植物多糖對斷奶仔豬腸道樹突狀細胞信號通路的調控

■李孟偉 陳清華

（湖南農業(yè)大學動物科學技術學院，湖南長沙 410128）

現(xiàn)代養(yǎng)豬業(yè)中仔豬生產是養(yǎng)豬生產的重要基礎和關鍵環(huán)節(jié)。研究和生產實踐證明，病原微生物、環(huán)境衛(wèi)生和斷奶應激等因素均可引起仔豬的機體免疫力下降、腸道結構異常與功能紊亂，導致消化不良、腹瀉、生長受阻，甚至死亡。傳統(tǒng)的抗生素等飼喂飼養(yǎng)技術雖然能在一定程度上維持仔豬健康、提高生長速度，但由于抗生素的大量使用，其負面效應也日益突出，長期使用抗生素導致細菌產生抗藥性、動物機體免疫力下降及動物產品中的藥物殘留，對人類健康具有潛在的危害性。在當前生產實踐中，迫切需要采取有效措施來改善仔豬的腸道發(fā)育狀況，維護和發(fā)揮腸道功能，提高仔豬的生長性能和健康水平。

植物多糖是從中草藥中提取、分離、純化的生物活性多糖，因具有重要的免疫學功能，在動物生產中作為畜禽免疫增強劑和代謝調控劑而受到廣泛關注(Brown G D，2001)。研究表明，多糖與樹突狀細胞（dendritic cell，DC）等免疫細胞表面模式識別受體(pattern recognition receptor，PRR)結合，刺激DC成熟，提高DC表面分子的表達，促進細胞因子的分泌，提高DC的抗原提呈能力，增強DC促淋巴細胞增殖的能力，調控DC免疫應答，從而增強機體的免疫功能。本文綜述了多糖激活DC的免疫調節(jié)作用及其信號通路，從細胞水平和分子水平闡明多糖免疫調節(jié)作用機制，為多糖的深入研究和應用開發(fā)提供參考。

1 樹突狀細胞

隨著研究的深入，人們對多糖的免疫調節(jié)作用機制的認識已達到分子受體的水平，多糖生物活性功能的發(fā)揮有賴于與細胞上相應受體的相互作用。研究表明，多糖與樹突狀細胞（dendritic cell，DC）等免疫細胞表面模式識別受體(pattern recognition receptor，PRR)結合啟動免疫應答，從而發(fā)揮其免疫調節(jié)作用。能識別多糖類的PRR有：Toll樣受體(TLR)、β-葡聚糖受體、CD14、清道夫受體(SR)、補體受體3(CR3)以及Dectin-1 等(Laechini等，2006；Gangloff等，2005；Yan 等，2000；Eberle等，2012)。研究表明，多糖通過和受體相互作用向巨噬細胞和樹突狀細胞傳遞信號，從而激活巨噬細胞和樹突狀細胞，其信號途徑主要涉及：絲裂原-活化蛋白激酶(MAPK)、蛋白激酶C(PKC)、Toll樣受體(TLRs)、異常環(huán)氧酶-2(COX-2)、活化因子蛋白-1(AP-1)、核因子κB(NF-κB)等。配體與PRR的結合可觸發(fā)NF-κB等介導的信號發(fā)生，引發(fā)胞內一系列信號級聯(lián)反應，導致轉錄激活和炎癥相關因子的產生，誘導相關免疫基因表達，激活免疫反應。

腸道是機體最大的免疫器官，腸黏膜被認為是執(zhí)行局部特異性免疫反應的重要場所，分布于其中的系列抗原提呈細胞（Antigen Presenting Cells，APC）在腸道免疫反應中發(fā)揮著極重要的作用。APC提取抗原，經加工后呈遞給T細胞，從而介導特異性免疫防御(Swiactzak等，2012)。DC是目前已知抗原提呈能力最強的專職APC，是適應性免疫的主要啟動者，負責對抗原的識別、加工處理與分類，將抗原信息提呈給T細胞，啟動抗原特異性T細胞應答。DC是CD4+T細胞介導的原發(fā)和繼發(fā)性免疫反應最強的激發(fā)者。DC攝取抗原后，通過接觸抗原而誘導DC的成熟(Pletinckx等，2011)。DC的成熟是增強免疫力的關鍵(Ballestrero等，2008)，隨著DC的成熟，高水平地表達主要組織相容性復合物抗原II（MHC-II），CD80、CD86等共刺激分子，DC細胞膜MHC-II-肽復合物逐漸增多，并將大量抗原物質呈遞給T細胞受體，誘導T細胞活化，啟動MHC-II類的CD4+T細胞反應(Drakes等，2004；Steinman等，2006；Hailong等，2011)。DC與T細胞結合后，通過自分泌或誘導其他細胞分泌大量IL-2、IL-12等細胞因子，啟動與CD4+T細胞相關的免疫應答。成熟DC還分泌趨化因子，趨化初始型T細胞聚集于抗原部位，增強對T細胞的活化能力。DC表面的PRR，如Toll樣受體(TLR)，識別病毒、細菌、寄生蟲等病原體的微生物相關分子模式，介導微生物與細胞之間的相互作用，是連接天然免疫與獲得性免疫的橋梁，在調控DC成熟過程中起到了重要作用。DC可通過TLR來識別抗原分子，如肽聚糖、脂多糖、脂磷壁酸等(Kaisho等，2001)，配體與TLR結合導致TLR的聚合而活化，激活信號通路分子，引起NF-κB、IRF-3等轉錄因子的活化從而釋放出大量效應分子發(fā)揮免疫調節(jié)作用(Fritz等，2007)，從而引起T細胞免疫應答(Han等，2009)。

目前也有部分關于其它多糖與DC表面TLR激活NF-κB等信號轉導途徑而發(fā)揮免疫調節(jié)作用的報道。Li等(2012)發(fā)現(xiàn)，甘草多糖可促進小鼠髓源DC表達CD80、CD86和MHC I-A/I-E等細胞表面分子，分泌IL-12 p70細胞因子。Meng等(2011)證實，靈芝多糖可促進小鼠髓源DC表面分子CD86、CD40和MHCII的表達與細胞因子IL-12的分泌。此外，研究還表明云芝多糖(Kanazawa等，2004)、黃芪多糖(Shao等，2006)、枸杞多糖(Zhu 等，2007)、蟲草多糖(Song等，2012)、桑黃多糖(Kim等，2004)等均能促進DC表達表面分子CD11c、CD80、CD86、MHC-I、MHC-Ⅱ，提高細胞因子IL-12分泌，進而增強DC與T細胞之間免疫信號的轉導，誘導DC的成熟進而發(fā)揮免疫增強作用。馮婷等(2010)研究結果表明，牛膝多糖(ABPS)能夠促進小鼠骨髓來源性DC的分化、成熟及表面標記CD86、CD1la的表達，提高DC的抗原遞呈能力。ABPS調節(jié)DC分化與成熟的相關因子和信號途徑研究成為闡釋其分子免疫機制的首要任務。

2 TLR4介導信號通路產生免疫應答

Toll樣受體（TLRs）是參與天然免疫的細胞跨膜受體及病原模式識別受體，是廣泛存在于昆蟲、脊椎動物和植物中的進化上高度保守而古老的蛋白質家族，通過啟動天然免疫反應和激發(fā)適應性免疫反應的信號傳導，在宿主防御微生物病原體感染過程中發(fā)揮重要的作用。TLRs可根據細胞內定位的不同被分為兩個亞家族，即位于細胞膜表面的TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6和TLR11及位于胞內膜成分的TLR3、TLR7、TLR8和TLR9(Kawai等，2008)。TLR4是最早鑒定的Toll樣受體，是介導先天免疫和炎癥反應的關鍵細胞膜受體，是革蘭氏陰性菌細胞壁內毒素主要成分脂多糖（LPS）向細胞內傳遞信號的主要受體(Kawai等，2010)，能識別特定微生物的保守分子成分，激活信號轉導途徑，誘導炎癥反應，與動物對疾病的抗應激性或易感性相關(Joan等，2012)。骨髓樣分化因子88（MyD88）是TLR4信號轉導通路中關鍵蛋白，是信號向下游轉導的關鍵靶分子。MyD88依賴性信號轉導途徑是TLRs信號傳導的共同通路(Roach等，2013)。機體受到刺激時TLR4激活MyD88，活化的MyD88可聚集并結合IL-1受體相關激酶（IRAKS），引起IRAKS-1磷酸化，使其從受體復合體上解離，作用于腫瘤壞死因子相關因子6（TRAF6），激活NF-κB和MAPK兩條通路啟動下游元件(Joh等，2012)，從而產生一系列的免疫應答。

2.1 TLR4/NF-κB信號傳導途徑

NF-κB是真核細胞中普遍存在的一種轉錄因子，在調節(jié)免疫應答、炎癥反應、細胞增殖、分化及凋亡等方面起關鍵作用。NF-κB的活化是DC成熟的標志之一，也是DC刺激T細胞活化的必要條件。NF-κB位于TLRs下游信號通路的樞紐位置，參與免疫反應及細胞增殖與分化等過程，當細胞受到應激刺激后，IκB激酶發(fā)生磷酸化，使p50/p65異二聚體表現(xiàn)出NF-κB活性而進入細胞核，啟動基因轉錄(Wu等，2009)。大多炎癥介質由NF-κB和激活蛋白-1（AP-1）介導(Chun等，2012)。AP-1由c-jun蛋白和c-fos蛋白家族成員組成，在應激因素刺激下使c-fos和c-jun激活，調控多種細胞因子、單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）、細胞間黏附分子（ICAM-1）、趨化因子CCL2等基因的表達，啟動基因轉錄的分子開關，從而參與應激、炎癥、腫瘤等多種病理過程(Lee等，2011)。TLR4受正負調控導致AP-1及NF-κB等轉錄因子活化，且NF-κB的產生可以負反饋調節(jié)TLR4的激活，介導白細胞介素、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、γ-干擾素(INF-γ)等炎性介質基因表達，觸發(fā)體內炎癥連鎖反應，引起全身炎癥反應綜合征和多器官功能障礙綜合征等疾病(Ben等，2012)。TLR4/NF-κB是機體炎癥和免疫反應調節(jié)的重要環(huán)節(jié)，抑制該信號傳導途徑對機體發(fā)揮免疫防御功能至關重要。研究表明，在DC的分化、成熟信號傳導通路中，NF-κB起著決定性作用，多種胞外刺激信號都能引起NF-κB的核轉位及其下游不同基因的活化，從而改變DC的分化方向及其免疫活性(Rescigno等，1998)。Guo等(2008)研究表明，ABPS能緩解免疫應激仔豬的生長性能和神經內分泌的改變，推測其機制可能與其抑制了NF-κB的激活進而抑制炎性介質的分泌有關，但ABPS作用機理和通過啟動哪些下游元件發(fā)揮作用需進一步證實和探索。

2.2 TLR4/MAPKs信號傳導途徑

MAPKs是存在于真核細胞的一組高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，包括細胞外信號控制激酶(ERK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)和p38。當受到多糖、促炎細胞因子等各種胞外刺激后，通過引發(fā)DC胞內兩個絲氨酸殘基磷酸化來激活MAPK，激活的MAPK轉位到細胞核，通過磷酸化蛋白質控制染色體結構，以及通過磷酸化轉錄因子（如活化因子蛋白-1，AP-1）來進行基因的轉錄(Schorey等，2003)。目前已發(fā)現(xiàn)在哺乳動物體內有五條并行的MAPKs信號通路，其中p38MAPK和JNK屬于“應激誘導”的MAPK，在炎癥與細胞凋亡等應激反應中發(fā)揮重要作用，也是TLR4的關鍵下游信號通路。P38MAPK信號轉導通路是信號由細胞表面轉導到細胞內部的重要傳遞者，主要參與細胞的基因轉錄、應激反應、炎癥反應和免疫調控，被認為是細胞信息傳遞的共同通路(Gao等，2010)。MKK3和MKK6是p38MAPK信號通路的兩個上游激活因子，當p38 MAPK信號通路活化受到抑制之后，抑制細胞增殖，減輕炎癥反應，降低損傷。JNK的上游激酶MKK4和MKK7通過雙磷酸化JNK的蘇氨酸和酪氨酸位點激活JNK，抑制JNK信號通路活化進而阻斷細胞因子及炎癥介質的合成、釋放或作用是治療炎癥性疾病的關鍵(Owen等，2013)。目前尋找p38MAPK和JNK信號通路活化的抑制劑成為開發(fā)新藥物的一個靶點。陳清華(2008)研究發(fā)現(xiàn)，ABPS可通過降低炎癥和氧化應激保護仔豬免受LPS激發(fā)的免疫反應損傷，ABPS對免疫反應的調控作用很有可能與該信號通路有密切關聯(lián)。

3 前景與展望

植物多糖因其具有免疫調節(jié)活性而成為動物生產上極具前景的替代抗生素的綠色飼料添加劑，具有無毒、不產生抗藥性的特點(陳清華等，2007；鄒云等，2014)。若能深入了解植物多糖對仔豬腸道健康、增強免疫力的作用機理、信號傳導途徑，則為解決仔豬腸道健康難題提供有效途徑。同時，能從分子水平深入揭示植物多糖調控免疫功能的機制，為植物多糖在動物生產、食品營養(yǎng)、醫(yī)學保健領域的推廣應用提供科學依據?？蔀橹参锒嗵巧飳W功能研究、仔豬腸道健康研究、植物多糖飼料添加劑的研制與應用提供理論依據和探索新的途徑，對畜牧業(yè)可持續(xù)性發(fā)展具有重要的理論和實踐意義。