滋腎補骨法對左氧氟沙星致幼鼠軟骨厚度損傷的修復(fù)作用*

潘海邦，吳國泰，王 波，張志明

(1.甘肅中醫(yī)學(xué)院, 甘肅 蘭州 73000 ; 2.甘肅中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院, 甘肅 蘭州 73000)

·實驗研究·

滋腎補骨法對左氧氟沙星致幼鼠軟骨厚度損傷的修復(fù)作用*

潘海邦1，吳國泰1，王 波1，張志明2

(1.甘肅中醫(yī)學(xué)院, 甘肅 蘭州 73000 ; 2.甘肅中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院, 甘肅 蘭州 73000)

目的：探討中醫(yī)滋腎補骨理論對喹諾酮類藥物所致幼年機體軟骨損傷的保護作用。方法：將健康幼齡(4周齡)wistar大鼠72只隨機分為正常對照組、模型對照組、懷牛膝組、山茱萸組、蛇床子組、懷牛膝+山茱萸、懷牛膝+蛇床子組、山茱萸+蛇床子組、懷牛膝+山茱萸+蛇床子組9組。建立左氧氟沙星誘導(dǎo)幼齡大鼠軟骨損傷模型，采用具有補腎功效的中藥牛膝、山茱萸和蛇床子,按L8(27)正交設(shè)計灌胃給藥，14d后取膝關(guān)節(jié)軟骨病理切片并測量軟骨厚度。結(jié)果：正常對照組軟骨厚度(190.13±12.43)μm，模型對照組(124.50±12.01)μm，中藥治療組軟骨厚度 (156.50～180.00)±(10.89～15.09)μm，各中藥治療組軟骨厚度變薄程度明顯輕于模型對照組，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。光鏡下，各中藥及配伍組軟骨厚度亦處于正常對照組與模型對照組之間。結(jié)論：滋腎補骨法對喹諾酮類藥物所致幼年機體軟骨損傷具有保護作用。

滋腎補骨法；左氧氟沙星；軟骨厚度/保護作用；動物模型；大鼠

喹諾酮類藥物療效確切，交叉耐藥性相對較低，過敏反應(yīng)少見，加之價格低廉，是臨床常用藥物，但其對幼齡機體軟骨有損傷作用，從而導(dǎo)致該類藥物在妊娠期、哺乳期女性及兒童中應(yīng)用受到限制。中醫(yī)常用補腎法治療各類關(guān)節(jié)軟骨疾病，并取得了好的成效[1-6]，檢索常用藥物有淫羊藿、山茱萸、蛇床子、懷牛膝、補骨脂等，但應(yīng)用中藥防治喹諾酮類藥物所致軟骨損傷的相關(guān)研究甚少。本研究通過正交設(shè)計探討了補腎中藥懷牛膝、山茱萸和蛇床子對左氧氟沙星所致幼齡大鼠軟骨損傷模型膝關(guān)節(jié)厚度的影響。

1 材料與方法

1.1 正交設(shè)計

本實驗設(shè)3個單藥因素及其配伍，每個因素設(shè)置2個水平，按照L8(27)正交試驗表設(shè)計實驗組別。

表1 因素及水平表

1.2 動 物

SPF級健康幼齡(4周齡)Wistar大鼠72只，雌雄各半，體質(zhì)量(50.00±8.02)g，由甘肅中醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，實驗動物質(zhì)量合格證號：0001115。自由進食、飲水。

1.3 藥品、試劑與儀器

懷牛膝、山茱萸、蛇床子中藥材，均購自甘肅中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中藥房，經(jīng)甘肅中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院楊錫倉主任中藥師鑒定。三者按成人18g/d劑量給藥，等效劑量換算。劑量為1.5g/kg，容積為10μL/g，18g/60kg×10(倍)=3g；3g/10mL=150g/500mL。第1煎：將150g藥材加900mL蒸餾水，煎40min，取濾液。第2煎：藥渣加450mL蒸餾水，煎30min，取濾液。合并兩煎濾液，濃縮成500mL，按10μL/g體質(zhì)量灌胃。鹽酸左氧氟沙星氯化鈉注射液，地奧集團成都藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品，批號F13051905-2。Olympus生物光學(xué)顯微鏡，產(chǎn)地日本；H.H.S21-4型電熱恒溫水浴箱， 上海醫(yī)療器械五廠產(chǎn)品；AO-82型轉(zhuǎn)輪切片機、AO-940型自動磨刀機，產(chǎn)地美國；800型離心沉淀器，上海手術(shù)器械十廠產(chǎn)品；101型電熱恒溫干燥箱，北京科偉永鑫實驗儀器設(shè)備廠產(chǎn)品；MiE圖像系統(tǒng)，山東易創(chuàng)電子有限公司產(chǎn)品；VORTEX-5型渦旋器，購自汕頭市澄海區(qū)立豐檢測儀器店；H1650-W型高速離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司產(chǎn)品。

1.4 動物分組、模型的建立與給藥

將72只大鼠隨機分成9組，每組8只，分別為：正常對照組、模型對照組、懷牛膝組、山茱萸組、蛇床子組、懷牛膝+山茱萸組、懷牛膝+蛇床子組、山茱萸+蛇床子組、懷牛膝+山茱萸+蛇床子組。造模方法參照文獻[7-8]方法：除正常對照組外，其余各組大鼠均腹腔注射鹽酸左氧氟沙星注射液40μg/g，正常對照組腹腔注射等容量的9g/L的生理鹽水，1d1次，連續(xù)21d，觀察并記錄大鼠的活動量、皮毛色澤、飲食和排便等一般情況，每周稱量體質(zhì)量1次。第8天開始，除模型對照組、正常對照組外，其余各組大鼠灌胃中藥，1d1次，連續(xù)14d。中藥懷牛膝、山茱萸、蛇床子按成人18g/d劑量給藥，等效劑量換算，劑量1.5g/kg，按10μL/g體質(zhì)量灌胃。正常對照組和模型對照組不給中藥。

1.5 檢測指標(biāo)

1.5.1 標(biāo)本采集

末次灌完中藥4h后，取血并脫頸椎處死大鼠，迅速剪開膝關(guān)節(jié)處的皮膚及肌肉，暴露并剪下膝關(guān)節(jié)，左側(cè)膝關(guān)節(jié)置40g/L甲醛溶液中固定；48h后以蒸餾水清洗，再以質(zhì)量分?jǐn)?shù)50g/L硝酸溶液脫鈣10d；將標(biāo)本以石蠟包埋，用轉(zhuǎn)輪切片機垂直于關(guān)節(jié)軟骨面將組織切片，切片厚度為8μm，然后行HE常規(guī)染色。

1.5.2 膝關(guān)節(jié)軟骨厚度

使用帶刻度Olympus顯微鏡進行手工測量，每組隨機取3張HE染色切片(切片從脛骨外側(cè)髁切取，垂直于軟骨方向)，每張切片從最厚到最薄平均取6個不同的厚度進行測量，測量從軟骨表面到鈣化層的厚度，結(jié)果用微米(μm)表示。由兩位中級以上職稱評分者分別對切片進行盲評，取平均值。

HE染色完畢，以中性樹膠封片，以生物光學(xué)顯微鏡在4倍、40倍下觀察膝關(guān)節(jié)軟骨病理改變，并測量厚度。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨厚度對比

見表2。

表2 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨厚度對比

注：蛇床子組、懷牛膝+山茱萸組各有1只動物不明原因死亡。

2.2 膝關(guān)節(jié)軟骨厚度正交試驗

見表3。

表3 L8(27)正交試驗表

分析：A1=124.5+160.25+123.88+181=589.63A2=180+156.75+176.13+156.5=669.38A2>A1，提示A有效。B1=124.5+160.25+180+156.75=621.5B2=123.88+181+176.13+156.5=637.51B2>B1，提示B有效。C1=124.5+123.88+180+176.13=604.51C2=160.25+181+156.75+156.5=654.5C2>C1，提示C有效。

由表4可見：A因素和C因素都有統(tǒng)計意義，B因素沒有統(tǒng)計意義，A和C的交互有統(tǒng)計學(xué)意義。

分析A和C交互:

A1C1=124.5+123.88=248.38

表4 正交設(shè)計方差分析結(jié)果表

A2C1=180+176.13=356.13

A1C2=160.25+181=341.25

A2C2=156.75+156.5=313.25

可見A2C1最大，說明只用A藥(懷牛膝)時軟骨厚度最大。

2.3 光鏡下膝關(guān)節(jié)軟骨厚度

正常對照組：軟骨層形態(tài)正常，切片染色均勻，組織學(xué)分層清晰，結(jié)構(gòu)正常，厚度較厚(圖1)。模型對照組：軟骨層可見明顯變薄，表面不規(guī)則，可見裂隙、中斷，軟骨細(xì)胞數(shù)量減少、排列紊亂(圖2)。各中藥及配伍組軟骨厚度處于兩者之間(圖3～6)。

圖1 正常對照組(HE，×40) 圖2 模型對照組(HE，×40) 圖3 懷牛膝組(HE，×40)

圖4 山茱萸組(HE，×40) 圖5 懷牛膝+蛇床子組(HE，×40) 圖6 蛇床子組(HE，×40)

3 討 論

喹諾酮類藥物可致幼齡機體關(guān)節(jié)軟骨損傷，引起軟骨病理形態(tài)學(xué)改變?，F(xiàn)2010版《中國藥典》二部明確規(guī)定其為未成年人慎用或禁用藥物。有研究表明：左氧氟沙星可增強兔膝關(guān)節(jié)前交叉韌帶細(xì)胞的凋亡，增加基質(zhì)金屬蛋白酶3(MMP-3)mRNA和活化的caspase-3的表達[9]，對體外培養(yǎng)的兔關(guān)節(jié)半月板細(xì)胞具有毒性作用[10]，可致體外兔關(guān)節(jié)成纖維細(xì)胞及前十字交叉韌帶細(xì)胞明顯減少[11-12]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為：軟骨損傷以腎精虧虛為主，肝血不足為次，治療當(dāng)以補肝腎強筋骨為主，輔以補益氣血?，F(xiàn)代藥理研究表明：補腎是抗衰老的一種重要手段，它可以改善微循環(huán)，防止自由基過量產(chǎn)生，調(diào)節(jié)內(nèi)分泌狀態(tài)，增強免疫功能，保持骨量的穩(wěn)定，抑制因性激素水平下降而導(dǎo)致的骨結(jié)構(gòu)改變，使關(guān)節(jié)軟骨退變和骨端松質(zhì)骨囊腫樣變等表現(xiàn)得到明顯改善和修復(fù)[13-14]。懷牛膝性平，有補肝腎、強筋骨、逐瘀通經(jīng)、引血下行等作用。牛膝的醇提物可以增加骨小梁密度、面積、總體積及密質(zhì)骨面積，減小骨髓腔面積，阻止大鼠骨礦質(zhì)的丟失[15]。牛膝多糖能夠改善周圍軟組織腫脹情況，縮小關(guān)節(jié)面的變化及減輕骨贅情況的發(fā)生，增加膝關(guān)節(jié)屈伸最大角度，改善膝關(guān)節(jié)活動度，從而有利于骨性關(guān)節(jié)炎的修復(fù)[16]。山茱萸具有補益肝腎、澀精固脫的作用。山茱萸水提物能明顯改善SAM-P/6小鼠的骨質(zhì)疏松狀況，顯著增加骨皮質(zhì)厚度，增加SAM-P/6小鼠的抗疲勞能力，提高小鼠骨鈣、骨磷的含量，抑制骨吸收，并能明顯提高骨密度[17]。蛇床子補腎壯陽，蛇床子總香豆素對使用糖皮質(zhì)激素和切除卵巢造成的骨質(zhì)疏松癥模型具有明顯治療作用[18-20]，可通過抑制破骨細(xì)胞的分化和骨吸收功能進而起到對骨的保護作用[18]。

本實驗采用4周齡大鼠腹腔注射左氧氟沙星40μg/g制作模型，用藥后見不同程度軟骨損傷，光鏡下軟骨層可見明顯變薄、軟骨基質(zhì)疏松、組織學(xué)分級Mankin評分增高，出現(xiàn)文獻報道軟骨損傷形態(tài)改變[21-23]。軟骨厚度可作為評價軟骨損傷的一個指標(biāo)[24]。本實驗中模型動物組軟骨厚度較正常對照組明顯變薄，提示左氧氟沙星存在致幼年機體軟骨損傷的毒副作用。予滋腎補骨中藥干預(yù)后，各組軟骨厚度均較模型對照組增厚，除山茱萸組外，差別均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，證明滋腎補骨中藥對左氧氟沙星所致軟骨損害有不同程度的保護作用。懷牛膝和蛇床子單用或配伍修復(fù)作用明顯，進一步正交結(jié)果分析顯示，懷牛膝單用對軟骨厚度修復(fù)作用最佳。本研究所選懷牛膝、山茱萸和蛇床子均有補腎功效，但懷牛膝偏重活血化瘀，山茱萸偏重滋腎陰，蛇床子偏重補腎陽。根據(jù)實驗結(jié)果，懷牛膝與蛇床子對軟骨損傷均有保護作用，而山茱萸無統(tǒng)計學(xué)意義，提示喹諾酮類藥物所致軟骨損傷的病機可能更傾向于陽虛型，故山茱萸滋陰的功效得不到較好地顯現(xiàn)。懷牛膝單用較與其他藥配伍對軟骨厚度修復(fù)作用更好，提示喹諾酮致軟骨損傷的機制可能是藥物作用于純陽之身的幼年機體后使腎氣損傷，致腎陽不足為主要臨床證型，進而氣滯血瘀。另外，喹諾酮所致幼齡大鼠軟骨損害，病程一般較短，常以急性損害為主，急性損傷易致陽氣損傷，而慢性疾病常傷陰氣，此觀點也支持喹諾酮所致軟骨損傷多為腎陽虛為主要證型的推斷。本實驗為臨床干預(yù)治療選方擇藥提供了方向。補腎中藥懷牛膝、蛇床子單用及配合使用對左氧氟沙星所致幼齡大鼠軟骨損傷均有效，兩藥合用效果不及單用，由此推測可能與兩種藥物中所含某些有效成分及藥物間配伍有關(guān)，此需做進一步研究。兩藥均有溫補腎陽作用，但合用效果并未加強，分析也可能為補之太過。臨證時當(dāng)考慮兩者配伍，發(fā)揮溫陽活血功效，但需注意機體主要證候及藥物用量。本實驗中3藥聯(lián)合運用也未明顯增強治療效果，有時效果不及單藥或雙藥聯(lián)合運用，提示：臨床辨證論治重在選藥合理，盲目增加藥物數(shù)量不一定加強治療作用。此外，不同比例也可能產(chǎn)生不同效果?？傊?，滋腎補骨法對喹諾酮藥物所致幼年機體軟骨損傷具有保護意義。

[1]李曉昊,鄧偉民,黃海,等.中醫(yī)藥治療原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的研究進展[J].華南國防醫(yī)學(xué)雜志,2012,6(1):86-88.

[2]戰(zhàn)美玲,楊藝飛,張靜,等.補腎養(yǎng)血湯治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥療效觀察[J].甘肅中醫(yī),2007,20(2):37-38.

[3]張京松,李婉兒.中醫(yī)“補腎法”治療老年骨質(zhì)疏松癥臨床研究[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2014,55(2):85-86.

[4]張國慶.中西醫(yī)結(jié)合治療老年性骨質(zhì)疏松癥的臨床療效觀察[J].中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新,2014,11(4):86-88.

[5]孔西建.吳丹,葉進,等.益腎活血法對原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥患者骨密度、骨代謝及脆性骨折發(fā)生率的影響[J].中醫(yī)雜志,2014,55(5):391-395.

[6]林勇凱,黃宇新,梁桂洪.補腎調(diào)肝方治療高齡骨質(zhì)疏松癥伴抑郁障礙32例療效觀察[J].中醫(yī)雜志，2014，55(2):137-140.

[7]StahlmannR，KuhnerS,ShakibaeiM.Chondrotoxicityofciprofloxacininimmaturebeagledogs:immunohistochemistry,electronmicroscopyanddrugplasmaconcentrations[J].ArchToxicol,2000,73 (10/11):564-572

[8]KatoM,TakadaS,OgawaraS,etal.EffectoflevofloxacinonglycosaminoglycanandDNAsynthesisofculturedrabbitchondrocytesatconcentrationsinducingcartilagelesionsinvivo[J].AntimicrobAgentsChemother,1995,39(9):1979-1983

[9]GotoK,ImaokaM,GotoM，etal.Effectofbody-weightloadingontothearticularcartilageontheoccurrenceofquinolone-inducedchondrotoxicityinjuvenilerats[J].ToxicolLett,2013,216(2/3):124-129.

[10]WangL,WuY,TanY,etal.Cytotoxiceffectsofthequinolonelevofloxacinonrabbitmeniscuscells[J].JApplToxicol，2014,34(8):870-877.

[11]DengY,ChenB,QiY,etal.Theeffectsoflevofloxacinonrabbitanteriorcruciateligamentcellsinvitro[J].ToxicolApplPharmacol,2011,257(1):67-73.

[12]TanY,LuK,DengY,etal.Theeffectsoflevofloxacinonrabbitfibroblast-likesynoviocytesinvitro[J].ToxicolApplPharmacol， 2012,265(2):175-180.

[13]江蓉星,汪亞強,王洪志.骨關(guān)節(jié)炎的中醫(yī)藥治療[J].成都中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2001,24(4):11-13.

[14]高文香,劉元祿.中醫(yī)藥治療骨關(guān)節(jié)炎及其研究進展[J].遼寧中醫(yī)雜志,2001,25(7):335-338.

[15]高曉燕,王大為,李發(fā)美,等.牛膝中牛膝蛻皮甾酮的含量測定及促進骨樣細(xì)胞增殖活性[J].藥學(xué)學(xué)報,2000,35(11):868.

[16]方芳鄒,來勇,湯群珍. 牛膝多糖對兔膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎修復(fù)的影響[J].河北中醫(yī)，2014,18(5)：749-755.

[17]崔維利,陳濤.山茱萸水提液防治骨質(zhì)疏松的藥效學(xué)研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2007,18(5)：1123-1124.

[18]XieYM,QinLL,ChenJB,etal.CoumarinsfromCnidiummon-nieri(L)andtheirproliferationstimulatingactivityonosteoblast-likeUMR106cells[J].Pharmazie,2004, 59(8):643-645.

[19]胡彬,吳翠環(huán),陳璐璐.蛇床子素對大鼠成骨細(xì)胞中OPG和RANKL基因mRNA表達的影響[J].中國骨質(zhì)疏松雜志,2004,10(4):415.

[20]QinLP,ZHangQY,TianYP,etal.TotalcoumarinsfromfruitsofCnidiummonnieriinhibitformationanddifferentiationofmultinu-cleatedosteoclastsofrats[J].ActaPharmacolSin,2003, 24(2):181.

[21]HayemG,CarbonC.Areappraisalofquinolonetolerability.Theexperienceoftheirmusculoskeletaladverseeffects[J].DrugSaf, 1995, 13(6)：338-342.

[22]李萍,王永銘.喹諾酮類藥物軟骨毒性評價[J].中國臨床藥學(xué)雜志,2004,13(2)：116-119.

[23]魏東,李振華,張乃生.氟喹諾酮類藥物的不良反應(yīng)[J].動物醫(yī)學(xué)進展,2006,27(7)：105-107.

[24]QinLP,ZHangQY,TianYP,etal.TotalcoumarinsfromfruitsofCnidiummonnieriinhibitformationanddifferentiationofmultinucleatedosteoclastsofrats[J].ActaPharmacolSin, 2003, 24(2)：181-186.

(編輯 陶 珠)

1001-6910(2015)02-0060-04

R

B

10.3969/j.issn.1001-6910.2015.02.29

潘海邦(1975-)，男(漢族)，甘肅康縣人，副教授，副主任醫(yī)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)及外科臨床研究。

張志明，主任醫(yī)師，zhangzhimingys@163.com

甘肅中醫(yī)學(xué)院中青年科研基金項目(09ZQ-19)

2014-07-24；

2014-12-04