CXCL12-CXCR4生物軸與卵巢癌關(guān)系的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究

郭清　吳小華　鐔麗霞　楊波　呂英璞　徐峰　張少靜

作者單位: 050011河北省石家莊市第一醫(yī)院婦產(chǎn)科(郭清、鐔麗霞、呂英璞、徐峰、張少靜);中國人民解放軍白求恩國際和平醫(yī)院婦產(chǎn)科(吳小華、楊波)

CXCL12-CXCR4生物軸與卵巢癌關(guān)系的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究

郭清吳小華鐔麗霞楊波呂英璞徐峰張少靜

作者單位: 050011河北省石家莊市第一醫(yī)院婦產(chǎn)科(郭清、鐔麗霞、呂英璞、徐峰、張少靜);中國人民解放軍白求恩國際和平醫(yī)院婦產(chǎn)科(吳小華、楊波)

【摘要】目的探討CXCL12-CXCR4趨化因子軸與卵巢癌發(fā)病的關(guān)系。方法將36只裸鼠按照體重大小編號(hào)，隨機(jī)分為3組，將轉(zhuǎn)染質(zhì)粒SKOV3/CXCR4、轉(zhuǎn)染載體SKOV3/neg及未轉(zhuǎn)染的SKOV3三種卵巢癌細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，取三種細(xì)胞懸液4×106個(gè)(200 μl)于裸鼠左下腹注入腹腔，建立荷人卵巢癌細(xì)胞裸鼠腹腔移植瘤模型。自注入腫瘤細(xì)胞后第2天起，將每組裸鼠又隨機(jī)分為對(duì)照組和處理組，對(duì)照組腹腔內(nèi)注射0.9%氯化鈉溶液0.2 ml，處理組腹腔內(nèi)注射CXCL12-CXCR4拮抗劑AMD3100，觀察各組裸鼠自然死亡后腹腔成瘤數(shù)、體積、腹水量和存活期的變化。結(jié)果SKOV3/CXCR4、SKOV3/neg及SKOV3三種卵巢癌細(xì)胞接種于裸鼠腹腔后1周左右荷瘤裸鼠在對(duì)照組和處理組體重差比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。接種SKOV3/CXCR4細(xì)胞的裸鼠對(duì)照組的平均生存期與CXCR4拮抗劑AMD3100處理組裸鼠比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z =－2.29，P＜0.05);而接種SKOV3/neg細(xì)胞的裸鼠對(duì)照組的平均生存期與CXCR4拮抗劑AMD3100處理組裸鼠比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);接種SKOV3細(xì)胞的裸鼠平均生存期與CXCR4拮抗劑AMD3100處理的裸鼠比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。接種SKOV3/CXCR4細(xì)胞裸鼠的對(duì)照組腹腔移植瘤的平均個(gè)數(shù)和平均重量與CXCR4拮抗劑AMD3100處理組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論CXCL12-CXCR4趨化因子軸與卵巢癌的發(fā)生有一定的相關(guān)性，可能是其發(fā)病的一個(gè)重要原因，在一定程度上也反映了病情的輕重。

【關(guān)鍵詞】CXCL12; CXCR4;卵巢腫瘤

E-mail: xiaohuawu64@ yahoo.com

趨化因子CXCL12與其特異性受體CXCR4構(gòu)成的CXCL12-CXCR4生物軸在多種腫瘤的播散和器官特異性轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用。Kijima等［1］研究證實(shí)，CXCL12-CXCR4生物軸與卵巢表面上皮的惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)，約80%的卵巢癌組織中有CXCL12的受體CXCR4的表達(dá)，在95%的卵巢癌腹水中發(fā)現(xiàn)CXCL12，而正常的卵巢上皮中卻沒有表達(dá)。本研究以裸鼠為研究對(duì)象進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)，來更好地說明兩者之間的相關(guān)性，為卵巢腫瘤的發(fā)病機(jī)制提供新的依據(jù)，為其治療提供新的靶點(diǎn)。

1　材料與方法

1.1材料來源

1.1.1腫瘤細(xì)胞:卵巢漿液性囊腺癌細(xì)胞SKOV3由河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院科研中心提供; SKOV3/CXCR4細(xì)胞、SKOV3/neg細(xì)胞由本課題組前期制備［2］。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證編號(hào): SCXK(京)2005-0013。

1.2方法

1.2.1穩(wěn)定表達(dá)趨化因子受體CXCR4卵巢癌細(xì)胞株的建立與鑒定:具體構(gòu)建與鑒定方法參考文獻(xiàn)［3］。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng): SKOV3/CXCR4、SKOV3/neg、SKOV3三種細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)在含10%胎牛血清、青霉素100 U/ml和鏈霉素100 g/ml的RPMI-1640培養(yǎng)液中; 在37℃、5%CO2條件下孵育;以0.25% (w/v)的胰蛋白酶消化傳代。

1.2.3SKOV3/CXCR4、SKOV3/neg、SKOV3三種細(xì)胞裸鼠腹腔移植瘤模型的建立和治療: 4～6周齡，體重16～18 g，將36只裸鼠按照體重大小編號(hào)，隨機(jī)分為三組，取三種細(xì)胞懸液4×106個(gè)(200 μl)于裸鼠左下腹注入腹腔。自注入腫瘤細(xì)胞后第2天起［4，5］，將每組裸鼠又隨機(jī)分為對(duì)照組和處理組，對(duì)照組腹腔內(nèi)0.9%氯化鈉溶液0.2 ml，處理組腹腔內(nèi)注射CXCR4拮抗劑AMD3100，用量0.01 mg/g，每只裸鼠每次注射0.2 ml;同時(shí)每組均腹腔內(nèi)注射CXCL12 0.2 ml，濃度為100 ng/ml，每2天注射1次，連用2周共7次。

1.2.4荷瘤裸鼠生長(zhǎng)狀態(tài)的觀察:荷瘤裸鼠接種細(xì)胞后，每日觀察裸鼠的精神狀況、皮膚、飲食、活動(dòng)能力等，于移植腫瘤后第7天起隔日測(cè)量裸鼠的腹圍、體重，觀察腹腔移植瘤生長(zhǎng)情況，計(jì)算2組小鼠的生存天數(shù)。

1.2.5荷瘤裸鼠然死亡后的解剖情況:對(duì)自然死亡裸鼠進(jìn)行解剖，檢查腹水、心、肝、脾、肺、腎、腦、子宮卵巢、腹膜、橫隔、網(wǎng)膜、腸系膜等臟器腫瘤轉(zhuǎn)移情況，同時(shí)觀察腹腔成瘤數(shù)、重量情況。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，采用t檢驗(yàn)，兩兩比較應(yīng)用SNK-q檢驗(yàn)，裸鼠平均存活天數(shù)的比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)多個(gè)樣本比較的Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)，對(duì)各組數(shù)據(jù)組間行配對(duì)t檢驗(yàn)，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1荷瘤裸鼠的體重對(duì)比SKOV3/CXCR4、SKOV3/neg及SKOV3三種卵巢癌細(xì)胞接種于裸鼠腹腔后1周左右荷瘤裸鼠的腹圍相無明顯的差異，3組裸鼠的對(duì)照組和處理組體重差比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

表1　3種裸鼠的對(duì)照組和處理組體重差比較n =6，g±s

表1　3種裸鼠的對(duì)照組和處理組體重差比較n =6，g±s

類別　對(duì)照組　處理組　t值　P值SKOV3/CXCR4　2.05±0.16　1.94±0.10?。?.22　0.03 SKOV3/neg　2.89.±0.19　2.89±0.23　－0.22　0.83 SKOV3　2.88±0.82　2.92±0.12　2.90　0.28 F值60.84 P值?。?.05

2.2荷瘤裸鼠的生存及死亡情況接種SKOV3/CXCR4細(xì)胞的裸鼠對(duì)照組的平均生存期為(15.0± 0.9)d，CXCR4拮抗劑AMD3100處理組裸鼠平均生存期為(17.50±1.64)d，兩者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z =－2.29，P＜0.05);接種SKOV3/neg細(xì)胞的裸鼠對(duì)照組的平均生存期為(16.83±1.33)d，CXCR4拮抗劑AMD3100處理組裸鼠平均生存期為(17.00± 0.89)d，兩者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z =－0.52，P ＞0.05);接種SKOV3細(xì)胞的裸鼠平均生存期為(17.20±1.90)d，CXCR4拮抗劑AMD3100處理的裸鼠平均生存期為(17.17±1.94)d，兩者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z =－0.25，P＞0.05); 3種裸鼠對(duì)照組的平均生存期比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表2。

表2　2組生存時(shí)間比較　n =6，d±s

表2　2組生存時(shí)間比較　n =6，d±s

類別　對(duì)照組　處理組　Z值P值SKOV3/CXCR4　15.00±0.90　17.50±1.64?。?.29　0.02 SKOV3/neg　16.83±1.33　17.00±0.89?。?.52　0.60 SKOV3　17.20±1.90　17.17±1.94?。?.25　0.81 χ2值48.56 P值?。?.05

2.3荷瘤裸鼠的腹腔移植瘤情況的對(duì)比接種SKOV3/CXCR4細(xì)胞裸鼠的對(duì)照組腹腔移植瘤的平均個(gè)數(shù)(87.67±1.86)個(gè)，平均重量(3.74±0.11)g，CXCR4拮抗劑AMD3100處理組腹腔移植瘤的個(gè)數(shù)(80.17±4.58)個(gè)，平均重量(2.83±0.10)g，兩者相比具有顯著性差異(P＜0.05);接種SKOV3/neg細(xì)胞的裸鼠對(duì)照組腹腔內(nèi)移植瘤的平均個(gè)數(shù)為個(gè)數(shù)(79.17±2.32)個(gè)，平均重量(2.82±0.13)g，CXCR4拮抗劑AMD3100處理組腹腔移植瘤的平均個(gè)數(shù)(79.83±3.25)個(gè)，平均重量(2.76±0.11)g，兩者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);接種SKOV3/neg細(xì)胞的裸鼠對(duì)照組腹腔內(nèi)移植瘤的平均個(gè)數(shù)(78.16±1.17)個(gè)，平均重量(2.82±0.12)g，CXCR4拮抗劑AMD3100處理組腹腔移植瘤的個(gè)數(shù)(77.67±3.33)個(gè)，平均重量(2.84±0.11)g，兩者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05); 3組裸鼠對(duì)照組腹腔移植瘤的個(gè)數(shù)和重量相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05); 3組小鼠腹水量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表3～5。

表3　對(duì)照組和處理組腹腔移植瘤的個(gè)數(shù)比較n =6，個(gè)，±s

表3　對(duì)照組和處理組腹腔移植瘤的個(gè)數(shù)比較n =6，個(gè)，±s

組別　對(duì)照組　處理組　t值　P值SKOV3/CXCR4　87.7±1.9　80.2±4.6　4.04　0.01 SKOV3/neg　79.2±2.3　79.8±3.2　－1.20　0.29 SKOV3　78.2±1.2　77.7±3.3　0.47　0.66 F值48.09 P值?。?.05

表4　2組腹腔移植瘤的重量比較　n =6，g±s

表4　2組腹腔移植瘤的重量比較　n =6，g±s

組別　對(duì)照組　處理組　t值　P值SKOV3/CXCR4　3.74±0.11　2.83±0.10　13.44　0.00 SKOV3/neg　2.82±0.13　2.76±0.11　2.53　0.06 SKOV3　2.82±0.12　2.84±0.11　－0.89　0.42 F值89.03 P值?。?.05

表5　2組腹水量比較　n =6，ml，±s

組別　對(duì)照組　處理組　t值　P值SKOV3/CXCR4　1.20±0.42　1.21±0.40　－0.50　0.64 SKOV3/neg　1.13±0.30　1.15±0.29?。?.08　0.09 SKOV3　1.27±0.38　1.32±0.36?。?.22　0.08 F值0.22 P值　＞0.01

3討論

卵巢癌是女性常見的惡性腫瘤之一，病死率居女性生殖道惡性腫瘤之首。與其他多種類型的癌不同，卵巢癌的主要轉(zhuǎn)移途徑不是通過血管，而是腹腔轉(zhuǎn)移，由于在腹腔的廣泛種植和轉(zhuǎn)移常常引起嚴(yán)重腹水和腸梗阻，所以卵巢癌的腹腔轉(zhuǎn)移是直接引起患者死亡的主要原因。因此深入了解卵巢癌腹腔轉(zhuǎn)移的機(jī)制十分重要。

腹腔微環(huán)境是影響卵巢癌轉(zhuǎn)移方式的重要因素，腹腔微環(huán)境中含有許多細(xì)胞因子，包括CXCL12及其受體CXCR4、溶血磷脂酸(lysophosphatidic，LPA)及其受體及腹膜間皮細(xì)胞等，其中趨化因子CXCL12即基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1(strmal cell derived factor-1，SDF-1)，與其趨化因子受體CXCR4在介導(dǎo)惡性腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。Jiang等［2］首次采用免疫組化的方法分析CXCR4蛋白在正常卵巢表面上皮和卵巢上皮性癌組織的定位表達(dá)，發(fā)現(xiàn)CXCL12和CXCR4蛋白在卵巢上皮性癌起源的正常卵巢表面上皮無表達(dá)，而共表達(dá)在卵巢皮質(zhì)的卵泡細(xì)胞。在良性和交界性上皮性卵巢腫瘤中CXCR4蛋白陽性表達(dá)率為88%和90%，均為細(xì)胞核著色; CXCL12蛋白陽性表達(dá)率100%和88%，均為細(xì)胞質(zhì)著色。在卵巢惡性上皮性癌原發(fā)灶中癌細(xì)胞的CXCR4的陽性率為59%，大多數(shù)為細(xì)胞質(zhì)著色; CXCL12蛋白陽性率則為91%。我們前期的體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CXCL12單獨(dú)作用可促進(jìn)SKOV3/CXCR4細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲，這與Scotton等［6，7］報(bào)道相一致。

本研究結(jié)果顯示3組裸鼠生存時(shí)間、腹腔移植瘤的個(gè)數(shù)和重量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，CXCL12濃度越高，受試裸鼠腹腔移植瘤個(gè)數(shù)越多，重量越大，生存時(shí)間越短，而且CXCL12的作用依賴于CXCR4的存在，CXCR4拮抗劑可以控制腫瘤生長(zhǎng)，這從體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)水平進(jìn)一步說明CXCL12-CXCR4生物軸與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。近期，有研究表明高CXCL12的表達(dá)的卵巢癌患者較地表達(dá)的卵巢癌患者有很低的生存，所以建議高表達(dá)的卵巢癌患者應(yīng)該使用抗CXCL12-CXCR4治療［8］。這與我們的研究一致。同時(shí)也有越來越多的關(guān)于卵巢上皮癌與CXCL12-CXCR4生物軸關(guān)系的實(shí)驗(yàn)在報(bào)道［9］，希望CXCL12-CXCR4生物軸對(duì)卵巢癌的臨床治療有更多的指導(dǎo)意義。

總之，CXCL12-CXCR4生物軸在實(shí)驗(yàn)水平與卵巢癌的發(fā)生、增殖、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，它不僅可作為腫瘤轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)指標(biāo)及預(yù)后因素，而且已成為腫瘤治療的新方向，干擾CXCL12-CXCR4生物軸有可能成為治療卵巢癌的一個(gè)有意義的分子靶點(diǎn)。

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Experimental study on the correlation between chemokine-CXCL12-CXCR4 and ovarian cancer in nude mice

GUOQing，WU Xiaohua，TAN Lixia，et al.
Department of Obstetrics and Gynecology，The First Hospital of Shijiazhuang City，Shijiazhuang 05001，China

【Abstract】Objective To investigate the correlation between chemokine－CXCL12-CXCR4 and the pathogenesis of ovarian cancer.MethodsThe three kinds of ovarian cancer cells including SKOV3/CXCR4 transfected with plasmid，SKOV3/neg transfected with vector and SKOV3 which was not transfected were cultured in vitro.The 36 nude mice were randomly divided into three groups (12 mice in each group)，and the peritoneal cavity transplanted tumor models in nude mice were established by intraperitoneal injection with the three kinds of ovarian cancer cells.Then the model mice in each group were subdivided into two groups on the second day after ovarian cancer cell inoculation: treatment group (n =6)，control group (n =6).The mice in control group were intraperitoneally injected with 0.9% sodium chloride solution，however，the mice in treatment group were intraperitoneally injected with CXCL12-CXCR4 antagonist－AMD3100.The transplanted tumor number and size in peritoneal cavity，ascites volume and mean survival time were observed after these mice died naturally.Results There were significant differences in body weight differences about 1 week after ovarian cancer cell inoculation between control groups and treatment groups (P＜0.05).There was a significant difference in mean survival time between SKOV3/CXCR4 control group and treatment group (CXCR4 antagonist－AMD3100)(Z =－2.29，P＜0.05)，however，there was no significant difference in mean survival time between SKOV3/neg control group and treatment group (P＞0.05)，nor was between SKOV3 control group and treatment group (P＞0.05).There were significant differences in transplanted tumor mean number and weight in peritoneal cavity between SKOV3/CXCR4 control group and treatment group (P＜0.05).Conclusion There is a correlation between chemokine-CXCL12-CXCR4 and pathogenesis of ovarian cancer，which may be one of main reasons in the pathogenesis of ovarian cancer，and may also reflect the degree of pathogenetic condition to some extent.

【Key words】CXCL12; CXCR4; ovarian tumor

(收稿日期:2013－07－18)

通訊作者:吳小華，050082中國人民解放軍白求恩國際和平醫(yī)院婦產(chǎn)科;

doi:10.3969/j.issn.1002－7386.2015.06.001

【文章編號(hào)】1002－7386(2015)06－0805－03

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【中圖分類號(hào)】R 737.31