牛初乳免疫球蛋白穩(wěn)定性研究概述*

劉金，王麗威，岳喜慶

1(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧沈陽，110161)2(遼寧工程技術(shù)大學(xué) 理學(xué)院，遼寧阜新，123000)

初乳是雌性哺乳動物產(chǎn)后2～3 d內(nèi)所分泌乳汁的統(tǒng)稱。一般乳牛分娩7 d內(nèi)的乳汁都稱為牛初乳。牛初乳作為一種功能性食品，它富含的免疫因子、生長因子等生理功能性物質(zhì)和多種營養(yǎng)成分，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于常乳［1］。初乳中脂肪、游離氨基酸、維生素、無機鹽含量都很高，特別是蛋白質(zhì)中的乳球蛋白與免疫球蛋白含量在1.5% ～2%，而常乳含量僅為0.1%，這2種乳球蛋白與動物的免疫性有關(guān)，并具有抗原作用［2］，且含有豐富的中性和酸性的多聚糖，能夠抗空腸彎曲桿菌感染，此菌為細(xì)菌性腹瀉主要原因，故能有效防止腹瀉等［3］。

免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)是一類具有抗體活性、與抗體相似的球蛋白，當(dāng)機體受到抗原刺激時會產(chǎn)生免疫球蛋白，與抗原起免疫反應(yīng)，阻斷病原體對人體危害，使其失去致病作用，從而增強機體免疫能力。初乳Ig可分為5類:IgG、IgA、IgM、IgD、IgE。牛初乳中Ig總含量約為50～150 mg/mL，是常乳的50～150倍，其中 IgG約占80% ～90%、IgM約占7%、IgA約占5%［4］，而IgG又分為幾個子類，IgG1和IgG2為主要免疫球蛋白，所有單體免疫球蛋白具有基本相同的分子結(jié)構(gòu)，由2條相同的重鏈和2條相同的輕鏈組成，重鏈和輕鏈都有不變及可變區(qū)域，兩者由二硫鍵連接形成Y型［5］，二硫鍵的位置和數(shù)量決定其種類，每個免疫球蛋白分子有2個抗原結(jié)合位點，即抗原結(jié)合片段(Fab)，F(xiàn)ab片段具有不同的氨基酸，而分子另一端則為Fc片段，具有恒定的氨基酸序列，作為與其他不同類型細(xì)胞結(jié)合的受體［6］。

1 免疫球蛋白的穩(wěn)定性

1.1 溫度對免疫球蛋白穩(wěn)定性的影響

牛初乳滅菌多采用熱處理，而溫度對IgG影響顯著，溫度升高會改變其結(jié)構(gòu)。McMartin［7］等將牛初乳原料60℃條件下加熱120 min，在RVA(快速黏度分析儀)中測試，其免疫球蛋白的粘度和含量均未發(fā)生變化。岳喜慶［8］等采用瓊脂雙向免疫擴(kuò)散法測得牛初乳IgG在低于65℃范圍內(nèi)具有較高的熱穩(wěn)定性，65℃加熱30 min時IgG活性殘存率約為73%，85℃加熱3 min時IgG基本完全失活。劉偉［9］采用同樣方法測得結(jié)果基本一致，另外測得復(fù)原牛初乳IgG在65，70，75，80，85，90 ℃的 D 值分別為 188.68，34.36，6.18，3.07，1.80，0.95 min，在65 ～90 ℃內(nèi)的 Z 值為11.20℃。

Mainer［10］得低溫巴氏殺菌 LTLT(63 ℃，30 min)熱處理幾乎不影響其活性，高溫短時殺菌HTST(72℃，15 s)熱處理并未影響其結(jié)構(gòu)，同樣使用瓊脂糖雙向免疫擴(kuò)散法測得變性率僅為1%。張和平［11］采用單向免疫擴(kuò)散法測定變性率，得出同樣結(jié)論，LTLT、HTST對其影響極小，但不可以采用UHT(超高溫瞬時滅菌)技術(shù)。賈建會［12］等報道指出，IgG對熱的耐受程度與IgG的純度有關(guān)，純度越高，耐受程度越差，純度越低，耐受程度越好。雖然研究報道關(guān)于巴氏殺菌致變性率結(jié)果不一，這可能與使用的測定方法及牛初乳有關(guān)，但巴氏殺菌是目前最佳熱處理方法。

此外，也可以嘗試進(jìn)行冷殺菌處理，Pereira［13］等使用ELISA法測定牛初乳IgG在連續(xù)紫外燈照射下的殘存率，結(jié)果為此法能明顯減少李斯特桿菌和沙門氏桿菌數(shù)量，但對大腸桿菌和鏈球菌作用不明顯，且對IgG造成損失約為50%。蔡育升［14］等研究結(jié)果顯示，使用60Co為放射源輻照，當(dāng)輻照劑量為6 kGy時，大部分微生物被殺死，使牛初乳粉符合要求，通過雙向免疫擴(kuò)散法測定結(jié)果顯示能保持IgG質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.2 pH值對免疫球蛋白穩(wěn)定性的影響

大量文獻(xiàn)顯示，免疫球蛋白一般在過酸過堿條件下均不穩(wěn)定。牛初乳IgG在 pH值約為4.0～10.0之間具有較好的穩(wěn)定性，在pH為4.0～7.0環(huán)境下，低溫巴氏殺菌對其活性影響較小，采用瓊脂雙向免疫擴(kuò)散法測定，結(jié)果顯示0.1%牛初乳粉溶液經(jīng)低溫巴氏殺菌后IgG的活性殘存率在80%以上［8，15］，在溶液pH值低于4時，隨pH值的降低變性率顯著上升，當(dāng)pH值為0.5時，IgG在20 min時已完全變性失活［16］。趙玉娟［17］得到同樣的結(jié)論，pH 為 2.0，3.0時，在37℃水浴中保溫2 h后，采用吸收差法測得變性率分別為80%、68%，當(dāng)pH值下降為1.0和0.8時，免疫球蛋白的變性率可達(dá)到99%以上;當(dāng)pH ＞9.0時，隨著pH值的升高，免疫球蛋白穩(wěn)定性急劇下降，當(dāng)pH為11，水浴保溫2 h和4 h免疫球蛋白的變性率分別上升到39%、61%。這是由于過酸過堿的環(huán)境容易改變IgG結(jié)構(gòu)，使其穩(wěn)定性下降。

1.3 蛋白酶對免疫球蛋白穩(wěn)定性的影響

研究表明，在人體消化系統(tǒng)中，IgG的穩(wěn)定性主要受胃酸及胰蛋白酶的影響［15］。張和平［18］等對免疫乳IgG進(jìn)行體外消化測定時發(fā)現(xiàn)，在pH值為2.0(成年人胃液pH值)時，易受胃蛋白酶作用且很快失活，在pH值為4.0(嬰幼兒胃液pH值)時，對胃蛋白酶具有很高程度的抗性，在pH值為7.0時，在胰蛋白酶的作用下，仍可保持較高程度的免疫活性。因此，IgG在嬰幼兒體內(nèi)活性損失較小。劉偉［15］、鄭海英［19］研究表明，IgG在酸性條件下易受胃蛋白酶的影響，影響其分子結(jié)構(gòu)的完整性，不影響其抗原結(jié)合活性;胰蛋白酶對其影響較小，但影響其抗原結(jié)合能力，這是由于胃蛋白酶和胰蛋白酶的作用位點不同，胰蛋白酶對IgG的降解作用是不可逆的。

此外，何梅齡［20］等研究中發(fā)現(xiàn)，IgG經(jīng)低溫巴氏滅菌處理后，胰蛋白酶對其消化能力影響很小，但經(jīng)90℃高溫3 min處理后，胰蛋白酶對其水解率影響很大，這是由于巴氏殺菌溫度不足以改變其結(jié)構(gòu)，而溫度升高使IgG的胰蛋白酶作用位點顯露出來，所以IgG不能經(jīng)過高溫滅菌，這與張和平［11］研究結(jié)果一致。

1.4 超高壓對免疫球蛋白穩(wěn)定性的影響

任杰［21］等人檢測經(jīng)過不同超高壓處理后樣品(產(chǎn)犢后48 h內(nèi)的牛初乳)中IgG的穩(wěn)定性，結(jié)果顯示與0.1 MPa條件為參照，在壓力500 MPa、溫度35℃、時間20 min條件下，其活性提高率最大。這可能是因為超高壓改變了其結(jié)構(gòu)，使其更容易與抗原發(fā)生特異性結(jié)合，導(dǎo)致活性增強。張和平［22］認(rèn)為，高壓條件下變性還與其所處的溶液介質(zhì)有關(guān)，將IgG處于PBS緩沖液中，室溫下在不同高壓條件處理20 min，其在400 MPa下發(fā)生變性，當(dāng)處于10%脫脂乳中，壓力升高500 MPa時才開始發(fā)生變性，而在蔗糖濃度達(dá)到50%的溶液中，壓力達(dá)700 MPa仍未變性，這可能由于高濃度蔗糖的存在增加了IgG分子內(nèi)部的疏水作用，使其三級結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定。

1.5 其他預(yù)處理方式對免疫球蛋白穩(wěn)定性的影響

鄧淑琴［23］等人以新鮮牛初乳為原料，測定預(yù)處理貯藏方法及解凍方法對牛初乳中IgG提取率和活性的影響，結(jié)果表明，將原料直接放入-20℃冷凍貯藏1個月內(nèi)，其提取率為80%，脫脂牛初乳、乳清冷凍保存的提取率均略低于直接冷凍保存，故選擇直接放入-20℃下冷凍，且成本較低。在后續(xù)解凍過程，綜合IgG活性和解凍速度兩大因素，60℃熱水水浴解凍為最佳，這與大量有關(guān)于溫度對其穩(wěn)定性影響的報道結(jié)果相一致。

2 改善免疫球蛋白穩(wěn)定性方法

2.1 食品添加劑法

食品添加劑，是指為改善食品品質(zhì)和色、香、味以及為防腐、保鮮和加工工藝的需要而加入食品的人工合成或者天然物質(zhì)。在加工生產(chǎn)過程，食品添加劑可能會對免疫球蛋白的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響。

雷昌貴［24］等結(jié)果表明，NaH2PO4等酸性鹽使其穩(wěn)定性降低，山梨酸鉀及Na2HPO4等堿性鹽對IgG的穩(wěn)定性影響較小，乳酸鈣、增稠劑和甜味劑對其有一定的保護(hù)作用。

Chen［25］認(rèn)為，糖、氨基酸、糖醇對 IgG 活性有穩(wěn)定作用，在PBS緩沖溶液中IgG的D值、Z值都明顯低于在濃度為20%的保護(hù)劑溶液中，但是在加工過程添加劑濃度超過20%不現(xiàn)實。張和平［22］在研究高壓條件對IgG活性影響的研究中也同樣發(fā)現(xiàn)蔗糖濃度越高，其在高壓條件下越穩(wěn)定。徐麗［26］對在熱殺菌前添加保護(hù)劑方式進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)添加20%蔗糖、5%葡萄糖、10%山梨醇糖均可使經(jīng)巴氏殺菌后的IgG活性保持在85%以上。雖然蔗糖有助于IgG有助于保持其穩(wěn)定性，但是從營養(yǎng)學(xué)角度講，產(chǎn)品含糖量不宜過高，可多選擇功能性低聚糖、糖醇等。

此外，張建輝［27］等以甘氨酸、蔗糖、甘露醇作為熱保護(hù)劑進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，75℃，5 min熱處理條件下，添加的質(zhì)量分?jǐn)?shù)比例分別為甘氨酸3%、蔗糖3%、甘露醇4%，結(jié)果較為理想，對IgG穩(wěn)定性保護(hù)作用為甘氨酸＞甘露醇＞蔗糖。

2.2 微膠囊技術(shù)

微膠囊技術(shù)，就是利用天然或合成的高分子包囊材料，將固體、液體甚至是氣體的微小物質(zhì)進(jìn)行包埋，封存在一種具有半透性或密封囊膜的微型囊內(nèi)，而成為一種固體微粒產(chǎn)品的技術(shù)［28］。

牛初乳免疫球蛋白微膠囊化主要方法有乳化縮聚法，復(fù)乳溶媒蒸發(fā)/萃取法，噴霧干燥法，復(fù)凝聚法等［29］。在鄭海英［19］研究中，與復(fù)凝聚法相比，乳化縮聚法包埋率較高，此法制備IgG微膠囊的最佳工藝的用量分別為明膠43%，IgG 3.4%，乳化劑1.25%，包埋率可達(dá)75%，貯存穩(wěn)定性良好。將微膠囊化的牛乳IgG添加到原料乳中制備酸奶，能夠增強IgG在加工過程中的抗熱、抗酸能力，并減少通過胃腸道時受損率。

徐麗［26］以聚丙烯酸樹脂為壁材將免疫球蛋白微膠囊化，最佳工藝為:蔗糖酯0.2%，明膠0.75%，聚苯丙烯酸樹脂1.0%，電泳圖譜分析體外模擬胃液實驗，結(jié)果顯示在60 min時殘存率為80%，120 min時還有部分完整的IgG分子，且IgG活性損失速率減緩。

在微膠囊生產(chǎn)過程多加入有機溶劑，近年來多傾向使用安全無毒的材料，王璐怡［30］等以大豆油為油溶性介質(zhì)，阿拉伯膠(GA)和麥芽糊精(MD)為壁材，采用乳化噴霧法得出最佳工藝條件為:油水體積比3∶4，壁材添加量5%(GA與MD質(zhì)量比1∶2)、進(jìn)風(fēng)溫度140℃，此包埋率為81.24%，具有較好的完整性和致密性，基本保持了IgG原有的結(jié)構(gòu)及營養(yǎng)價值。

3 展望

牛初乳的營養(yǎng)價值是常乳所不能比擬的，其含有的免疫球蛋白的生理功能越來越受人們的重視，目前對影響免疫球蛋白穩(wěn)定性的因素有較多的研究，但是對其穩(wěn)定性的機理及其結(jié)構(gòu)變化研究甚少，因此，進(jìn)一步研究其具體結(jié)構(gòu)與穩(wěn)定性之間的關(guān)系具有重大意義;另一方面，國內(nèi)基本采用瓊脂免疫擴(kuò)散法來檢測IgG含量，其耗時長、誤差大，不適合大批量樣品操作，而膠體金法特異性好，操作簡單，效率高［31］，但是不穩(wěn)定，國外部分檢測IgG含量的方法傾向于ELISA方法，此方法效率高，適合大批量生產(chǎn)，故今后可研究此2種方法來測定IgG含量。另外微膠囊技術(shù)發(fā)展推動了牛初乳產(chǎn)業(yè)發(fā)展，但對其穩(wěn)定性提高方法還有待探討，應(yīng)增強生產(chǎn)的可行性，實現(xiàn)規(guī)?；?，無論在食品添加劑保護(hù)法還是在微膠囊法，都應(yīng)從營養(yǎng)學(xué)角度出發(fā)，最大程度上保持其活性，進(jìn)行有效利用，且在滿足人身體所需的同時，應(yīng)多采用天然材料，促進(jìn)牛初乳工業(yè)發(fā)展。

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