)[4]。但Th17細(xì)胞分化與CD4+CD25+Treg細(xì)胞誘導(dǎo)存在相互排斥的關(guān)系，孤兒核受體ROR-γt是Th17細(xì)胞系特異的轉(zhuǎn)錄因子，當(dāng)較高濃度的IL-6存在時(shí)，可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子ROR-γt表達(dá)，使初始CD4+T細(xì)胞分化為T(mén)h17

細(xì)胞[5]。本課題組[6]已證實(shí)Thl7與Treg細(xì)胞比例和正常對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Treg細(xì)胞低于對(duì)照組，Thl7細(xì)胞高于對(duì)照組，Thl7/Treg水平明顯高于正常人。Fujisawa 等[7]研究結(jié)果表明造血干細(xì)胞RORγt表達(dá)上調(diào)，可以誘導(dǎo)Th17細(xì)胞分化，但能同時(shí)增加Treg細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果的矛盾促使我們從轉(zhuǎn)錄因子層面去進(jìn)一步探討其作用機(jī)制。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)錄因子FOXP3mRNA、ROR-γtmRNA表達(dá)水平顯著高于正常對(duì)照組，NSAA組ROR-γt mRNA/FOXP3 mRNA較正常組明顯升高，使得最終導(dǎo)致Th17/Treg的升高，從而發(fā)生Th17/Treg免疫紊亂的狀態(tài)。

4.2 在與中醫(yī)腎虛相關(guān)性的研究結(jié)果顯示ROR-γtmRNA在腎虛組間比較有差異，腎陰虛組>腎陽(yáng)虛組>腎陰陽(yáng)兩虛組，這與既往研究中腎陰虛Th17細(xì)胞比例升高有關(guān)聯(lián)，提示腎陰虛在Th17細(xì)胞比例升高方面的特征存在。Th17/Treg相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子在不同腎虛分型中的差異主要存在ROR-γtmRNA中。中醫(yī)理論認(rèn)為“邪之所湊，其氣必虛”，雖然再障以腎虛為本，但發(fā)病之初或發(fā)病過(guò)程中，風(fēng)邪、濕熱等邪毒是作為疾病發(fā)生、發(fā)展、惡化環(huán)節(jié)中的重要因素，我們認(rèn)為T(mén)h17及其相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞因子的紊亂或過(guò)度表達(dá)而發(fā)生的免疫亢進(jìn)與NSAA患者發(fā)病過(guò)程中在正虛基礎(chǔ)上發(fā)生邪毒侵犯，導(dǎo)致疾病發(fā)生有高度相關(guān)性。

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2014-10-25

國(guó)家自然科學(xué)基金資助課題(81001510)

胡明輝(1975-)，女，醫(yī)學(xué)博士，副主任醫(yī)師，主要從事中醫(yī)藥治療血液病的研究。

R556

A

1000-338X(2015)03-0001-02