金銀花中黃酮類(lèi)化合物的提取及其檢測(cè)方法的研究進(jìn)展

李杰，和素娜，楊暉，王學(xué)廷

（河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院，河南洛陽(yáng)471003）

金銀花中黃酮類(lèi)化合物的提取及其檢測(cè)方法的研究進(jìn)展

李杰，和素娜，楊暉，王學(xué)廷

（河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院，河南洛陽(yáng)471003）

黃酮類(lèi)化合物是金銀花的有效成分之一，具有優(yōu)良的抗氧化、清除自由基、抗炎及調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)等作用。目前金銀花中黃酮類(lèi)化合物的提取方法主要包括浸提法、乙醇回流法、超聲波法和微波法，但對(duì)其純化方法的研究還比較欠缺。通常采用紫外可見(jiàn)分光光度法、高效液相色譜法和毛細(xì)管電泳法來(lái)檢測(cè)金銀花提取液中的黃酮類(lèi)化合物，相比較而言紫外可見(jiàn)分光光度法最為常用，接下來(lái)是高效液相色譜法，最后為毛細(xì)管電泳法。對(duì)金銀花中黃酮類(lèi)化合物的提取工藝及其檢測(cè)方法做了簡(jiǎn)單的綜述，旨在為我國(guó)的金銀花以及金銀花中黃酮類(lèi)化合物的開(kāi)發(fā)、研究、利用提供借鑒。

金銀花；黃酮類(lèi)化合物；提??；檢測(cè)

金銀花（Flos Lonicerae）為忍冬科忍冬屬植物忍冬的干燥花蕾，又名忍冬花、雙花，具有清熱解毒、涼散風(fēng)熱之功效，是我國(guó)傳統(tǒng)的藥食同源植物。研究表明金銀花中含有揮發(fā)油［1］、多糖［2-3］、黃酮類(lèi)［4-5］、有機(jī)酸類(lèi)［6-7］、三萜類(lèi)［8-9］等多種化合物。早期對(duì)于金銀花的研究主要集中在有機(jī)酸類(lèi)的研究，尤其是綠原酸的研究。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)金銀花中的黃酮類(lèi)化合物也具有優(yōu)良的生理活性，如抗菌、抗病毒、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗氧化及抗自由基、抗癌、防癌和抑制脂肪酶等，并且無(wú)毒無(wú)害。因此，對(duì)金銀花中黃酮類(lèi)化合物的研究引起了廣大學(xué)者的重視，研究進(jìn)展很快。

黃酮類(lèi)化合物（Flavonoids）是植物在長(zhǎng)期自然選擇過(guò)程中產(chǎn)生的一類(lèi)次生代謝產(chǎn)物［10］。黃酮類(lèi)化合物大致分為：黃酮類(lèi)、黃酮醇類(lèi)、二氫黃酮類(lèi)、異黃酮類(lèi)等。金銀花中所含有的黃酮類(lèi)化合物主要隸屬于黃酮和黃酮醇兩類(lèi)。在我國(guó)金銀花作為經(jīng)濟(jì)型作物在各省區(qū)均有大規(guī)模的人工種植區(qū)，資源豐富。因此，為了更好的開(kāi)發(fā)、利用好我國(guó)的金銀花資源，本文對(duì)金銀花中黃酮類(lèi)化合物的提取方法與檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述。

1金銀花中黃酮類(lèi)化合物的提取方法

1.1浸提法

周才瓊［11］以乙醇溶度、浸提時(shí)間和物料比為因素，進(jìn)行正交試驗(yàn)，探討了金銀花中黃酮類(lèi)化合物浸提法提取的最佳工藝條件。結(jié)果表明，乙醇溶度對(duì)金銀花中黃酮類(lèi)化合物的提取效果影響顯著，其次是物料比，最后是浸提時(shí)間，認(rèn)為金銀花中黃酮類(lèi)化合物浸提法的最佳提取工藝為：乙醇濃度90%，物料比1∶12，浸提溫度70℃，浸提時(shí)間60 min。

1.2乙醇回流法

沈玲玲［12］探討了回流溫度對(duì)總黃酮提取的影響，試驗(yàn)結(jié)果表明乙醇濃度和回流溫度對(duì)黃酮類(lèi)化合物的提取影響高度顯著，料液比影響不顯著，提取時(shí)間的影響可忽略。篩選出了金銀花中黃酮類(lèi)化合物的最佳提取工藝：40%乙醇為提取劑，料液比為1∶20，80℃提取3 h，黃酮類(lèi)化合物的單位浸出量為111.03 mg/g。賈霖［13］討論了乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時(shí)間和料液比對(duì)黃酮提取的影響，并以乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度和料液比為因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)料液比對(duì)黃酮類(lèi)化合物的提取影響最大，然后依次是提取溫度和乙醇濃度，最佳提取條件為：提取溫度60℃，乙醇濃度60%，料液比1∶15 g/mL，提取4 h，黃酮提取率為10.49%。關(guān)炳峰［14］采用旋轉(zhuǎn)正交設(shè)計(jì)，對(duì)影響金銀花中黃酮類(lèi)物質(zhì)提取率的關(guān)鍵因素及相互作用進(jìn)行了探討，得出了乙醇回流提取的最佳工藝：乙醇濃度65%，提取溫度為65℃，提取時(shí)間1.75 h，料液比1∶15 g/mL，提取3次，金銀花中黃酮類(lèi)物質(zhì)的提取量達(dá)128.60 mg/g。

1.3超聲波輔助提取法

超聲波輔助提取主要利用超聲波在溶劑和提取樣之間產(chǎn)生的空化作用，在其作用下，溶液內(nèi)部產(chǎn)生強(qiáng)的沖擊波和微射流，局部產(chǎn)生高溫、高壓，導(dǎo)致多重次級(jí)效應(yīng)，如擊碎、乳化、擴(kuò)散和強(qiáng)烈的機(jī)械振蕩等，從而加快體系的傳質(zhì)和傳熱速率。

李曉軍［15］以超聲時(shí)間、超聲功率和料液比為自變量，利用響應(yīng)曲面法對(duì)金銀花中黃酮類(lèi)化合物的超聲提取工藝參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化研究。結(jié)果顯示當(dāng)超聲時(shí)間為21.35 min，超聲功率為472.24 W，料液比為1∶34.62，提取2次時(shí)，黃酮類(lèi)化合物的提取效果最佳，在此工藝下金銀花中的總黃酮提取率為8.87%，與金銀花總黃酮提取率的理論值9.09%相近。說(shuō)明采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化得到的工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)用價(jià)值。許靈君［16］采用乙醇-硫酸銨雙水相體系協(xié)同超聲提取金銀花中的黃酮類(lèi)化合物，通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)考察了提取時(shí)間、料液比、醇水比和硫酸銨濃度對(duì)總黃酮提取率的影響。正交試驗(yàn)結(jié)果表明各因素影響強(qiáng)弱依次為：醇水比、硫酸銨濃度、提取時(shí)間、料液比；最優(yōu)化條件為60%乙醇，料液比1∶25，醇水比0.7，硫酸銨濃度0.27 g/mL，50℃超聲提取75 min。

1.4微波輔助提取法

微波輔助提取法是利用分子極化或離子導(dǎo)電效應(yīng)直接對(duì)物質(zhì)進(jìn)行加熱，因此熱效率高、升溫快速均勻。微波提取法具有選擇性高、操作時(shí)間短、溶劑消耗量少、提取效率高、污染小等優(yōu)點(diǎn)。

梁萱［17］通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)，對(duì)微波輻射下的溶劑溶度、溫度、微波輻射時(shí)間、料液比對(duì)黃酮類(lèi)化合物提取的影響進(jìn)行了研究。通過(guò)對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果的分析發(fā)現(xiàn)，影響金銀花中黃酮提取的因素依次是微波輻射時(shí)間、料液比、乙醇濃度、提取溫度。最佳工藝條件是：提取溫度50℃，料液比1∶30，乙醇濃度80%，微波輻射時(shí)間45 min。在最佳工藝條件下，黃酮的得率為4.45%。李菁［18］采用微波法對(duì)金銀花不同花期中的總黃酮進(jìn)行了測(cè)定，并在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)法對(duì)料液比、微波功率、提取溫度和提取時(shí)間等條件進(jìn)行優(yōu)化，篩選出其最佳提取工藝參數(shù)，即料液比為1∶10，微波功率500 W，提取溫度50℃，提取時(shí)間20 min。

1.5其它提取方法

靳學(xué)遠(yuǎn)［19］采用超臨界CO2萃取技術(shù)萃取金銀花中的總黃酮，并同熱醇浸泡法、微波輔助提取法和超聲輔助提取法進(jìn)行了對(duì)比。得到超臨界CO2萃取的最佳條件為：壓力30 MPa，溫度40℃，時(shí)間120 min，夾帶劑（無(wú)水乙醇）用量4.5 mL，總黃酮提取率最高為10.24%。同上述3種方法相比，超臨界CO2萃取法得率高、時(shí)間短。

縱偉［20］應(yīng)用超高壓技術(shù)提取金銀花中的黃酮類(lèi)化合物，采用正交試驗(yàn)的方法考察了粉碎度、超高壓壓力、保壓時(shí)間及固液比對(duì)黃酮類(lèi)化合物提取的影響。通過(guò)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的極差分析可知各因素對(duì)黃酮類(lèi)化合物提取得率的影響程度依次是保壓時(shí)間、粉碎度、壓力和固液比。最佳提取條件為，保壓時(shí)間5 min，壓力360 MPa，粉碎度80目，固液比1∶14。在最佳條件下，黃酮化合物的提取率為13.56%，高于熱醇浸泡法、微波法和超聲法。

謝威［21］在復(fù)合酶的存在下，采用恒溫水浴法提取金銀花中的黃酮類(lèi)化合物，從正交試驗(yàn)結(jié)果和方差分析結(jié)果可知，各因素的影響程度是：溫度、酶加量、提取時(shí)間、酶比例和攪拌速度。最佳試驗(yàn)條件為：提取溫度80℃，酶總量0.12 g（纖維素酶∶果膠酶=1∶1），轉(zhuǎn)速800 r/min，提取時(shí)間50 min，黃酮類(lèi)化合物的提取率為4.60%。

2黃酮類(lèi)化合物的檢測(cè)方法

2.1紫外分光光度法

紫外分光光度法是測(cè)定黃酮類(lèi)化合物含量常用的方法。通常在堿性條件下，以蘆丁作為對(duì)照品，NaNO2-Al（NO3）3為顯色劑，顯色反應(yīng)后，檢測(cè)溶液在510 nm處的吸收強(qiáng)度，來(lái)確定黃酮類(lèi)化合物的含量。郭亞建［22］對(duì)這種方法的專(zhuān)屬性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)具有鄰二酚羥基的非黃酮類(lèi)物質(zhì)會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生很大的影響，并且此法不能檢測(cè)出黃酮類(lèi)成分的黃岑素、山柰酚。馬陶陶［23］對(duì)此法進(jìn)行了改進(jìn)，以甲醇為溶劑，在pH為5.2的NaAC-HAc緩沖鹽溶液的體系下，加入2 mL 0.1 mol/L AlCl3顯色劑，40℃水浴10 min，提高了該法的準(zhǔn)確度，并且消除了含有鄰二酚羥基的非黃酮類(lèi)化合物的干擾。由于甲醇的溶解范圍有限，并且有一定的毒性，裴詠萍［24］用乙醇代替了甲醇，得到了該法的最優(yōu)條件：0.5 mL 0.1 mol/L AlCl3顯色劑，緩沖鹽溶液pH為6.3，20℃～30℃顯色15 min。

王珂［25］以5，7-二羥基-6，4ˊ-二甲基黃酮為對(duì)照品，采用三波長(zhǎng)分光光度法檢測(cè)金銀花及葉中的的總黃酮含量，三波長(zhǎng)分光光度法能有效的消除吸收峰不對(duì)稱(chēng)給定量分析造成的影響，并能校正干擾組分可能產(chǎn)生的線性吸收，測(cè)量結(jié)果更加準(zhǔn)確、可靠。

2.2高效液相色譜法

黃雄［26］建立了同時(shí)檢測(cè)金銀花提取液中綠原酸和4種黃酮成分，即蘆丁、木犀草素7-O-β-D-半乳糖苷、忍冬苷和槲皮素含量的高效液相色譜法，具體條件如下：色譜柱Aglient Zorbax 80A（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈-0.5%磷酸，梯度洗脫，流速為1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)355 nm，柱溫30℃，進(jìn)樣量10 μL。在上述條件下，5個(gè)峰的分離度大于1.5，色譜峰完全分開(kāi)。5個(gè)化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線呈良好的線性關(guān)系，該法適合同時(shí)測(cè)定金銀花中綠原酸和黃酮類(lèi)成分的含量。

王麗婷［27］建立了金銀花及其葉中黃酮類(lèi)物質(zhì)槲皮素和木犀草素的含量測(cè)定方法：色譜柱為Zorbax 80A，Extend-C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm），以甲醇-0.02%磷酸（50∶50）為流動(dòng)相，流速為1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)350 nm，柱溫30℃，進(jìn)樣量10 μL。槲皮素和木犀草素分別在4.0 μg/mL～20 μg/mL和3.8 μg/mL～19 μg/mL的濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.32%～3.34%之間。

胡海山［28］開(kāi)發(fā)出了高效液相色譜法同時(shí)檢測(cè)金銀花中3種有機(jī)酸（綠原酸、咖啡酸和阿魏酸）和3種黃酮類(lèi)物質(zhì)（蘆丁、木犀草苷和槲皮素）含量的方法，色譜柱：Agilent TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸水溶液，流速：1 mL/min，梯度洗脫，柱溫：室溫，檢測(cè)波長(zhǎng)：355 nm，進(jìn)樣量：20 μL。6個(gè)組分特征峰的峰面積標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD≤0.92%，說(shuō)明該方法的測(cè)量結(jié)果準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，同時(shí)該法改變了把有機(jī)酸和黃酮類(lèi)分離后再測(cè)定的方法，節(jié)省了時(shí)間。

蔡熠［29］以Diamonsil C18柱（150mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱，甲醇-0.2%三氟乙酸（55∶45）為流動(dòng)相，流速1 mL/min，在檢測(cè)波長(zhǎng)350 nm，柱溫25℃，進(jìn)樣量20 μL的條件下，檢測(cè)金銀提取液中的槲皮素和木犀草素，結(jié)果表明槲皮素在5 mg/L～100 mg/L的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.33%（n=3）。木犀草素在0.25 mg/L～5 mg/L的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.13%（n=3）。

2.3毛細(xì)管電泳法

顏流水［30］建立了測(cè)定金銀花中綠原酸、蘆丁和槲皮素的毛細(xì)管電泳方法，采用熔融石英毛細(xì)管（64.5cm× 50 μm，有效長(zhǎng)度56 cm），作為分離通道，以30 mmol/L硼砂（pH=9.3）為緩沖溶液，分離電壓20 kV，毛細(xì)管柱溫25℃，綠原酸檢測(cè)波長(zhǎng)為340 nm，蘆丁和槲皮素的檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm。在15 min內(nèi)3種組分實(shí)現(xiàn)了有效分離，3種組分在5 mg/L～200 mg/L的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.4%、1.4%和2.9%（n=5）。

王海燕［31］建立了同時(shí)檢測(cè)金銀花中蘆丁、綠原酸、槲皮素和咖啡酸含量的毛細(xì)管電泳分析方法，采用未涂層彈性石英毛細(xì)管柱（50.0 cm×75 μm，有效長(zhǎng)度40 cm），20 mmol/L pH=9.5的硼砂為緩沖溶液，分離電壓20 kV，柱溫25℃，PDA檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm，陽(yáng)極壓力進(jìn)樣0.5 psi×3 s。結(jié)果顯示，蘆丁、綠原酸、槲皮素和咖啡酸在2.5 μg/mL～500 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，4種組分的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.9%，2.3%，1.1%和2.4%。

2.4其它檢測(cè)方法

薛長(zhǎng)暉［32］采用膠束增敏熒光法對(duì)金銀花中的黃酮類(lèi)化合物進(jìn)行了含量測(cè)定，以蘆丁為對(duì)照品，激發(fā)波長(zhǎng)為433 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為495 nm。通過(guò)研究測(cè)定時(shí)間、干擾離子、表面活性劑、溫度以及pH對(duì)含量測(cè)定的影響，優(yōu)選出了膠束增敏熒光法的最佳測(cè)定條件：室溫20℃，靜置15 min，醋酸鈉-醋酸緩沖液pH為11，表面活性劑為環(huán)糊精，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.02%。Ca2+、淀粉、葡萄糖對(duì)該法基本無(wú)影響，但Fe3+對(duì)檢測(cè)的干擾很大。

3結(jié)語(yǔ)

隨著對(duì)金銀花研究的深入，其中包含的化學(xué)組分和有效成分也在不斷的得到闡明。雖然目前金銀花中黃酮類(lèi)化合物的提取方法較多，但是單一化學(xué)組分的分離和純化研究還比較匱乏，阻礙了黃酮類(lèi)化合物的發(fā)展。因此需要利用先進(jìn)的科學(xué)技術(shù)對(duì)金銀花的黃酮粗提取物進(jìn)行分離純化，來(lái)深入研究其藥理作用，這對(duì)闡明黃酮類(lèi)化學(xué)物的藥理作用，開(kāi)發(fā)、研制新型藥物都具有重大意義。此外，開(kāi)發(fā)、優(yōu)化金銀花中黃酮類(lèi)化合物含量的測(cè)定方法，對(duì)提高金銀花的質(zhì)量控制水平有著非常重要的現(xiàn)實(shí)意義，同時(shí)也可為金銀花的開(kāi)發(fā)、利用提供重要的理論參考。

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Progress on Extraction and Determination Methods of Flavonoids in Flos Lonicerae

LI Jie，HE Su-na，YANG Hui，WANG Xue-ting
（Medical College，Henan University of Science and Technology，Luoyang 471003，Henan，China）

Flavonoid is an effective ingredient of Flos lonicerae，which has strong biological and physiological activity，such as antioxidant，scavenging free radicals，anti inflammatory，regulating the cardiovascular system and so on.At present，the main extraction methods of flavonoids from flos lonicerae include：impregnation method，ethanol reflux method，ultrasonic extraction method and microwave extraction method.However，there is few research on purification method of flavonoids.The ultraviolet spectrophotometry，high performance liquid chromatography（HPLC）and capillary electrophoresis were used to characterize the flavonoids.Among them，the ultraviolet spectrophotometry was the most common method.In this paper，the flavonoids extraction and determination method were interviewed，which could provide reference for the research，development and application of flavonoids in flos lonicerae in the future.

flos lonicerae；flavonoids；extraction；determination

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.17.043

2015-03-30

河南科技大學(xué)青年科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2015QN050）

李杰（1982—），男（漢），助理實(shí)驗(yàn)師，碩士，研究方向：天然藥物活性成分的提取和檢測(cè)。