人類受精相關(guān)精子功能蛋白質(zhì)研究進展

張蔚，李建遠，谷翊群＊

（1.北京協(xié)和醫(yī)學院研究生院，北京 100730；2.國家衛(wèi)生計生委男性生殖健康重點實驗室，國家衛(wèi)生計生委科學技術(shù)研究所，北京 100081）

目前不育癥患病率逐年增高，全球已有約15%的夫婦患有不育癥［1］。在不育癥的發(fā)病因素中，男性因素占到了50%［2］，對男性不育病因的評價結(jié)果將影響不育癥的治療方法選擇。現(xiàn)在臨床上仍使用常規(guī)精液分析作為檢測和評價男性生育力的主要方法，評價指標主要包括精子數(shù)量、精子運動能力和正常精子形態(tài)學的百分率，這些指標只能反映出達到自然妊娠所要求的最低精子質(zhì)量，不能反映精子功能與超微結(jié)構(gòu)的損傷。并且受每次射精的內(nèi)在變異性與精液分析的精準性限制，常規(guī)精液分析結(jié)果并不能直接反映出精子的實際受精能力，無法準確評價男性生育力。近10年精子蛋白質(zhì)組學得到長足發(fā)展［3］，尤其是比較精子蛋白質(zhì)組學通過比較不同質(zhì)量精液標本的蛋白質(zhì)表達，能鑒定出某些可能導(dǎo)致男性不育的獨特精子蛋白質(zhì)［4］。這些與精子受精功能相關(guān)的蛋白質(zhì)有可能成為診斷男性不育和評估預(yù)后的新標志物，從而能夠更準確地判斷男性的生育狀態(tài)和生殖潛能，為患者提供更準確、更經(jīng)濟的治療手段。本文按照自然狀態(tài)下精子受精的生理過程對人類受精相關(guān)精子功能蛋白質(zhì)予以綜述，闡述這些蛋白質(zhì)分子在精子受精過程中發(fā)揮的作用，并對其在評價男性生殖潛能上的應(yīng)用前景予以展望。

一、精子運動及獲能

精子在睪丸產(chǎn)生，經(jīng)過附睪后形態(tài)學與功能上已經(jīng)發(fā)育成熟，但還不具有使卵母細胞受精的能力［5］。只有當精子從男性生殖道射出并進入女性生殖道后，去獲能因子被解除，精子膜的流動性和通透性增加［6-8］，精子發(fā)生超活化并且獲能后才會快速運動突破女性生殖道生理屏障與卵母細胞相遇，繼而發(fā)生頂體反應(yīng)直至使卵母細胞受精［9］。與精子運動及獲能有關(guān)的人類精子功能蛋白質(zhì)如下：

1.去整合素區(qū)和金屬蛋白酶區(qū)蛋白（ADAM）：ADAM 是近年來發(fā)現(xiàn)的一組錨定于細胞膜的細胞表面蛋白家族，該家族成員具有顯著的結(jié)構(gòu)特點，有數(shù)個較為保守的潛在功能區(qū)。目前發(fā)現(xiàn)人類ADAM家族有26 個成員，其中超過一半的蛋白特異性或者主要表達于睪丸和附睪組織，這意味著它們在男性生殖中發(fā)揮著重要作用［10］。大部分ADAM蛋白在生精細胞以前體形式合成，在精子發(fā)生和附睪運輸中發(fā)生水解被切割成為成熟形式表達在精子表面。ADAMs多以復(fù)合物的形式存在，如ADAM1β-ADAM2，ADAM2-ADAM3-ADAM4等。ADAM 在精子運動及獲能環(huán)節(jié)發(fā)揮的作用是促進精子在女性生殖道內(nèi)的運動，主要由ADAM3與其它ADAM 蛋白組成復(fù)合物促進精子與輸卵管上皮細胞表面的精子相關(guān)因子粘附使精子暫時儲存于UTJ和輸卵管峽部，而這一作用又是隨后精子進入輸卵管所必需的過程［11］?；蚯贸齽游锬Ｐ妥C實ADAM3-／-雄性小鼠的精子由于從子宮運動至輸卵管的能力受損而不育［12］。

2.CatSper蛋白：是調(diào)節(jié)Ca2＋進入精子細胞主要的電壓門控通道，對于精子的運動功能非常重要。CatSper蛋白分布在精子主段的細胞膜上，人和小鼠等很多哺乳動物的CatSper通道由CatSper 1～4這4個蛋白組成，還有2 個輔助亞基CatSperβ和CatSperγ［8］。已經(jīng) 證 實CatSper-／-雄 性 小 鼠 精 子 由于不能超活化從而不能穿透卵子細胞外基質(zhì)導(dǎo)致雄性小鼠不育，人類CatSper1 基因突變會導(dǎo)致男性不育［13］。

3.Gelsolin蛋白：又稱凝溶膠蛋白，未獲能精子的Gelsolin蛋白位于人類精子尾部，當精子獲能時Ca2＋濃度增加導(dǎo)致Gelsolin蛋白構(gòu)象發(fā)生改變從精子尾部移位至精子頭部暴露出纖維狀肌動蛋白結(jié)合位點。由于4，5-二磷酸磷脂酰肌醇（PIP2（4，5））水平增加以及絡(luò)氨酸蛋白激酶SRC 家族的磷酸化使Gelsolin蛋白處于被抑制狀態(tài)，肌動蛋白因此發(fā)生聚合，引發(fā)精子超活化［7］。

4.附睪蛋白酶抑制因子（Eppin）：由人睪丸支持細胞和附睪上皮細胞分泌，表達于人類精子頭部頂體區(qū)和鞭毛，頂體反應(yīng)后表達于赤道區(qū)和尾部。精子表面Eppin與乳鐵蛋白（LTF）和凝集素（Clus-terin）形成復(fù)合物，射精時精囊腺分泌的精囊蛋白（SEMG）結(jié)合到Eppin蛋白復(fù)合物上發(fā)揮Eppin的功能［14］。Eppin的功能有：（1）與SEMG1結(jié)合調(diào)節(jié)精子表面前列腺特異抗原（PSA）的酶活性；（2）對精子產(chǎn)生抗菌保護；（3）作為SEMG1受體與SEMG1結(jié)合抑制精子運動。其分子機制是SEMG1 與Eppin結(jié)合后會抑制或逆轉(zhuǎn)精子細胞內(nèi)堿性化水平，從而抑制Ca2＋攝入，導(dǎo)致精子前向運動能力喪失［15］。當精液射出后精漿中的PSA 水解SEMG1隨后精子獲得前向運動能力。Eppin抗體與Eppin結(jié)合后會抑制細胞內(nèi)Ca2＋濃度的增加阻斷頂體反應(yīng)的發(fā)生［16］。

5.表皮生長因子受體（EGFR）：表達于人類精子質(zhì)膜上，可以直接被其配體表皮生長因子（EGF）激活，也可被蛋白激酶A（PKA）間接激活，或者由G 蛋白偶聯(lián)受體（GPCRs）反式激活。精子獲能時上述幾個因子激活EGFR，導(dǎo)致磷脂酶D（PLD）活化和肌動蛋白聚合［17］。

二、頂體反應(yīng)

獲能的精子與卵母細胞相遇后，精子頂體在接觸到卵丘細胞時誘發(fā)了精子質(zhì)膜與頂體外膜的融合，頂體內(nèi)的各種酶被釋放出來將卵母細胞透明帶水解形成入卵通道，頂體內(nèi)膜上的精卵識別和融合位點暴露，這一過程稱為頂體反應(yīng)［6］。頂體反應(yīng)是受精所必須經(jīng)歷的過程，只有獲能且發(fā)生頂體反應(yīng)的精子才能夠進入卵周間隙，和卵膜接觸、結(jié)合并最終融合。與頂體反應(yīng)有關(guān)的人類精子功能蛋白質(zhì)如下：

1.Gelsolin蛋白：在精子運動及獲能中發(fā)揮著重要作用，精子獲能后頂體反應(yīng)發(fā)生前不久細胞內(nèi)的Ca2＋濃度再次升高，激活了磷脂酶C（PLC），PLC將PIP2（4，5）水 解 使 與PIP2（4，5）結(jié) 合 的Gelsolin蛋 白被釋放入胞質(zhì)中。此時游離的Gelsolin蛋白因脫磷酸作用被激活，活化的Gelsolin蛋白使纖維狀肌動蛋白分離從而誘發(fā)頂體反應(yīng)［7，9］。

2.表皮生長因子受體（EGFR）：在獲能后期，EGFR 的進一步激活增加了細胞內(nèi)的Ca2＋濃度，從而激活Gelsolin蛋白，導(dǎo)致纖維狀肌動蛋白分解，最終使頂體反應(yīng)發(fā)生［7，9］。在體內(nèi)，生理條件下精子蛋白激酶A（PKA）主要由HCO3-激活，而表皮生長因子（EGF）以及G 蛋白偶聯(lián)受體（GPCRs）則由女性生殖道的生理成分血管緊張素Ⅱ或者溶血磷脂酸激活［17］。

3.分泌性肌動蛋白結(jié)合蛋白（SABP）：最初是從人精漿分離出來，表達于人類精子尾部中段。SABP可以和肌動蛋白結(jié)合起到類似抗肌動蛋白抗體的作用，從而抑制精子獲能和頂體反應(yīng)。已有研究顯示少弱精子癥患者SABP表達量明顯高于正常對照組［18］，而反復(fù)IVF-ET 失敗患者與正常生育對照組的精子蛋白質(zhì)表達分析顯示，IVF-ET 反復(fù)失敗患者的SABP表達也明顯高于對照組。

三、精子與卵母細胞透明帶結(jié)合

人卵母細胞透明帶由4 種糖蛋白（ZP1、ZP2、ZP3、ZP4）組成［19］，構(gòu)成了精卵受精過程的屏障。頂體反應(yīng)發(fā)生后、形成入卵通道之前，精子需要和透明帶結(jié)合形成一種穩(wěn)定的狀態(tài)，這種狀態(tài)對于精子隨后溶解透明帶是十分必要的，精子頭部的蛋白是形成該狀態(tài)的關(guān)鍵分子。與精卵結(jié)合有關(guān)的人類精子功能蛋白質(zhì)如下：

1.富含半胱氨酸分泌蛋白（CRISP）：CRISP家族成員都含有16 個保守的半胱氨酸殘基，其中10個聚集在C 末端。CRISP-1以雄激素依賴的方式由附睪合成，分布于頂體反應(yīng)精子的赤道區(qū)。人CRISP1蛋白（hCRISP1）是一種多功能蛋白，通過抗CRISP1 抗體和重組CRISP1 蛋白作用發(fā)現(xiàn)hCRISP1可以與人卵母細胞透明帶ZP3 特異結(jié)合［20］。

2.熱休克蛋白A2（HSPA2）：人睪丸特異HSP70蛋白異構(gòu)體，是一種分子伴侶。研究發(fā)現(xiàn)該分子伴侶與男性不育相關(guān)，在介導(dǎo)精卵識別中發(fā)揮重要作用［21］。作為分子伴侶，HSPA2 并不是直接參與人類精子與透明帶的結(jié)合，而是通過與精子粘附分子1（SPAM1）和芳香基硫酸酯酶（ARSA）組合成多聚透明帶受體復(fù)合物，間接參與精子和透明帶的相互作用［22］。SPAM1具有透明質(zhì)酸酶活性，可以分解卵丘復(fù)合物，ARSA 則可以直接粘附到ZP上，二者通過HSPA2 的調(diào)配來發(fā)揮各自的作用。如果沒有HSPA2，作為透明質(zhì)酸酶受體的SPAM1和ZP受體的ARSA 都不能發(fā)揮作用，從而無法完成受精［22-23］。

四、精卵融合

精子穿過透明帶后進入卵周間隙，此時精卵膜融合是精子頭部內(nèi)的遺傳物質(zhì)輸送入卵母細胞內(nèi)的關(guān)鍵因素，也是受精成功最重要的一步。精卵膜融合是由精子膜和卵膜表面互補配對的特異性蛋白質(zhì)分子介導(dǎo)的。與精卵融合有關(guān)的人類精子功能蛋白質(zhì)如下：

1.ADAM 家族：精卵融合中主要由ADAM2與其它 ADAM 蛋白形成的復(fù)合物發(fā)揮作用。ADAM2是卵母細胞表面整合素α6β1 的受體，通過二者的相互作用增強精子質(zhì)膜與卵母細胞質(zhì)膜的粘附，ADAM2-／-雄性小鼠表現(xiàn)出精卵膜粘附和融合缺陷［24］。含有ADAM2和ADAM3的復(fù)合物在體外同樣可以促進精卵相互作用。

2.IZUMO：屬于I型膜蛋白免疫球蛋白超家族，具有一個細胞外Ig區(qū)和一個N 末端區(qū)。這一家族由四個蛋白組成，從1到4命名，在N 末端區(qū)有顯著同源性，因此也稱為IZUMO 區(qū)。IZUMO1、2和3僅表達于人睪丸表面，而4是可溶性蛋白可以在人睪丸和其他組織表達。精卵融合必需的IZUMO1在女性生殖道內(nèi)運動和受精時表達于精子的不同部位，頂體反應(yīng)時IZUMO1會從精子頭部前區(qū)重新分布到將要發(fā)生融合的部位，也就是赤道區(qū)［25］。卵母細胞表面IZUMO1 的受體 是JUNO（葉酸受體4，以羅馬的婚姻和生育女神JUNO 命名），二者互補結(jié)合后介導(dǎo)精卵膜融合。IZUMO1和JUNO 是到目前為止唯一確定的精卵融合必需的 配 對 受 體［26］。 已 有 動 物 實 驗 結(jié) 果 表 明，IZUMO1-／-雄性小鼠可以正常交配和射精并形成陰道栓，但是由于精子不能與卵母細胞融合，導(dǎo)致雄鼠完全不育［25］。JUNO 在未受精卵母細胞表面高度表達，JUNO-／-雌性小鼠也由于精卵融合障礙而絕對不孕［26］。

3.富含半胱氨酸分泌蛋白（CRISP）：人CRISP1蛋白（hCRISP1）不僅介導(dǎo)精子與卵子透明帶結(jié)合，還通過與卵母細胞表面的互補位點結(jié)合在精卵融合中發(fā)揮作用［20］。CRISP-2 則是以非雄激素依賴的方式表達于睪丸，它是一種頂體內(nèi)蛋白，頂體反應(yīng)后仍然存在于精子表面，在隨后的精卵融合中起作用。抗人CRISP-2蛋白抗體可以抑制精子穿入卵母細胞。CRISP-1 和CRISP-2 與卵母細胞表面共同的互補位點結(jié)合，協(xié)同作用確保成功受精［27］。

4.ERp57：主要來源于人類睪丸組織生精細胞胞質(zhì)以及睪丸間質(zhì)細胞，睪丸支持細胞也少量產(chǎn)生。ERp57分泌后結(jié)合于人類精子頂體和尾部，頂體反應(yīng)后移位至赤道區(qū)。精子獲能時ERp57蛋白發(fā)生了翻譯后修飾。用抗體阻斷ERp57可以劑量依賴的方式顯著抑制人類精子穿透去透明帶倉鼠卵母細胞的能力。ERp57的表達水平也與生殖能力相關(guān)，IUI周期妊娠率高的捐精者其精子蛋白ERp57 的表達高于周期妊娠率低者［28］。IVF 成功率較低的患者其ERp57表達水平明顯低于成功率高的患者以及已生育的捐精者。這些結(jié)果顯示ERp57是人類精子頂體蛋白組成之一，在精卵融合中發(fā)揮至關(guān)重要的作用［29］。

綜上所述，人類受精這一過程受到多種精子蛋白質(zhì)分子的調(diào)控，但大部分蛋白質(zhì)分子在精子運動活力、獲能、頂體反應(yīng)以及精卵融合等環(huán)節(jié)中的具體作用機理仍不是非常清楚。隨著蛋白質(zhì)組學研究技術(shù)的應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)了一些與人類精子受精相關(guān)的功能蛋白質(zhì)［30］，比如臨床研究中發(fā)現(xiàn)一些和生殖結(jié)局明確相關(guān)的蛋白質(zhì)分子［28-29］，一些蛋白質(zhì)分子還可以對某些疾病進行無創(chuàng)性診斷［30］。目前，評估男性生殖能力的方法仍然以檢測精子活力、濃度、形態(tài)等常規(guī)精液分析為主，但是這一傳統(tǒng)的評估方法并不能準確反映男性的真實生育力，因此會給患者帶來不必要的時間、經(jīng)濟以及心理壓力。個體間的受精能力差異是由受精相關(guān)的蛋白質(zhì)分子組成不同導(dǎo)致的［31］，如果能夠檢測出這些與受精能力相關(guān)的蛋白質(zhì)分子，建立生物標記物檢測方法，對精子受精能力進行有效評價并對生殖結(jié)局進行預(yù)測，將對男性不育的臨床診斷和治療帶來極大的便利。

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