RP-HPLC測定六味五靈片中齊墩果酸和連翹苷的含量*

黃志恒

(河南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院藥劑科，河南 鄭州 450004)

·藥學(xué)研究·

RP-HPLC測定六味五靈片中齊墩果酸和連翹苷的含量*

黃志恒

(河南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院藥劑科，河南 鄭州 450004)

目的：建立六味五靈片中齊墩果酸和連翹苷的含量測定方法。方法： 采用HPLC法，DiamonsilC18柱(250mm×4.6mm，5μm)色譜柱，測定齊墩果酸的流動相為甲醇-2g/L磷酸水溶液(80∶20)，流速1.0mL/min，檢測波長205nm，柱溫25 ℃；測定連翹苷的流動相為乙腈-水(25∶75)，流速1.0mL/min，檢測波長277nm，柱溫25 ℃。結(jié)果：齊墩果酸和連翹苷的線性范圍分別為0.6～1.2μg和0.143 7～2.874 0μg，平均回收率分別為99.34%(RSD=1.53%)和100.16%(RSD=0.68%)。結(jié)論：建立的含量測定方法重復(fù)性好、簡單易行，適用于六味五靈片的質(zhì)量控制。

六味五靈片；齊墩果酸；連翹苷/含量測定；高效液相色譜法

六味五靈片由五味子、連翹、女貞子、莪術(shù)、苣荬菜和靈芝孢子粉6味中藥構(gòu)成，具有活血解毒、滋腎養(yǎng)肝等功效[1-3]，臨床上多用于治療慢性乙型肝炎和肝硬化等癥[4-5]。現(xiàn)以方中女貞子的有效成分齊墩果酸和連翹有效成分連翹苷為指標(biāo)，進(jìn)行高效液相色譜法含量測定，為該復(fù)方的質(zhì)量評價提供參考。

1 藥品、試劑與儀器

六味五靈片(批號 080705，081105，090702)，山東世博金都藥業(yè)有限公司產(chǎn)品。連翹苷對照品(批號110821-201112)、齊墩果酸對照品(批號110709-200304)，均由中國藥品生物制品檢定所提供，五氧化二磷減壓干燥12h以上；甲醇為分析純，天津四友精細(xì)化學(xué)品有限公司產(chǎn)品；乙腈為色譜純，F(xiàn)isherScientific公司產(chǎn)品；其他試劑均為分析純；水為超純水。日本島津高效液相色譜儀(LC-20ATVP泵，SPD-20AVP紫外檢測器，CTO-20A柱溫箱，SIL-20A自動進(jìn)樣器)，日本島津公司產(chǎn)品；DT-100 電子分析天平，北京光學(xué)儀器廠產(chǎn)品；SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水式真空泵，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司產(chǎn)品；MIL-LI-QB純凈水發(fā)生器，美國MILLIPORE公司產(chǎn)品；DL-360A超聲清洗機(jī)，上海之信儀器有限公司產(chǎn)品。

2 方法與結(jié)果

2.1 齊墩果酸的含量測定

2.1.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性實驗

DiamonsilC18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)，流動相為甲醇-2g/L磷酸水(80∶20)，流速1.0mL/min，檢測波長205nm，柱溫25 ℃。在該色譜條件下，理論板數(shù)按齊墩果酸峰計算，應(yīng)不低于2 000。

2.1.2 對照品溶液的制備

取齊墩果酸對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.64g/L的溶液，即得。

2.1.3 供試品溶液的制備

取六味五靈片10片，刮去糖衣，研細(xì)；取約1g，精密稱定，置50mL具塞三角瓶中；精密加入25mL乙醇，稱定質(zhì)量；超聲處理60min，放冷；再稱定質(zhì)量，加乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量；搖勻；用0.22μm濾膜濾過，即得。

2.1.4 陰性對照溶液的制備

按處方量制備不含女貞子的陰性對照藥，按2.1.3方法進(jìn)行處理，得到缺女貞子陰性對照溶液。

2.1.5 專屬性試驗

精密吸取供試品溶液、對照品溶液及缺女貞子陰性對照溶液各20μL，注入高效液相色譜儀。結(jié)果：在缺女貞子陰性對照品色譜圖中，在與對照品和供試品保留時間處沒有相應(yīng)的色譜峰檢出。表明：其他組分對齊墩果酸無干擾。見圖1。

A.對照品；B.供試品；C.缺女貞子陰性對照品；1.齊墩果酸圖1 齊墩果酸HPLC色譜圖

2.1.6 線性關(guān)系考察

按2.1.1的色譜條件，分別精密注入1，2，4，8，10，20μL對照品溶液進(jìn)行測定，以進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)行線性回歸計算，得回歸方程為Y=2.1×104X+4.1×103，r=0.999 1。結(jié)果表明:在0.64～12.8μg范圍內(nèi)齊墩果酸質(zhì)量濃度—峰面積的線性關(guān)系良好。

2.1.7 精密度試驗

取齊墩果酸對照品溶液連續(xù)進(jìn)5次，每次20μL，測定峰面積。結(jié)果：峰面積的RSD值為1.35%。結(jié)果表明：精密度良好。

2.1.8 重復(fù)性試驗

取六味五靈片樣品5份，按2.1.3方法制備成供試品溶液，按2.1.1色譜條件測定，計算出齊墩果酸的平均含量為1.37mg/g，RSD值為1.62%。結(jié)果表明：該法重復(fù)性良好。

2.1.9 加樣回收率試驗

取已知齊墩果酸含量為含1.37mg/g的六味五靈片約0.5g，共9份，分為3組并精密稱定質(zhì)量，分別加入0.64g/L的齊墩果酸對照品0.8，1.0，1.2mL，按照2.1.3方法制備加樣供試品溶液，按2.1.1色譜條件進(jìn)行測定。結(jié)果：齊墩果酸的平均加樣回收率為99.34%，RSD為1.53%。見表1。

表1 齊墩果酸加樣回收率試驗結(jié)果 n=9

2.2 連翹苷的含量測定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性實驗

DiamonsilC18色譜柱(250mm× 4.6mm，5μm)，流動相為乙腈-水(25∶75)，檢測波長為277nm，柱溫25 ℃，流速1.0mL/min。在該色譜條件下，理論塔板數(shù)按連翹苷峰計算應(yīng)不低于2 000。

2.2.2 對照品溶液的制備

精密稱定連翹苷對照品，加甲醇制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為14.37mg/L的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備

取六味五靈片10片，刮去糖衣，研細(xì)，取約1g，精密稱定，置50mL具塞錐形瓶中，加入25mL甲醇，精密稱量質(zhì)量，超聲處理60min，放冷，再稱定質(zhì)量，加甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，用0.22μm濾膜濾過，即得。

2.2.4 陰性對照溶液的制備

按處方量制備不含連翹的陰性對照藥，按2.2.3方法進(jìn)行處理，得缺連翹陰性對照溶液。

2.2.5 專屬性試驗

精密吸取供試品、連翹苷對照品及缺連翹陰性對照溶液各10μL，進(jìn)樣測定。結(jié)果：在缺連翹陰性對照溶液色譜圖中，在與對照品和供試品保留時間處沒有相應(yīng)的色譜峰出現(xiàn)。由此表明：其他組分對連翹苷測定時無干擾。見圖2。

A.對照品；B.供試品；C.缺連翹陰性供試品；1.連翹苷圖2 連翹苷HPLC色譜圖

2.2.6 線性關(guān)系考察

按2.2.1色譜條件，分別以1，2，4，8，10，20μL自動進(jìn)樣，以進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)行線性回歸計算，得回歸方程為Y=6.413 26×105X+2.801 5×104，r=0.999 3。結(jié)果表明：在0.014 37～0.287 40μg范圍內(nèi)連翹苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)—峰面積的線性關(guān)系良好。

2.2.7 精密度試驗

取連翹苷對照品溶液進(jìn)樣5次，每次10μL，測定峰面積。結(jié)果：峰面積的RSD值為1.06%。結(jié)果表明：精密度良好。

2.2.8 重復(fù)性試驗

取六味五靈片樣品5份，按2.2.3項方法制備成供試品，按2.2.1色譜條件測定，計算出連翹苷的平均含量為48.3μg/g，RSD值為1.76%。結(jié)果表明：該法重復(fù)性良好。

2.2.9 加樣回收率試驗

取已知連翹苷含量為48.3μg/g的六味五靈片約0.5g，共9份，精密稱量其質(zhì)量，分別加入14.37mg/L的連翹苷對照品1.4，1.7，2mL，按照2.2.3方法制備加樣供試品溶液，按2.2.1色譜條件進(jìn)行測定。結(jié)果：連翹苷的平均加樣回收率為100.16%，RSD為0.68%。見表2。

表2 連翹苷加樣回收率試驗結(jié)果 n=9

2.3 樣品的測定

取3批六味五靈片(批號080705，081105，090702)，每批取6份，按照以上制備方法及色譜條件測定，記錄色譜峰面積并計算，測定結(jié)果見表3。

表3 六味五靈片樣品含量測定結(jié)果

3 討 論

3.1 流動相的考察

齊墩果酸及連翹苷均考察了乙腈-水溶液、乙腈-2g/L磷酸水溶液、甲醇-水溶液，甲醇-2g/L磷酸水溶液等不同流動相條件，結(jié)果顯示齊墩果酸用乙腈-2mL/L磷酸水溶液(80∶20)、連翹苷用甲醇-水(25∶75)做為流動相時效果最佳，色譜峰峰型及分離度均良好，且保留時間適宜，故選擇上述溶液比例作為流動相。

3.2 提取方法的考察

六味五靈片的常用提取方法是回流提取和超聲提取[6]。本文分別對超聲提取和回流提取進(jìn)行了操作比較，結(jié)果顯示：超聲提取和回流提取的效果差別不大，但因為超聲提取方便快捷，所以選擇超聲提取工藝。

六味五靈片因其良好的療效被廣泛應(yīng)用于臨床[7]。本文采用HPLC法對六味五靈片中的連翹苷和齊墩果酸進(jìn)行含量測定，可更準(zhǔn)確地對藥物中的連翹和女貞子提取物進(jìn)行質(zhì)量評價和控制，有利于生產(chǎn)管理及產(chǎn)品質(zhì)量保證。所建立的六味五靈片中連翹苷和齊墩果酸的含量測定方法專屬性、靈敏度及重現(xiàn)性均良好，可作為六味五靈片中齊墩果酸和連翹苷的含量測定方法。

[1]李廣明,周鳳蕊,劉俊華,等.六味五靈片治療乙型肝炎肝纖維化42例[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2013,19(21):276-279.

[2]陳正國.六味五靈片聯(lián)合阿德福韋酯治療慢性乙型肝炎臨床療效觀察[J].中國肝臟病雜志：電子版,2011, 3(1):12-14.

[3]高愛華,王新麗,姜清河,等.六味五靈片聯(lián)合恩替卡韋治療HBeAg陽性慢性乙型肝炎患者的療效觀察[J].中國肝臟病雜志：電子版,2011,3(1):35-37.

[4]劉方軍.六味五靈片聯(lián)合替比夫定治療HBeAg陽性慢性乙型肝炎療效觀察[J].實用肝臟病雜志,2014,17(3):305-306.

[5]申春明,張寶莉,李艷.六味五靈片聯(lián)合恩替卡韋治療乙型肝炎肝硬化的臨床觀察[J].中國醫(yī)學(xué)工程,2014,22(5):60.

[6]劉宏明,徐楠楠,聶磊.指紋圖譜分析結(jié)合多指標(biāo)成分定量用于六味五靈片的質(zhì)量評價[J].中國中藥雜志,2014,39(10):1816-1821.

[7]韓軍,蘇淑慧,王春平,等.六味五靈片治療慢性肝損傷的臨床研究[J].中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志,2007,17(5):266-267.

(編輯 陶 珠)

1001-6910(2015)02-0070-03

R

B

10.3969/j.issn.1001-6910.2015.02.32

河南省教育廳自然科學(xué)研究計劃項目(2009A360013)

2014-09-22；

2014-11-24