魚藤酮誘導(dǎo)制備SD大鼠帕金森病模型的可行性

柴星星，鮑波，葉成，利慧華，朱少平，曾敏娟

(廣東醫(yī)學(xué)院，廣東湛江524000)

魚藤酮誘導(dǎo)制備SD大鼠帕金森病模型的可行性

柴星星，鮑波，葉成，利慧華，朱少平，曾敏娟

(廣東醫(yī)學(xué)院，廣東湛江524000)

目的 采用長(zhǎng)期低劑量皮下注射魚藤酮的方法制備SD大鼠帕金森病模型。方法 將36只SD大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組24只和對(duì)照組12只，實(shí)驗(yàn)組給予l.5 mg/(kg·d)魚藤酮皮下注射，對(duì)照組注射等體積葵花油，連續(xù)30 d，每周停藥1 d。給藥結(jié)束后進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試，并斷頭取腦，采用免疫組化SP法檢測(cè)中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元數(shù)目。結(jié)果 對(duì)照組行為學(xué)改變不明顯，其黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元數(shù)目較多；實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)明顯的行為學(xué)改變，其黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元數(shù)目減少，符合PD的診斷標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)論 頸背部皮下注射魚藤酮可成功制備SD大鼠帕金森病模型。

帕金森??；魚藤酮；大鼠；TH陽性細(xì)胞

帕金森病(PD)是一種以中腦黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元退行性變?yōu)橹饕±硖卣鞯穆陨窠?jīng)系統(tǒng)疾病。2012年8月，我們對(duì)SD大鼠長(zhǎng)期低劑量皮下注射魚藤酮，觀察其行為學(xué)變化、腦黑質(zhì)中酪氨酸羥化酶(TH)陽性細(xì)胞病理變化及細(xì)胞數(shù)量的改變，據(jù)此建立魚藤酮誘導(dǎo)的SD大鼠帕金森病模型，為臨床預(yù)防和治療PD奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF級(jí)健康成年雄性SD大鼠36只，體質(zhì)量180～200 g，由廣東醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。使用標(biāo)準(zhǔn)飼料飼養(yǎng)于溫度20～22 ℃、濕度45%～65%、光照12 h明暗交替環(huán)境中，自由攝食、攝水。魚藤酮(美國(guó)Sigma)，TH小鼠單克隆抗體(CST)，超敏型ABC免疫組化染色試劑盒(福州邁新)，DAB試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 模型制作 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)l周后，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組24只和對(duì)照組12只，參考文獻(xiàn)[1，2]方法建立PD模型。實(shí)驗(yàn)組于頸背部皮下注射魚藤酮葵花油乳化液1.5 mg/(kg·d)，魚藤酮在葵花油中的濃度為1.5 mg/mL；對(duì)照組注射等體積葵花油。每天上午8:00注射，注射前測(cè)量動(dòng)物體質(zhì)量，每周停藥1次，共30 d。由于魚藤酮具有全身毒性作用，因此給藥期內(nèi)動(dòng)物出現(xiàn)四肢不能站立行走、翻身困難、喪失主動(dòng)進(jìn)食能力時(shí)，立即終止注射，終止注射的大鼠在最后1次給藥1 d后對(duì)實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行篩選時(shí)根據(jù)終止注射的時(shí)間選擇納入或排除出后續(xù)研究和統(tǒng)計(jì)分析。最后1次給藥1 d后對(duì)實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行篩選，篩選模型制作成功的標(biāo)準(zhǔn)為：給藥3周以后才開始出現(xiàn)四肢不能站立行走、翻身困難、喪失主動(dòng)進(jìn)食能力[3]；拒捕行為減弱、豎毛、毛色變黃變臟、弓背，主動(dòng)活動(dòng)減少明顯、動(dòng)作遲緩，并有震顫，或有步態(tài)不穩(wěn)[4]。排除死亡和不符合上述要求的大鼠，實(shí)驗(yàn)組共12只進(jìn)入下一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 行為學(xué)測(cè)試 最后1次給藥1 d后對(duì)兩組分別進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試。

1.2.2.1 網(wǎng)格實(shí)驗(yàn)[5]用于檢測(cè)大鼠全身僵直情況。將大鼠頭朝上置于一個(gè)與水平面垂直的獨(dú)立金屬網(wǎng)格(長(zhǎng)80 cm、寬50 cm、格間距1 cm)的中央，使其趾爪均抓住金屬網(wǎng)格，并保證在此位置上大鼠無法抓住網(wǎng)格邊緣或其他附帶物，放置大鼠的同時(shí)用秒表記時(shí)，記錄大鼠由靜止?fàn)顟B(tài)至任意一爪移動(dòng)所間隔的時(shí)間，即為移動(dòng)潛伏期。每只大鼠重復(fù)測(cè)量3次，每次間隔5 min。

1.2.2.2 懸掛實(shí)驗(yàn) 用于檢測(cè)大鼠肌張力。將大鼠兩前爪懸掛于水平放置的金屬絲(直徑2 mm、長(zhǎng)約30 cm)上，金屬絲距地面1 m，記錄大鼠落地前的時(shí)間，如大鼠在3 s內(nèi)跌落或僅一個(gè)爪抓住金屬絲均屬失敗。對(duì)懸掛時(shí)間進(jìn)行評(píng)分，0～4 s為0分，5～9 s為1分，10～14 s為2分，15～19 s為3分，20～24 s為4分，25～29 s為5分，超過30 s為6分。每只大鼠重復(fù)測(cè)量3次，每次間隔5 min。

1.2.2.3 跨步實(shí)驗(yàn)[6]用于考察大鼠前肢運(yùn)動(dòng)功能。操作者一手固定大鼠軀體后半部和后肢使其離地，另一手固定一側(cè)前肢使另一前肢著地，以大鼠正手方向斜向一側(cè)移動(dòng)，5 s內(nèi)移動(dòng)90 cm，記錄大鼠移動(dòng)時(shí)著地側(cè)前肢跨步數(shù)，交替測(cè)量?jī)蓚?cè)上肢的跨步數(shù)，取兩側(cè)跨步數(shù)的總和為最終紀(jì)錄結(jié)果。

1.2.3 腦標(biāo)本的制作 行為學(xué)檢測(cè)完畢后對(duì)大鼠腹腔注射10%水合氯醛進(jìn)行麻醉，迅速斷頭取腦，于冰面上快速分離腦組織，冰生理鹽水漂洗，除去腦膜和血液。每組隨機(jī)取6只樣本于冰皿上剝離黑質(zhì)，4%多聚甲醛固定，脫水、透明、石蠟包埋，切片機(jī)連續(xù)做冠狀切片，其余腦組織分離獲取中腦后稱取質(zhì)量，-80 ℃保存待用。

1.2.4 TH陽性細(xì)胞檢測(cè) 采用免疫組化SP法，取石蠟切片，經(jīng)二甲苯及梯度乙醇脫蠟，加入3% H2O2，PBS浸洗，高壓抗原修復(fù)，滴加封閉血清室溫孵育10 min，依次加入一抗(CST，1∶300)、生物素標(biāo)記的二抗、辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵蛋白工作液孵育，PBS洗滌，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水透明，中性樹脂封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。先在100倍鏡下選擇TH陽性細(xì)胞(其細(xì)胞形態(tài)較完整，多為橢圓形和粒狀，胞質(zhì)內(nèi)棕色顆粒濃密，部分可見神經(jīng)突起及其分支)密集區(qū)，然后在400倍鏡下計(jì)數(shù)TH陽性神經(jīng)細(xì)胞個(gè)數(shù)，每個(gè)腦組織黑質(zhì)部位包塊選4張連續(xù)切片，計(jì)算平均值。

2 結(jié)果

2.1 一般癥狀觀察 對(duì)照組毛色光亮，活潑好動(dòng)，飲食如常，體質(zhì)量正常增長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)組給藥1周后體質(zhì)量明顯下降，自主活動(dòng)減少，抗捕捉反應(yīng)減少，而癥狀最嚴(yán)重最突出的時(shí)間段多為3～4周。部分大鼠由于行動(dòng)和攝食能力部分或完全性喪失，體質(zhì)量下降較快；毛色發(fā)黃變臟，動(dòng)作遲緩，弓背及抓握狀姿勢(shì)，四肢僵硬或癱瘓并伴有震顫等癥狀；少數(shù)大鼠出現(xiàn)口鼻黏膜及四肢末端皮下少量出血，間歇性抽搐和翻滾，甚至完全喪失行動(dòng)能力，停止注射魚藤酮后多數(shù)大鼠癥狀有所減輕，體質(zhì)量回升，少數(shù)大鼠停藥后癥狀持續(xù)加重，最終死亡。

2.2 魚藤酮對(duì)大鼠行為學(xué)的影響

2.2.1 兩組網(wǎng)格實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較 魚藤酮處理第30天時(shí)，實(shí)驗(yàn)組網(wǎng)格實(shí)驗(yàn)反應(yīng)時(shí)間為(4.32±0.72)s，對(duì)照組均<1 s，兩組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

2.2.2 兩組懸掛實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較 魚藤酮處理第30天時(shí)，觀察組懸掛實(shí)驗(yàn)評(píng)分為(1.42±1.08)分，對(duì)照組為(4.08±2.27)分，兩組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

2.2.3 兩組跨步實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較 魚藤酮處理第30天時(shí)，觀察組肢體運(yùn)動(dòng)功能明顯減退，跨步實(shí)驗(yàn)前肢跨步數(shù)為(17.50±3.58)步，對(duì)照組為(27.25±1.65)步。兩組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

2.3 兩組黑質(zhì)TH陽性神經(jīng)細(xì)胞數(shù)比較 免疫組化結(jié)果顯示，對(duì)照組黑質(zhì)TH陽性神經(jīng)細(xì)胞數(shù)為(115.75±15.06)個(gè)，實(shí)驗(yàn)組為(48.83±10.58)個(gè)，實(shí)驗(yàn)組TH陽性神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目顯著下降(P<0.05)。對(duì)照組中黑質(zhì)可見大量規(guī)則狀TH陽性細(xì)胞和神經(jīng)纖維，其細(xì)胞形態(tài)較完整，多為橢圓形和粒狀，胞質(zhì)內(nèi)棕色顆粒濃密，部分可見神經(jīng)突起及其分支，TH陽性細(xì)胞呈特異性條帶型分布。實(shí)驗(yàn)組黑質(zhì)TH陽性細(xì)胞神經(jīng)元數(shù)目明顯減少較多，且細(xì)胞染色變淺，著色不均，殘存的TH陽性神經(jīng)元呈現(xiàn)胞體腫脹、萎縮，神經(jīng)突起減少或消失的現(xiàn)象，大部分形態(tài)已明顯改變，呈三角形或不規(guī)則多邊形，并且細(xì)胞的輪廓不清晰,顯示神經(jīng)元進(jìn)行性退化特征，帶型模糊。

3 討論

建立合適的PD動(dòng)物模型是開展PD研究的重要內(nèi)容和工具[7]。目前已經(jīng)建立的PD動(dòng)物模型主要有利血平模型、6-OHDA模型、甲基苯丙胺模型、百枯草模型、代森錳模型、MPTP模型、魚藤酮模型、脂多糖模型[8]以及基因敲除與轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型[9]等。由于PD多巴胺黑質(zhì)神經(jīng)元選擇性丟失的確切機(jī)制尚不明確，其模型的建立也一直處于不斷改進(jìn)當(dāng)中。

魚藤酮是由醉魚科植物毛魚藤的膠狀液汁提取的化學(xué)物質(zhì)，具有很強(qiáng)的親脂性，能輕易透過血腦屏障進(jìn)入神經(jīng)細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，并選擇性聚集在線粒體等細(xì)胞器，抑制線粒體呼吸鏈復(fù)合體I活性，損害氧化磷酸化，進(jìn)而產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用。2000年，Betarbet等[5]首次使用魚藤酮成功誘導(dǎo)出PD大鼠模型。研究表明，魚藤酮誘導(dǎo)的PD模型在重現(xiàn)PD疾病行為學(xué)變化的同時(shí)，其病理學(xué)特征同人類PD疾病具有高度的相似性。此外，魚藤酮是一類廣泛分布于自然界的環(huán)境毒素，這與PD流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果相符。因此，魚藤酮誘導(dǎo)的PD模型在發(fā)病機(jī)制上可能更接近人類PD的自然進(jìn)程。但魚藤酮誘導(dǎo)的PD動(dòng)物模型存在死亡率高、成模率低、操作復(fù)雜、成本相對(duì)較高等缺點(diǎn)，已報(bào)道的PD動(dòng)物模型研究也多采用小鼠進(jìn)行。由于PD動(dòng)物模型的研究涉及黑質(zhì)紋狀體部位的給藥和取材，黑質(zhì)紋狀體體積較小，定位困難，相對(duì)小鼠而言，大鼠腦部尺寸較大，有利于腦部各區(qū)的立體定位，給藥和取材的精確性較高。因此本實(shí)驗(yàn)選用生命力強(qiáng)、抗感染能力好的SD大鼠進(jìn)行PD模型的制備。

采用魚藤酮制備帕金森病動(dòng)物模型的給藥方法主要有口服法、皮下注射法、腹腔注射法、微泵靜脈灌注射法和黑質(zhì)立體定向注射法等[10]。考慮到魚藤酮的全身毒性作用導(dǎo)致的死亡率較高，且小劑量魚藤酮的作用更能體現(xiàn)慢性疾病的致病過程,本實(shí)驗(yàn)中在給藥途徑上采用吸收較緩慢的長(zhǎng)期低劑量皮下注射魚藤酮的方法。實(shí)驗(yàn)中觀察到，皮下給藥1周后，魚藤酮給藥組即出現(xiàn)明顯的主動(dòng)攝食減少，體質(zhì)量逐漸減輕，部分大鼠由于行動(dòng)和攝食能力部分或完全性喪失，體質(zhì)量下降較快。同時(shí)可見大鼠毛色發(fā)黃變臟、動(dòng)作遲緩、弓背及抓握狀姿勢(shì)、四肢僵硬或癱瘓、并伴有震顫等癥狀。與文獻(xiàn)[1]報(bào)道相一致。此外，部分大鼠還出現(xiàn)口鼻黏膜及四肢末端皮下少量出血，或有間歇性抽搐和翻滾，甚至完全喪失行動(dòng)能力，這可能與SD大鼠個(gè)體間的差異性有關(guān)。

行為學(xué)測(cè)試表明，經(jīng)魚藤酮處理第30天魚藤酮處理組網(wǎng)格實(shí)驗(yàn)反應(yīng)時(shí)間明顯長(zhǎng)于對(duì)照組，表明魚藤酮處理組全身僵直癥狀嚴(yán)重；懸掛實(shí)驗(yàn)中，魚藤酮處理組評(píng)分降低，提示肌張力增高；跨步實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明魚藤酮處理組運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性下降明顯。根據(jù)上述行為學(xué)表現(xiàn)及癥狀等可以初步判斷PD模型復(fù)制成功，表明長(zhǎng)期頸背部皮下注射魚藤酮的方法復(fù)制PD模型是可行的。

本研究對(duì)多巴胺能神經(jīng)元TH陽性細(xì)胞進(jìn)行免疫組化檢測(cè)，結(jié)果顯示，對(duì)照組黑質(zhì)區(qū)可見大量規(guī)則狀TH陽性細(xì)胞和神經(jīng)纖維，TH陽性細(xì)胞數(shù)目為(115.75±15.06)個(gè)，其細(xì)胞形態(tài)較完整，多為橢圓形和粒狀，胞質(zhì)內(nèi)棕色顆粒濃密，部分可見神經(jīng)突起及其分支，TH陽性細(xì)胞在黑質(zhì)區(qū)呈特異性條帶形分布；魚藤酮處理組TH陽性細(xì)胞數(shù)目明顯減少，染色變淺，著色不均，殘存TH陽性神經(jīng)元呈現(xiàn)胞體腫脹、神經(jīng)突起減少或消失的現(xiàn)象。有研究表明，魚藤酮誘導(dǎo)PD模型的機(jī)理可能同魚藤酮具有極強(qiáng)的親脂性有關(guān)，魚藤酮在不依賴DA轉(zhuǎn)運(yùn)體的情況下自由通過血腦屏障和細(xì)胞膜并聚集在細(xì)胞器如線粒體內(nèi)，可選擇性抑制線粒體復(fù)合物Ⅰ的活性，產(chǎn)生活性氧和釋放凋亡誘導(dǎo)因子，引起氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡[11]。兩組無論是TH陽性細(xì)胞數(shù)量還是染色形態(tài)等都存在明顯差異，提示魚藤酮處理導(dǎo)致了相應(yīng)的病理改變，且與魚藤酮處理組顯現(xiàn)的PD行為學(xué)改變相一致。

綜上所述，綜合病理癥狀、行為學(xué)改變、TH陽性細(xì)胞數(shù)對(duì)建立的PD模型進(jìn)行評(píng)價(jià)，表明通過長(zhǎng)期低劑量皮下注射魚藤酮制作大鼠PD模型是成功的，可以較好地模擬PD的相關(guān)特征，在PD病理機(jī)制及藥物對(duì)PD的預(yù)防、治療研究中具有很好的應(yīng)用前景。

[1] 趙喜林,顧振綸,秦正紅.長(zhǎng)期低劑量皮下注射魚藤酮制作大鼠帕金森病模型[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2005,21(10):1274-1277.

[2] 李云鵬,董兆君,王仕麗,等.重復(fù)注射魚藤酮對(duì)中樞多巴胺神經(jīng)元的毒性作用[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2003,25(13):1123-1126.

[3] 馮媛.魚藤酮帕金森病模型中α-突觸核蛋白聚集機(jī)制研究[D].武漢:華中科技大學(xué),2007:1-96.

[4] 陳忻,張楠,趙暉,等.黃芩苷對(duì)魚藤酮致帕金森大鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)的保護(hù)作用[J].中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志,2008,25(2):174-177.

[5] Betarbet R, Sherer TB, MacKenzie G, et al. Chronic systemic pesticide exposure reproduces features of Parkinson's disease[J]. Nat Neurosci, 2000,3(12):1301-1306.

[6] Chang JW, Wachtel SR, Young D, et al. Biochemical and anatomical characterization of forepaw adjusting steps in rat models of Parkinson's disease: studies on medial forebrain bundle and striatal lesions[J]. Neuroscience, 1999,88(2):617-628.

[7] 姚慶和,張華,高國(guó)棟.帕金森病小鼠模型行為學(xué)檢測(cè)方法的比較研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào),2006,14(4):264-270.

[8] 馬寶倉,陳忻.魚藤酮帕金森病動(dòng)物模型及毒性機(jī)制研究進(jìn)展[J].中藥藥理與臨床,2013,29(1):164-169.

[9] Karpinar DP, Balija MB, Kügler S, et al. Pre-fibrillar alpha-synuclein variants with impaired beta-structure increase neurotoxicity in Parkinson’s disease models[J]. EMBO J, 2009,28(20) :3256-3268.

[10] 王蕾,蘇耀,熊中奎.魚藤酮誘導(dǎo)擬帕金森病鼠科動(dòng)物模型的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué),2013,(16):3087-3089.

[11] Li N, Ragheb K, Lawler G, et al. Mitochondrial complex I inhibitor rotenone induces apoptosis through enhancing mitochondrial reactive oxygen species production[J]. J Biol Chem, 2003,278(10):8516-8525.

Establishment of PD models in SD rats induced by rotenone

CHAIXing-xing，BAOBo，YECheng，LIHui-hua，ZHUShao-ping，ZENGMin-juan

(GuangdongMedicalCollege,Zhanjiang524000,China)

Objective To established PD models by long term subcutaneous injection of rotenone. Methods Totally 36 SD rats were randomly divided into two groups: control group contained 12 rats and model building group contained 24 rats. Rats in model building group were treated with rotenone at dose of 1.5 mg/(kg·d) by subcutaneous injection for 30 days, withdrawal one day a week. Rats in control group were treated with the same volume of sunflower oil. After the end of subcutaneous injection, the behavior changes of SD rats were tested and then sacrificing the rats to take out the brain tissues, detecting the expression of TH-positive cells in substantia nigra by counting out the number of TH-positive cells. Results The behavior changes of SD rats in control group were not obvious, but the number of dopaminergic neurons increased. The behavior changes of SD rats in model building group was obvious, and their dopaminergic neurons numbers decreased. SD rats in model building group met the diagnostic criteria of PD. Conclusions The methods of long-term subcutaneous injection of rotenone could establish PD models in SD rats.

Parkinson disease; rotenone; rats; TH-positive cells

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2010B060500015)；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013B060300038)。

柴星星(1985-)，男，碩士，研究方向?yàn)樯窠?jīng)系統(tǒng)疾病的病理和生理機(jī)制，E-mail: chaixingxingyu@163.com

鮑波(1968-)，男，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)樯窠?jīng)系統(tǒng)疾病的病理和生理機(jī)制。主持廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目2項(xiàng)，湛江市科技攻關(guān)課題1 項(xiàng)及廣東醫(yī)學(xué)院院級(jí)課題2項(xiàng)，作為主要參與人參與2項(xiàng)國(guó)家自然科學(xué)基金、3項(xiàng)省部級(jí)科學(xué)基金研究。E-mail:you_and_me_2008@yeah.net

10.3969/j.issn.1002-266X.2015.01.003

R742.5

A

1002-266X(2015)01-0009-04

2014-09-18)